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L’elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata

in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche.

Dott.ssa Angelucci C.B.

L’elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole


elettricamente cariche.

1. relativamente poco costosa


2. rapida
3. versatile

Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le


proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionizzabili e
possono esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come
cationi, sia come anioni.
Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono
assumere una carica se trasformati chimicamente oppure se sono strutturati
in polimeri complessi quali i glicosamminoglicani.
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L’elettroforesi viene condotta su un supporto inerte ed omogeneo (gel o
matrice), il campione viene sciolto in un opportuno tampone con il quale
viene saturato l’eventuale supporto in modo da consentire la conduzione della
corrente. Dott.ssa Angelucci C.B.

La matrice può essere composta da una varietà di differenti materiali,


inclusa la carta, l’acetato di cellulosa, o gel fatti di poliacrilammide e
agarosio.

Poliacrilammide: L'acrilammide è l'ammide dell'acido acrilico. A


temperatura ambiente si presenta come un solido cristallino incolore
o leggermente bianco, solubile in acqua con reazione fortemente
endotermica. La poliacrilammide è un derivato polimerico, che sotto
forma di gel trova applicazione come mezzo di risoluzione e
separazione delle proteine nell'elettroforesi e nella cromatografia.

Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)

tossico estremamente
tossico

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Agar: L’agar è una miscela, non tossica ricavato da alghe rosse, di due
polimeri derivati dal galattosio: l’agarosio e l’agaropectina.
Sottoforma di gel all’1% l’agar presenta un elevato contenuto d’acqua,
una buona struttura fibrosa, un diametro dei pori elevato ed una bassa
resistenza frizionale.

I gel di agarosio sono usati


soprattutto per la separazione
di acidi nucleici e frammenti di
DNA; in questo caso la
migrazione differenziale è
funzione semplicemente del
numero di basi di cui sono
composti gli acidi nucleici da
separare.
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Da considerazioni di carattere fisico, si risale alla seguente formula:

qxE
Ve =
6π x η x r

La velocità elettroforetica (Ve) è direttamente proporzionale alla


carica della particella (q) e al campo elettrico applicato (E=V/d) e
inversamente proporzionale alla viscosità (η) e alle dimensioni
della particella (r), quindi nel caso di particelle aventi la stessa
carica, migrerà più velocemente la particella di raggio minore.

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Elettroforesi su gel di poliacrilammide

Due Tipi:

• Elettroforesi Nativa: le proteine si muovono in funzione della loro


massa e della loro carica netta

• Elettroforesi Denaturante in presenza di SDS (SDS-PAGE): le


proteine, uniformemente dotate di carica negativa (SDS), si muovono in
base alla loro massa.

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SDS-PAGE

(Sodium-Dodecyl-Sulphate-Polyacrilamide-Gel-Electrophoresis)

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SDS-PAGE

E’ uno dei metodi più largamente usati per separare le proteine e


determinare il loro peso molecolare apparente.

Abbinata al Western Blot e all’Immunocolorazione costituisce


un metodo riproducibile, rapido ed efficace per l’isolamento e
l’identificazione delle proteine.

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(SDS-PAGE)

In condizioni denaturanti le proteine sono separate in un gel di


poliacrilammide in base alla loro massa molecolare (MM)

La miscela proteica è trattata con :

H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+
Sodio dodecil solfato (SDS)

detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti


delle proteine native

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Gli anioni dell’ SDS si legano alle catene principali in un rapporto di:

~ 1 molecola di SDS e 2 residui di amminoacidi

I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa

Sottoposte ad un campo elettrico le proteine migrano dal catodo- all’anodo+ in


base alla loro massa molecolare
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Fasi di una SDS-PAGE


1 - Montaggio dell’apparato;

2 - Preparazione del gel;

3 - Preparazione e caricamento dei campioni;

4 - Corsa elettroforetica;

5 - Colorazione;

6 - Studio dell’immagine ottenuta.


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1-Montaggio dell’apparato:

- Lastra di vetro grande;

- Lastra di vetro piccola;

- Spaziatori;

- Castello;

- Pettini;
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Porosità del gel

% T   Intervallo di frazionamento  
5-12   20.000 – 150.000  
10-15   10.000 – 80.000  
≥ 15   ≤ 15.000  

Generalmente al crescere di % T la dimensione dei pori decresce perché l’acrilammide


è più concentrata, mentre al disotto del 3% si perde l’effetto setacciante.

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La dimensione dei pori è funzione della quantità totale di monomeri
(% T) presenti nella soluzione e del rapporto tra l’agente cross-lincante
e l’acrilammide (% C).
Più spesso la composizione del gel viene data come rapporto in peso
acril:bis-acril (per es. 30:0,8).
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I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso facendo


copolimerizzare acrilamide con metilen-bisacrilammide, un agente cross-lincante, in
presenza di una catalizzatore come il persolfato di ammonio (APS) allo 0,1-0,3% e un
iniziatore come il TEMED. Questa polimerizzazione radicalica viene fatta avvenire
all’interno dello spazio compreso tra due vetri, in modo da ottenere una matrice piatta
con spessore che varia da 0,75 mm a 1,5 mm.
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N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine

Il TEMED catalizza la rottura omolitica dell’APS, producendo così


i radicali necessari per la reazione di polimerizzazione radicalica
dell’acrilammide.
Il TEMED va conservato al buio, a RT, e possibilmente, in
ambiente anidro. Questo perché il TEMED è igroscopico ed in
presenza di acqua si ossida perdendo le sue proprietà catalitiche. Il
TEMED ossidato si riconosce in quanto assume colorazione
giallastra.
Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)

Simboli di rischio chimico

infiammabile corrosivo Nocivo Dott.ssa Angelucci C.B.

Ammonio persolfato

L’APS è una molecola instabile, ed estremamente igroscopica.


Quando è sciolto in acqua si scompone spontaneamente, pertanto si
consiglia di preparare la soluzione appena prima dell’uso.
Generalmente, si prepara una soluzione madre al 10 % e la si
conserva a -20 °C.
APS e TEMED aggiunti in quantità eccessive, oltre ad alterare le
proprietà del gel, possono ossidare le proteine del campione.

Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)

Simboli di rischio chimico

estremamente Comburente Nocivo


tossico Dott.ssa Angelucci C.B.

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2-Preparazione del gel
- Preparazione del resolving gel o gel di risoluzione. La scelta della % di
acrilamide è in base alle dimensioni della proteina in esame);

- Preparazione dello stacking gel o gel di impaccamento (4-5%)

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Resolving gel al 12%


Componenti:
Volume 20 ml

H2O 6.6

30% acrilamide 8.0 Proteine  

1.5 M Tris/HCl (pH 8.8) 5.0


Maglie  di  acrilamide  
10% SDS 0.2

10% ammonio persolfato 0.2

TEMED 0.008

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Menisco di ossigeno
butanolo saturo di acqua
(10:1)

gel di separazione

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Preparazione dello Stacking al 5 %:

Componenti:

Volume 10 ml

H2O 6.8

30% acrilamide 1.7

1.0 M Tris/HCl (pH 6.8) 1.25

10% SDS 0.1

10% ammonio persolfato 0.1

TEMED 0.01

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Gel di impaccamento
Dopo circa 1 h dalla deposizione del gel di separazione, si stratifica
su di esso il gel di impaccamento (o stacking)

Pettine Il gel di impaccamento ha un pH di 6,8 e


un rapporto di acrilam/bis-acrilam pari al
4-5%
stacking gel

Appena deposto il gel di impaccamento.

separating gel si dispone il pettine per la formazione dei


pozzetti

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Quando i gel si sono solidificati si


rimuove il pettine, lasciando nello
stacking la serie di pozzetti pronti per
il caricamento dei campioni.

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3-Preparazione dei campioni

- Campione contenente l’Albumina:

- Sample buffer 5x
(Tris/HCl 0.3 M pH 6.8, 10% SDS, 0.05% Blu di Bromofenolo,
50% Glicerolo e 500 mM DTT)

- Riscaldare a 95° C per 5 minuti

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Preparazione dei campioni


SDS: Denatura le proteine e conferisce la stessa densità di carica
negativa

DTT (ditiotreitolo) e b-Mercaptoetanolo: Rompe eventuali ponti


disolfuro

Glicerolo: Aumenta la densità dei campioni depositandoli nel


pozzetto

Blu di bromofenolo: Visualizza i campioni e va a costituire il fronte


di migrazione

Bollitura (100°C per 2-3 minuti): Accelera la completa


denaturazione
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3-Caricamento dei campioni
Inserimento dei campioni tra le due lastre di vetro
mediante puntali monouso

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Il gel di poliacrilamide ha una capacità limitata e sovraccaricarlo con le proteine


può dare risultati di precipitazioni ed aggregazione, produzione di striature e
macchie. I risultati migliori si ottengono caricando, per ogni pozzetto, 10 µl di
proteina denaturata concentrata 2 mg /ml.

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4-Corsa elettroforetica
- connessione all’alimentatore di corrente;

- impostazione dei valori di voltaggio o amperaggio desiderato;

- avvio della corsa;

- arresto della corsa quando si vede che il fronte e’ giunto


alla fine del gel.

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4-Corsa elettroforetica

Stacking gel

8.8 8.8

8.8

Resolving gel
8.8

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5-Colorazione

1. Colorazione di proteine con coloranti che si legano con forza


ad esse.
Rosso Ponceau
Blue di Coomassie
Colorazione con Argento

Analisi
Dopo preventivo essiccamento (gel dryer system) le proteine colorate
su gel possono essere analizzate (PM, quantità) tramite densitometria
(scanner, digital camera, densitometro)
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Rosso Ponceau
La colorazione tramite rosso di ponceau è utilizzata per rilevare e colorare le proteine su
acetato di cellulosa, PVDF e membrane di nitrocellulosa. La procedura è reversibile e non
invasiva e permette ulteriori test di carattere immunologico sul campione. Il limite minimo
per l’identificazione è di 250 ng di proteina in gel di poliacrilamide. Il colorante è
fortemente elettronegativo e si lega ai gruppi amminici della proteina, oltre che alle
regioni non covalenti e non polarizzate.
Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle,
evidenziare l'area di lavoro le linee di corsa. Queste informazioni sono utili per tagliare la
membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie linee o verticalmente o
orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.

10 ml H2O distillata
0.3 ml acido aceticog laciale
0.033 g Ponceau S
Fino a 30 ml con H2O distillata
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Blue di Coomassie  
Il blue Coomassie si lega alle proteine attraverso legami ionici tra i gruppi sulfonici del
colorante e i gruppi amminici delle proteine oltre che attraverso forze di VanderWaals

Colorante-SO3-+NH3-L-COOH

Procedura di colorazione:

1. rimozione del gel dall’apparato di corsa e inserimento in una vaschetta pulita


2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio proteine al
gel e rimozione dell’SDS
3. immersione del gel nel colorante sciolto in acido acetico diluito e metanolo
da 5 min a 1 h
4. rimozione del colorante non legato alle proteine tramite immersione del gel
in acido acetico diluito e metanolo

NB Con questo metodo si possono quantificare le proteine sottoponendo il gel a


scansione con un densitometro
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Blue di Coomassie  

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Colorazione con l’argento

Procedura:
1. rimozione del gel dall’apparato di corsa e inserimento in una
vaschetta
2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio
proteine al gel e rimozione dell’SDS
3. Incubazione del gel con una soluzione acida di nitrato di Ag che
reagisce con le proteine
4. Incubazione con formaldeide a pH alcalino che riduce Ag+
ad Ag metallico che colora le proteine a cui si era precedentemente
legato
5. Arresto della reazione con acido acetico

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Colorazione con l’argento

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Essicamento del gel
Una volta “colorati” i gel devono essere essiccati per una buona e lunga conservazione

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6 - Studio dell’immagine ottenuta  


1 2 3 4 5 6
A
B

Standard (low range) MM

A- Fosforilasi B 97.400
B- BSA 66.200
C- Ovalbumina 45.000 1, 2, 3, 4, 5, 6 = campioni di albumina
D- Anidrasi carbonica 31.000
E- Inibitore della tripsina 21.500
F- Lisozima 14.400

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Determinazione della massa molecolare
di catene polipeptidiche
Mobilità relativa di ciascuna proteina
5

Standard
4,8 Campione

4,6
Log PM
Log PM

4,4

4,2
y = 5,0635 - 0,19269x R= 0,99031

4
0 1 2 3 4 5
Mobilità relativa
Mobiltà relativa
Standard e Campione
Standard in nero, campione in blu
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Principali impieghi di una SDS-PAGE

Controllo di omogeneità (purificazione di una proteina)

Caratterizzazione (determinazione del peso molecolare)

Proteomica (analisi dell’insieme di proteine di una cellula)

Analisi con anticorpi (Western Blotting)

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5-Colorazione
- Coomassie Brilliant Blue R-250

- Nitrato di argento (10 a 100 volte piu’ sensibile della colorazione con
Coomassie Brilliant Blue R-250)

- Metodi immunochimici previo trasferimento su membrana.

Ab anti lectina Ab anti lox-1


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