SPETTROFOTOMETRIA

Obiettivo: Determinazione della pKa di un indicatore acido-base

La spettrofotometria è una tecnica di analisi che si basa sullo studio delle transizioni elettroniche di un
campione. Le transizioni elettroniche richiedono in generale l’irraggiamento del campione con radiazione
elettromagnetica a lunghezze d’onda nel range del visibile (400-700 nm) o del vicino ultravioletto (200-400
nm). Quando una radiazione di lunghezza d’onda appropriata viene fatta passare attraverso il campione,
essa viene assorbita dallo stesso, e l’intensità della radiazione in uscita dal campione (I) sarà minore di
quella in entrata (I0). Il rapporto tra le due intensità è detto trasmittanza T = I/I0. Un grafico della
trasmittanza di un campione in funzione della lunghezza d’onda della radiazione incidente è detto spettro di
trasmittanza. Nella spettrofotometria UV-Visibile è più comune l’impiego dell’assorbanza A = – log T, e si
parla di spettri di assorbimento.

Sperimentalmente, la registrazione degli spettri è ottenuta usando uno spettrofotometro. Questo

strumento è dotato di una lampada che genera la radiazione, un monocromatore per selezionare la
lunghezza d’onda ed una cuvetta in cui è contenuto il campione. La misura dell’intensità della radiazione
incidente I0 può essere eseguita prima dell’analisi del campione (strumenti a raggio singolo) o
contemporaneamente ad essa, facendo passare la radiazione attraverso una soluzione di riferimento che
non contenga l’analita (strumenti a doppio raggio).

Schema di uno spettrofotometro a raggio singolo

Schema di uno spettrofotometro a doppio raggio

La spettrofotometria è una delle tecniche strumentali più impiegate in assoluto, sia in ambito di ricerca che
come tecnica di analisi. Presenta i vantaggi di elevata robustezza, ottima riproducibilità, facilità di impiego e
grande flessibilità. Le applicazioni della spettrofotometria vanno dall’analisi qualitativa (lo spettro di
assorbimento è caratteristico di ogni molecola) a quella quantitativa. L’analisi quantitativa è possibile grazie
all’applicazione della legge di Lambert-Beer:

A=ε l c

dove l è il cammino ottico percorso dalla radiazione all’interno della soluzione (in cm), c è la concentrazione
molare della specie assorbente, ed ε una costante detta coefficiente di estinzione, che dipende dalla
specifica lunghezza d’onda e dalla specie in esame. Benché la legge di Lambert-Beer sia valida a tutte le
lunghezze d’onda dello spettro, è sempre meglio, quando possibile, utilizzare l’assorbanza in
corrispondenza del massimo di assorbimento, ovvero nel punto in cui lo spettro presenta un picco. Questo
perché le misure di assorbanza in corrispondenza del massimo hanno una maggiore sensibilità, e sono
meno influenzate da eventuali shift dello spettro.

La legge di Lambert-Beer è additiva: quando in soluzione sono presenti più specie in grado di assorbire la
radiazione, l’assorbanza registrata ad ogni lunghezza d’onda sarà la somma delle assorbanze delle singole
specie. Questa proprietà consente di applicare la spettrofotometria allo studio di miscele di composti,
misurando l’assorbanza a più di una lunghezza d’onda. Una interessante applicazione di questo è lo studio
di equilibri, come ad esempio l’equilibrio di dissociazione di un acido debole.

K a =¿ ¿
+ ¿¿
O
HA + H 2 O⇄ A−¿+H 3 ¿

Se entrambe le forme dell’acido sono in grado di assorbire la radiazione, le loro concentrazioni possono
essere determinate misurando l’assorbanza a due lunghezze d’onda diverse, e poi impostando un sistema
due equazioni – due incognite come quello mostrato di seguito. La risoluzione di questo sistema richiede di
aver preventivamente misurato i quattro coefficienti di estinzione. Questo può essere fatto facilmente,
mediante l’analisi di soluzioni che contengano solo una delle due forme a concentrazione nota.

A ( λ 1 )=ε HA , λ1 l c HA +ε A , λ1 lc A
A ( λ 2 )=ε HA , λ2 l c HA +ε A , λ2 l c A

Se la concentrazione delle due forme varia, ma quella totale rimane costante, tutti gli spettri di
assorbimento presentano almeno un punto in comune. Tale punto è detto isosbestico, ed in tale punto i
coefficienti di estinzione delle due forme dell’acido sono uguali. L’individuazione di un punto isosbestico
nello studio spettrofotometrico di un equilibrio è indice del fatto che nell’instaurazione dell’equilibrio
stesso non si forma nessun intermedio stabile. Quando il meccanismo alla base dell’equilibrio è più
complesso, invece, non si individua il punto isosbestico.

In questa esperienza verrà determinata la costante di dissociazione acida di un indicatore acido-base, il

rosso di metile. Questo indicatore è colorato di rosso nella forma protonata, e di giallo nella forma
deprotonata. Verranno registrate le assorbanze di soluzioni a pH noto, e tramite la legge di Lambert-Beer
verranno calcolati prima i coefficienti di estinzione, e poi le concentrazioni di entrambe le forme. Una volta
note le concentrazioni ed il pH, il calcolo della Ka può essere direttamente eseguito dalla definizione della
stessa.

Rosso di metile
Forma protonata Forma deprotonata
PM = 269.3 g/mol
 In laboratorio

STRUMENTAZIONE
 Spettrofotometro UV-Vis a doppio raggio
 pH-metro
 Cuvette con cammino ottico di 1 cm
 1 matraccio da 100 mL
 8 matracci da 50 mL
 Burette

REAGENTI
 Tamponi universali per calibrazione del pH-metro
 HCl 0.1 M
 NaOH 0.1 M
 CH3COOH 0.02 M
 CH3COONa 0.04 M
 Etanolo
 Soluzione madre di rosso di metile (0.07 g in 1 L di miscela 1:1 acqua:etanolo)

PROCEDIMENTO
1) Preparare una soluzione figlia di rosso di metile in matraccio da 100 mL, prelevando con buretta 40 mL
della soluzione madre e portando a volume con una miscela 1:1 di acqua ed etanolo. Calcolare la
molarità della soluzione madre e della figlia ottenuta.
2) A partire dalla soluzione figlia, preparare 8 soluzioni nei matracci da 50 mL, aggiungendo le quantità di
acido e/o base secondo quanto indicato nella tabella seguente (tutti i volumi indicati sono in mL). I
volumi devono essere prelevati con una buretta. Portare a volume ogni matraccio con la miscela di
acqua ed etanolo. Determinare la concentrazione dell’indicatore in ogni matraccio.

Matracci Sol. figlia HCl 0.1 M CH3COOH 0.02 M CH3COONa 0.04 M NaOH 0.1 M
o
1 5.0 12.5 - - -
2 5.0 - 25.0 12.5 -
3 5.0 - 15.0 12.5 -
4 5.0 - 10.0 12.5 -
5 5.0 - 6.0 12.5 -
6 5.0 - 4.0 12.5 -
7 5.0 - 2.5 12.5 -
8 5.0 - - - 12.5

3) Calibrare il pH-metro con i tamponi universali a pH 4 e 7.

4) Determinare i pH delle soluzioni contenute nei matracci.
5) Registrare uno spettro della linea di base allo spettrofotometro.
6) Lavorando in modalità spettro, registrare uno spettro di assorbimento completo delle soluzioni nei
matracci 1, 3, 5, 7 ed 8. Determinare le lunghezze d’onda di massimo assorbimento per le due forme
dell’indicatore, e la lunghezza d’onda del punto isosbestico.
7) Lavorando in modalità lunghezza d’onda singola, registrare l’assorbanza di tutte le soluzioni nei
matracci ad entrambe le lunghezze d’onda di massimo assorbimento.
 Risultati

Concentrazione sol. madre (M)

Concentrazione sol. figlia (M)
Concentrazione matracci (M)
λ max Abs forma protonata (λ1)
λ max Abs forma deprotonata (λ2)
λ punto isosbestico

Matraccio pH teorico pH misurato Abs λ1 Abs λ2

1
2
3
4
5
6
7
8

Specie ε(λ1) ε(λ2)

HA
A-

Calcolo della pKa del rosso di metile:

pKa del rosso di metile