DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI UNA MISCELA DI FLUOROFORI MEDIANTE MISURE DI FLUORESCENZA

Obbiettivo

L’esperienza è stata fatta allo scopo di determinare la composizione di una miscela di fluorofori quali
naftalene, 2,6-dimetossinaftalene e antracene (le cui strutture sono rappresentate in basso), mediante
misure di fluorescenza.

Cenni teorici

La spettroscopia di emissione di fluorescenza è una tecnica analitica ad elevata sensibilità, una riduzione del
range di risposta lineare può dipendere dall’assorbimento della radiazione di emissione o di eccitazione
dovuto a specie diverse dall’analita. Allo scopo di ampliare il range lineare è possibile sottoporre le intensità
di emissione osservate ad un opportuno trattamento matematico. In generale, la riduzione del range lineare
dipende da due fattori:

 Un fattore matematico che afferisce alla perdita di correlazione lineare tra emissione di
fluorescenza e assorbanza (e quindi concentrazione) nel campo di elevati valori di quest’ultima.
 Un fattore geometrico (valido per una geometria con configurazione ortogonale tra sorgente di
eccitazione e rivelatore) che afferisce al fatto che nel momento in cui la radiazione di eccitazione
permea all’interno della soluzione di interesse analitico se l’assorbimento da parte della soluzione
nei confronti della lunghezza d’onda di eccitazione è alto allora la maggior parte della radiazione di
eccitazione verrà assorbita dagli strati più laterali della soluzione e sarà da questi ultimi che si
originerà l’emissione di radiazione la cui massima parte non sarà sottoposta al processo di
rivelazione.

A ( λ ex )
Per correggere questi due fattori di definisce una funzione correttiva P= e un fattore legato
F g ( A ( λ ex ) )
all’effetto di filtro interno strettamente connesso all’assorbimento della radiazione emessa per fluorescenza

da parte della soluzione.

La funzione F g ¿) è una funzione di correzione polinomiale di terzo grado che correla l’intensità di emissione
osservata ad una data lunghezza d’onda con l’assorbanza alla lunghezza d’onda di eccitazione impiegata,
mentre A( λex ) è l’assorbanza lunghezza d’onda di eccitazione, λ ex.

L’effetto di filtro interno potrebbe essere ridotto scegliendo una lunghezza d’onda di emissione ( λ em ¿ che
cada in una regione dello spettro di assorbimento della soluzione ad assorbanza trascurabile, oppure,
correggendo le intensità osservate per la trasmittanza associata alla λ em prescelta, T (λ em) , definita come:

T ( λem ) =10−A ( λ
em )∗b

Dove b è il cammino ottico medio percorso dalla radiazione di emissione all’interno della cuvetta prima di
emergere da quest’ultima. Per una cuvetta a sezione quadrata con lati di un centimetro si avrà che b=0.5
cm.

Ne deriva una correzione delle intensità osservate tale che:

 I obs∗A ( λ ex )
∗1
F g ( A ( λex ) )
I corr =
T ( λem )

Una volta determinate le intensità di emissione corrette sarà possibile per ciascuna specie luminescente
presente nella miscela a composizione incognita determinare la concentrazione sfruttando la relazione:

I STD ,corr C STD

=
I camp , corr C x

Dove I STD, corr e I camp ,corr sono le intensità di emissione corrette dello standard (soluzione contenente il solo
analita a concentrazione nota) e del campione rispettivamente, C STD e C x sono le concentrazioni associate.

Materiali e strumenti

 Spettrofotometro
 Cuvette
 Matracci da 10 mL
 Spettrofluorimetro
 Solfato di chinina 10-3M
 Soluzione di H2SO4 0.5M
 Soluzioni standard di naftalene (5*10-5), antracene (5*10-5) e 2,6-dimetossinaftalene(2.5*10-5)

Procedura

1. Determinazione della funzione di correzione F g

Come standard per la determinazione della funzione F g è stato usato il solfato di chinina.

Sono state preparate 10 soluzioni a diversa concentrazione (da 10 -5 a 10-4 M) di solfato di chinina a partire
da una soluzione madre 10-3 M in H2SO4 0.5 M mediante utilizzo di matracci da 10 mL

Dopo aver registrato la linea di base tra 230 e 500 nm è stato registrato lo spettro di assorbimento della
soluzione 10-4 M allo scopo di determinare la lunghezza d’onda di massimo assorbimento, λ ex, usata per il
successivo ottenimento degli spettri di emissione. È risultato che:

λ ex =347 nm

Nota la λ ex è stato registrato lo spettro di emissione della medesima soluzione, questo allo scopo di
determinare la lunghezza d’onda di massima emissione λ em.

Il valore di λ em (sotto riportato) è stato determinato applicando delle slit del tipo:

Slit ex =2.5

Slit em =5

λ em=458 nm

La determinazione della A( λex ) e della I (λ em) è stata eseguita su ciascuna delle altre 9 soluzioni preparate,
i dati sperimentali sono raggruppati in tabella 1.

Soluzion Concentrazione di solfato di chinina (M) A( λex ) I (λ em)

e
 1 10^-5 0,04 179
2 2*10^-5 0,083 311,386
3 3*10^-5 0,129 420,419
4 4*10^-5 0,190 548
5 5*10^-5 0,224 643,8
6 6*10^-5 0,257 689,778
7 7*10^-5 0,290 736,14
8 8*10^-5 0,306 781,16
9 9*10^-5 0,399 862,5
10 10^-4 0,437 914,8
Tabella 1. Valori di concentrazione, A( λex ), I (λ¿¿ em)¿ per le soluzioni dalla 1 alla 10.

Successivamente è stata determinata la funzione di correzione F gapplicando un fitting polinomiale di terzo

grado ai dati di assorbanza ed emissione delle 10 soluzioni.

Immagine 1. Rappresentazione grafica del fitting polinomiale di terzo grado dei valori di I ¿ ) = f ( A ( λ ex )).

2. Determinazione dei valori di I obs, A( λex ), T ( λem )

Determinata la funzione di correzione si è proceduti alla preparazione delle soluzioni standard di naftalene,
2,6-dimetossinaftalene ed antracene a partire dalle corrispondenti soluzioni madre in matracci da 10 ml.

I dati di diluizione sono riportati nella tabella 2.

Standard Concentrazione soluzione standard Volume prelevato Concentrazione soluzione

madre (M) (mL) standard finale (M)
2,6-dimetossi 5 * 10-3 0.04 2*10-5
naftalene
Naftalene 5 * 10-3 0.1 5*10-5

Antracene 2.5 * 10-5 1 2.5*10-6

Tabella 2. Dati per la preparazione delle soluzioni standard degli analiti ai fini della determinazione di I obs, A( λex ), T ( λem ) .
Per le soluzioni standard finali sono stati registrati gli spettri di assorbimento allo scopo di valutare, per ogni
analita, la lunghezza d’onda di eccitazione alla quale le altre specie luminescenti presentassero minimo
assorbimento. Tale determinazione è stata fatta analizzando la risultante della sovrapposizione degli spettri
di assorbimento di ciascuna soluzione standard preparata.
 Antracene
0,4
2,6-dimetossi naftalene
Naftalene
Assorbanza

0,2

0,0
300 350 400
λ(nm)
Immagine 2. Sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle soluzioni standard di naftalene, 2,6-dimetossi naftalene e antracene.

I valori di λ ex e assorbanze associate per le tre soluzioni standard sono riportate in tabella 3.

Standard λ ex (nm) A( λex )

2,6-dimetossi 331.4 0.032
naftalene
Naftalene 283.8 0.345

Antracene 376 0.016

Tabella 3. Dati riferiti alla lunghezza d’onda di eccitazione ottimale per 2,6-dimetossinaftalene, naftalene e antracene con valori di assorbanza
associati.

Successivamente per ciascuno standard sono stati registrati gli spettri di emissione alla lunghezza d’onda di
eccitazione determinata applicando diverse larghezze delle slit per la radiazione di eccitazione ed emissione.
Per ogni analita è stata valutata la lunghezza d’onda di massima emissione ( λ em), l’assorbanza associata e
l’intensità di emissione osservata (I obs ) alla λ em.

Standard λ em (nm) A( λem ) I obs (u . a .) I obs (u . a .) I obs (u . a .) I obs (u . a .)

slit 5-5 slit 5-10 slit 2.5-5 slit 2.5-2.5
2,6-dimetossinaftalene 367 0 746 Fuori scala 136 22.77
 Naftalene 322 0.050 216.5 712.5 40.60 6.74
Antracene 398 0 256.3 760.6 52.3 9.80
Tabella 4. Dati di di assorbanza ed emissione alla λ em riferiti agli spettri di emissione delle tre soluzioni standard.

In base ai valori di A( λem ) sono stati determinati i corrispondenti valori di trasmittanza, T ( λem ) .

Standard T ( λem )
2,6- 1
dimetossinaftalene
Naftalene 0.944
Antracene 1
Tabella 5. Valori di trasmittanza associati alla lunghezza d’onda di massima emissione per le soluzioni dei tre standard.

3. Determinazione quantitativa della miscela a composizione incognita.

Nell’ultima fase della proceduta sperimentale è stato registrato lo spettro di assorbimento della soluzione a
composizione incognita.

0,20

0,15
Abs

0,10

0,05

0,00
300 350 400 450
λ (nm)
Immagine 3. Spettro di assorbimento della soluzione a composizione incognita.

Dall’analisi spettrale sono stati determinati i valori di assorbanza alle coppie di valori (λ ¿ ¿ em , λ ex )¿ per
ogni analita.
 λ ex (nm) A ( λ ex ) λ em (nm) A ( λ em ) T ( λem )
2,6-dimetossi 331.4 0.032 367 0 1
naftalene
Naftalene 283.8 0.073 322 0.013 0.985
Antracene 376 0.001 398 0 1
Tabella 6. Valori di assorbanza A( λ¿¿ ex )¿ , A( λ¿¿ em)¿ con trasmittanza associata per i tre analiti determinati per analisi dello spettro
di assorbimento della miscela incognita usando le coppie di valori (λ ¿ ¿ em , λ ex )¿ determinate nelle fasi precedenti per ciascun analita.

Infine, dall’ottenimento degli spettri di emissione alla lunghezza d’onda di eccitazione ottimale per ciascuno
dei tre analiti sono state determinate le intensità di emissione I obs alle λ em ad essi associata utilizzando i
valori di slit più opportuni.

λ ex (nm) λ em (nm) I obs (u . a) Slit

2,6-dimetossi 331.4 367 676 5-5
naftalene
Naftalene 283.8 322 228 5-10
Antracene 376 398 40.5 5-10
Tabella 7. Dati di lunghezze d’onda di eccitazione (λ ex ) usati per l’acquisizione degli spettri di emissione della miscela incognita accompagnati da
intensità di osservate alle lunghezze d’onda di massima emissione per ciascun analita ( λ em ¿.

Elaborazione dati

Come primo passo si è applicato la teoria della propagazione dell’errore all’equazione per il calcolo
dell’intensità di emissione corrette, tale per cui:

I obs∗A ( λ ex )
∗1
F g ( A ( λex ) )
I corr =
T ( λem )

Imponendo la condizione per cui le uniche grandezze affette da incertezza siano i coefficienti della funzione
polinomiale F g è stato calcolato l’errore d ¿ ¿ ) come sotto riportato.

| |
−I obs∗A ( λ ex )
2
∗1
F g ( A ( λ ex ) )
d (I ¿¿ corr)= d (F g)¿
T ( λ em )

Dove a sua volta l’incertezza d (F g ) è stata calcolata applicando la teoria della propagazione dell’errore note
le incertezze sui coefficienti caratterizzanti il polinomio di terzo grado.

In tabella 8 sono riportati i valori di I corr(calcolati considerando I obs per valori di slit compatibili con quelli
utilizzati per l’analisi del campione incognito), d (I ¿¿ corr )¿, F g, d (F g ) associati agli standard.

Slit I obs I corr d (I ¿¿ corr)¿ Fg d (F g )

Naftalene 5-10 712.5 0.318012 0,115178649 818,8204152 314,1559871
2,6- 5-5 746 0.152132 0,028376794 156,9160946 27,63003873
dimetossi
naftalene
antracene 5-10 760.6 0.113309 0,026176593 107,4022382 24,80231461
Tabella 8. Valori di I corr , d (I ¿¿ corr )¿ , (F g ), d (F g ) per gli standard di naftalene, 2,6-dimetossi naftalene e antracene.

Sulla base dei dati riportati in tabella 8 sono stati determinati i seguenti intervalli di fiducia:

I corr ( naftalene , STD )=( 0.32 ± 0.12 ) u . a .

−2
I corr ( 2, 6−dimetossi naftalene , STD )=( 15 ± 3 )∗10 u . a .
−2
I corr ( antracene , STD ) =( 11±3 )∗10 u . a .
Una trattazione analoga è stata fatta per i dati sperimentali afferenti alla miscela incognita.

Slit I obs I corr d (I ¿¿ corr)¿ F g d (F g )

Naftalene 5- 228 0,0610 0,00908 276,6354086 41,12351732
10 8
2,6-dimetossi 5-5 676 0,1378 0,02427 156,9160946 27,63003873
naftalene 6
antracene 5- 40.5 0,0006 0,00027 59,5478632 23,81321619
10 8
Tabella 9. Valori di I corr , d (I ¿¿ corr )¿, (F g ), d (F g ) per naftalene, 2,6-dimetossi naftalene e antracene contenuti nella miscela a
composizione incognita.

Sono stati di conseguenza determinati gli intervalli di fiducia sotto riportati.

−3
I corr ( naftalene , )=( 61 ± 9 )∗10 u . a .
−2
I corr ( 2, 6−dimetossi naftalene )=( 14 ± 2 )∗10 u . a .
−4
I corr ( antracene ) =( 7 ±3 )∗10 u . a .
Nota la relazione:

Cx I corr
= (¿)
C STD I corr , STD
È stato possibile determinare la concentrazione di ciascun analita presente nella miscela a composizione
incognita sfruttando i dati in tabella 10.

I corr (u . a .) I corr , STD (u . a .) C STD (M )

Naftalene 0,061082 0,318012 5*10^-5
2,6-dimetossi 2*10^-5
Naftalene 0,137857 0,152132
Antracene 0,00068 0,113309 2.5*10^-6
Tabella 10. Dati utili al calcolo finale delle concentrazioni.

Applicando la teoria della propagazione dell’errore sull’equazione ( ¿ ) è stata determinata l’incertezza sulla
concentrazione degli analiti nella miscela incognita e quindi gli intervalli di fiducia.

√( ) ( )
2 2
C STD 2 C STD 2
d (C ¿¿ x)= d (I ¿¿ corr) + 2
I corr , C d (I corr , STD ) ¿ ¿
I corr , STD I corr , STD
x

Cx d (C ¿¿ x)¿
Naftalene 9,60374E-06 3,7599E-06
2,6-dimetossi 1,81233E-05 4,6488E-06
 Naftalene
Antracene 1,5006E-08 6,9303E-09
Tabella 11. Valori di concentrazione per gli analiti nel campione a composizione incognita con incertezze associate.

−6
C x ( naftalene )=( 10 ± 4 )∗10 u . a .
−6
C x ( 2, 6−dimetossi naftalene )=( 18 ± 5 )∗10 u . a .
−9
C x ( antracene ) =( 1.5 ±0.7 )∗10 u . a .

Conclusioni

L’analisi spettrofluorimetrica ha consentito di caratterizzare quantitativamente la miscela multi-componente

oggetto di studio. Le correzioni applicate per l’eventuale assorbimento a carico della radiazione di
eccitazione ed emissione e per l’effetto di filtro interno hanno consentito di estendere il range lineare della
tecnica analitica.