La Determinazione

della
concentrazione
di enzima attivo: il
caso della tripsina
Lab Biologia II
Biochimica – Angeletti

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Perchè
determinare la
conc. di un enzima
• Molti sono I processi industriali che
utilizzano enzimi (agroalimentare, tessile,
concia pellami, biomedicals, ecc.).
• Durante il processo, c’è la necessità di
controllare la concentrazione di enzima
aggiunto, e se l’attività enzimatica è mantenuta
sotto le condizioni (temp, pH, ecc.) del
processo.

• Ad esempio, dal 1950, ai detersivi vengono

aggiunti enzimi per ridurre tempi e
temperature di lavaggio. Durante le fasi di
produzione del detersivo si vuole sempre
conoscere la concentrazione di enzima attivo
aggiunto.

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Come possiamo utilizzare i saggi enzimatici per
determinare quanto* enzima è presente?
Ricordiamo l’eq. di Michaelis-Menten,
Vmax [S] kcat Et [S]
. V0 = ------------ = ------------
Km + [S] Km + [S]
se [S] è saturante, cioè se:
[S] >>> Km , allora Km sarà trascurabile
nella somma con [S], e Vo diventa kcat Et [S] kcat Et [S]
direttamente proporzionale alla . V0 = ------------ = ------------ = kcat Et
concentrazione di enzima attivo Et Km + [S] [S]

Vo
* In questo modo determiniamo la
concentrazione di enzima ATTIVO

[E]
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Saggi enzimatici: aumento della
concentrazione di prodotto [P] nel tempo
Quindi se misuriamo l’aumento di prodotto nel tempo, se [S] è saturante:

[E] = 2x

[P]
[E] = 1x

Tempo

Avremo un aumento lineare (velocita’ costante) il cui coefficiente angolare (la velocità della
reazione Vo) e’ funzione della concentrazione di enzima.

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 Determinazione [tripsina]:
note generali
Utilizziamo un substrato sintetico (BAPNA) che viene idrolizzato dalla tripsina
(Nα-Benzoyl-DL-Arginine-p-Nitroanilide (BAPNA))
formando un prodotto (p-nitroanilina) che assorbe nel visibile (COLORE GIALLO):
Nα-Benzoyl-DL-Arginine-p-Nitroanilide Trypsin > Nα-Benzoyl-DL-Arginina + p-nitroanilina

Il ns. obiettivo è determinare [P], ma ricordiamo che dalla legge di Lambert-Beer, (LB)
l’assorbanza e la concentrazione sono correlati, e quindi possiamo misurare
l’assorbanza (AbsP) del prodotto, perché: AbsP = k [P] (legge di LB)
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 Determinazione [tripsina]: PROTOCOLLO
Determinazione retta di taratura nel range 0.015-0.06 mg e misura del campione incognito X:
1. Utilizzando tre cuvette, aggiungere tampone nei volumi indicati (tabella colonna C):
Tampone A= 50 mM Tris-HCl, 20 mM cloruro di calcio, pH 7.4 a 25 C ;
2. Utilizzando tre cuvette, aggiungere ENZIMA nei volumi indicati (tabella colonna B):
[Enzima ] = 3mg/mL (enzima 3 mg/mL in HCl pH=3)
Travasiamo tutto il campione X nella quarta cuvetta, aggiungendo 500 microlitri di tampone.
A B C D
E (microg) vol vol Tampone AbsP@405nm
Enzima(microL) A (microL)
0.0 0 480 xx =

30 10 470 yy =

60 20 460 zz =

X 500 kk =

3. A ciascuna cuvetta, aggiungere:

20 microL di substrato N-Benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride (BAPNA)
Km= 5 10-5 mg/mL [BAPNA] = (10 mg/mL in DMSO) 20 microL in 1000 microL
4. Mescolare utilizzando il puntale della pipetta (senza shakerare !). FAR PARTIRE IL CRONOMETRO.
5. Attendere 1.5 min (1 min e 30 secondi (non meno di 1 minuto, non più di 2 minuti) !)
6. SOTTO CAPPA: Aggiungere 500 microlitri di acido acetico al 30% a ciascuna cuvetta.
7. Inserire ogni cuvetta nello spettrofotometro, e misurare l’assorbanza a 405 nm (AbsP@405nm), registrare il
valore di AbsP@405nm nella colonna D.
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 Determinazione [tripsina]: CALCOLI
1. Riportiamo i dati di E e delle Velocita’ calcolate in un grafico cartesiano

ESEMPIO GENERICO: 0,7

0,6

0,5 y = 6,5071x
E (microg) AbsP@405nm Tempo t Velocita’ Vo
(min:sec) (Abs/min) 0,4

Vo
0,3
0.03 xx = 0,444 t1 = 2:00 0,222
0,2

0.06 yy = 0,81675 t2 = 2:00 0,408 0,1

0
0.09 zz = 1,4875 t3 = 2:00 0,724 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Et

2. Effettuiamo una regressione dei minimi quadrati, per determinare i parametri della
retta interpolante, compresi gli errori associati (da svolgere a casa), cioe’ coefficiente
angolare b, errore nelle y (sy=dev standard, vedi sigma y nella slide 8) ed errore nelle x
(sx=sy/b)

3. Calcoliamo la velocità del campione incognito Vox= kk/t4 e quindi la concentrazione X

del campione incognito, come X = (Vox -a)/b

4. Riportiamo X ± sx , ponendo attenzione alle cifre significative

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 Retta dei minimi quadrati
Utilizzando una retta, la funzione sarà:

dove p è il numero di parametri (in questo caso

uguale a 2 (a e b) ed N il numero di coppie di dati
(in questo caso 3)

I dati sperimentali sono coppie xi, yi (dove le x sono le quantità di enzima (in
microgrammi) e le y le Vo (in abs/min)).

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