Laboratorio di Metodologie Biochimiche

Turno D
Gruppo 2
Edoardo Sirtori
Matricola: 722062

Giorno 1
Purificazione e caratterizzazione della D-AMINOACIDO OSSIDASI
da Rhodotorula gracilis in E.coli.
Nella prima giornata di laboratorio ci siamo dedicati allestrazione della proteina RgDAAO che si
accumula in forma solubile nel citoplasma delle cellule di E.coli.
Dopo una breve spiegazione teorica sulle tecniche e a ci di cui ci saremmo occupati, nella prima
giornata, abbiamo iniziato la nostra esperienza di laboratorio calcolando quanto tampone di rottura
avremmo dovuto inserire allinterno del nostro pellet, il campione di pellet era
gi stato
precedentemente misurato facendo la differenza tra peso netto e tara; in questo caso:
12,9(tara) - 17,9 = 4,5 grammi di pellet
ora sapendo quanti grammi di pellet abbiamo allinterno della nostra falcon dobbiamo calcolare il
quantitativo di tampone di rottura che dobbiamo inserire per rompere le cellule, sapendo che per
ogni grammo di pellet dobbiamo aggiungere 3 / 4 mL di tampone di rottura.
quindi facendo una moltiplicazione andiamo a calcolare il quantitativo di tampone da aggiungere:
4,5 (g di pellet) x 3,5 (mL di Tampone per grammo) = 15,75 mL di Tampone di rottura.
Una volta aggiunto il tampone di rottura aiutandosi con un puntale abbiamo rotto manualmente il
pellet per far si che le cellule di grandi dimensioni vengano rotte.
Prima di poter purificare il nostro enzima dobbiamo rompere le pareti cellulari, questo processo
richiede lutilizzo di un sonicatore. Il nostro campione ha eseguito un totale di 5 giri di sonicazione
ovvero 30 di sonicazione e poi un minuto di riposo nel ghiaccio.
una volta terminato questo processo abbiamo lasciato il campione allassistente che lo avrebbe
posto dentro una centrifuga per centrifugare le cellule a 18500 rpm a 4c per un totale di 60 minuti.
Mentre il nostro campione si trovava nella centrifuga abbiamo calcolato la Retta di Taratura
mediante il metodo del Reattivo del Biureto della BSA (albumina di siero bovino).
il reattivo del Biureto una soluzione che va a reagire in presenza di ioni Cu2+ e Biureto, le
proteine reagiscono a questa soluzione poich i legami peptidici presentano dei complessi simili a
quelli del biureto. Questo metodo viene utilizzato per osservare la concentrazione di proteine
presenti in soluzione indipendentemente da quale essa sia poich il seguente sistema si basa sulla
loro concentrazione, questo sistema possiede una scarsa sensibilit per cui possiamo utilizzarlo
per osservare le concentrazioni di proteine comprese in un range che va da 0,5 e 2,5 mg/mL.
Per questo metodo abbiamo preparato 7 cuvette di plastica da 1mL, che successivamente le
andremo a posizionare dentro lo spettrofotometro per calcolarne lAssorbanza.
Allinterno delle nostre cuvette andremo a inserire:
- X Volume di soluzione contenente BSA
- X di H2O
- 0.5 mL di reattivo del Biureto
per poter costruire una retta di taratura prendiamo diverse concentrazioni di BSA comprese nel
range di osservazione del Biureto. Le concentrazioni prese in esame sono:
1)
2)
3)
4)
5)
6)

0,5 %
0,9%
1,3%
1,7%
2,1%
2,5%

Il totale di soluzione da inserire nelle cuvette deve essere pari a 1mL, quindi dovremo calcolare
quanti mL di H2O andremo ad aggiungere. Per poter trovare il volume di BSA da inserire allinterno
delle cuvette ci avvaliamo della formula:
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi = al volume di H2O da aggiungere
Ci = concentrazione del biureto sempre a 0,5 mg/mL
Vf = volume della cuvetta
Cf = concentrazione della proteina BSA scelte da noi
ora sapendo ci possiamo applicare la formula per poter trovare il volume di BSA, che in questo
caso diventa:
Vi = Vf x Cf / Ci
Applicando la formula trovo che:
1)
2)
3)
4)
5)
6)

X = 1mL
X = 1mL
X = 1mL
X = 1mL
X = 1mL
X = 1mL

x 0,5 mg/mL
x 0,9 mg/mL
x 1,3 mg/mL
x 1,7 mg/mL
x 2,1 mg/mL
x 2,5 mg/mL

/ 0,5 mg/mL = 0,1 mL di BSA

/ 0,5 mg/mL = 0,18 mL di BSA
/ 0,5 mg/mL = 0,26 mL di BSA
/ 0,5 mg/mL = 0,34 mL di BSA
/ 0,5 mg/mL = 0,42 mL di BSA
/ 0,5 mg/mL = 0,5 mL di BSA

Una volta trovato quanti mL di BSA devo inserire nella provetta eseguo un semplice sottrazione
per calcolare gli mL di H2O da aggiungere, quindi nelle cuvette andremo ad aggiungere:
1)
2)
3)
4)
5)
6)

0,5 mL - 0,1 mL = 0,4 mL di H2O

0,5 mL - 0,18 mL = 0,32 mL di H2O
0,5 mL - 0,26 mL = 0,24 mL di H2O
0,5 mL - 0,34 mL = 0,16 mL di H2O
0,5 mL - 0,42 mL = 0,08 mL di H2O
0,5 mL - 0,5 mL = 0 mL di H2O

Ora avendo trovato tutti i dati possiamo procedere con la preparazione delle cuvette.

N.B. la settima cuvetta detta bianco poich dentro ad essa andr ad inserire 0,5 mL di Biureto e
0,5 mL di H2O. questo mi servir una volta trovata lassorbanza per eliminare lassorbanza dovuta
dalle proteine presenti.
in questa tabella troviamo i valori riscontrati:

Volumi (mL)

Volumi (mL)

Cuvetta

Campione

H2O

[BSA]
(mg/mL)

Volume
Reagente
(mL)

A540

A540 BIANCO

BIANCO

0,5

0,5

0,5

0,116

0,1

0,4

0,5

0,5

0,229

0,113

0,18

0,32

0,9

0,5

0,303

0,187

0,26

0,24

1,3

0,5

0,397

0,281

0,34

0,16

1,7

0,5

0,585

0,469

0,42

0,08

2,1

0,5

0,547

0,431

0,5

2,5

0,5

0,645

0,529

Una volta ottenuti i valori, grazie allutilizzo di un programma informatico di costruzione, siamo stati
in grado di ottenere la retta di taratura.


3

Y= 0,210x lequazione della retta di calibrazione ottenuta interpolando i punti ricavati

sperimentalmente. Ponendo sulle ordinate di questa retta il valore di assorbanza di un campione a
concentrazione incognita, trattato nelle stesse condizioni di dosaggio, sar possibile leggere sulle
ascisse la corrispondente quantit di sostanza presente nel campione in esame. Dal valore del
coefficiente di regressione R si pu dedurre che la retta ha un buon fitting in quanto il valore
molto vicino a 1.
Una volta ottenuta la retta troviamo la Y ovvero la pendenza della retta che uguale a y= 0,210x.
alla fine della giornata, una volta ottenuta la retta abbiamo preso 0,5 mL di estratto grezzo e lo
abbiamo posto allinterno di una eppendorf, che avremmo utilizzato per successive analisi.

Giorno 2
Purificazione mediante cromatografia di affinit per metallo chelato in FPLC.
Cambio del tampone mediante gel-filtrazione in PD10.
Nella seconda giornata di laboratorio abbiamo purificato il nostro estratto grezzo mediante la
cromatografia mediante sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).
inizialmente abbiamo unito i campioni dei prime 3 gruppi, dopo di che siamo andati ad aggiungere
alla soluzione di estratto grezzo (EG) NaCl al tampone per evitare le interazioni ioniche che si
possono andare a generare tra le proteine e la resina.
per sapere la quantit di NaCl da aggiungere utilizziamo la seguente formula:
Vi x Ci = Vf x Cf
dove
Vi: volume iniziale di soluzione d concentrazione Ci da aggiungere (NaCl)
Ci: concentrazione della soluzione iniziale da aggiungere
Vf: volume finale
Cf: concentrazione finale desiderata
ma poich
FD = Ci/ Cf
Vf = VEG + Vi
sostituendo alla fine ottengo la seguente formula:
Vi = VEG / (FD - 1)
dove
VEG: volume della soluzione iniziale (estratto grezzo)
FD: fattore di diluizione, pari a Ci/Cf
quindi ottengo che :
Vi = 48 /(5-1) = 48/4 = 12 mL di NaCl
il volume finale ottenuto di 60 mL.
Una volta preparato il campione lo andiamo a inserire allinterno della colonna, precedentemente
preparata col nichel, allinterno del Super Loop (valvola di iniezione da 50 mL), eseguiamo due
caricamenti per purificare linterno campione. una volta caricato il campione. seguiamo la sua
corsa grazie al computer che ci mostra lassorbanza. lentamente osserviamo come alla resina si
lega la proteina poich essa si colora. una volta che abbiamo caricato tutto lEG incolonna
eseguiamo due eluizione: la prima a 5% per staccare dalla resina i fattori contaminanti che si
possono essere legati ad essa, dopo di che faremo la seconda eluizione al 100% che stacca la
proteina dalla e la andiamo a raccogliere in provetta, alla fine da 60 mL di EG otteniamo 4,5 mL di
EP (enzima puro), che vengono divisi tra i tre gruppi per un totale di 1,5 mL di EP a gruppo.
una volta terminato la purificazione, siamo tornati nel laboratorio dove gli altri 3 gruppi avevano
preparato la cromatografia su gel-filtrazione, questo tipo di cromatografia serve a cambiare il
tampone al nostro EP.
Cartogramma dei gruppi 1-2-3.


Mentre gli altri gruppi purificavano la proteina, ci siamo dedicati a calcolare la concentrazione delle
proteine con il metodo del Reattivo del Biureto, usando il nostro EG.
Questa volta andiamo a osservare lassorbanza dei campioni a diverse quantit di EG portati a 0,5
mL con H2O.
In questa tabella troviamo i valori riscontrati:
Volume

Volume

Volume

Cuvetta

EG (mL)

H2O (mL)

Reagente (mL)

A540

A540 Bianco

Bianco

0,5

0,5

0,116

0,20

0,48

0,5

0,268

0,152

0,40

0,46

0,5

0,355

0,239

0,60

0,44

0,5

0,468

0,352

Una volta che abbiamo trovato i seguenti fattori, calcoliamo calcolo le concentrazioni EG in ogni
cuvetta:
Y=mxX
dove:
Y: Assorbanza
m: pendenza della retta di taratura
X: mg/mL di proteine in cuvetta
per calcolarla facciamo : X = m / Y
0,152 / 0,210 = 0,72 mg/mL
0,239 / 0,210 = 1,14 mg/mL
0,352 / 0,210 = 1,68 mg/mL

Si calcolare ora il fattore di diluizione considerando il volume di EG di ogni cuvetta.

Fattore Diluizione = 1000 L/ EG m
1000 / 20 = 50
1000 / 40 = 25
1000 / 60 = 16,7
Moltiplicando il fattore di diluizione per la concentrazione di EG allinterno di ogni cuvetta si ricava
la concentrazione di EG iniziale tenendo conto delle diluizioni fatte.
0,72 x 50 = 36 mg/mL
1,14 x 25 = 28,5 mg/mL
1,68 x 16,7 = 28,1 mg/mL
Si calcola la concentrazione media
36 + 28,5 + 28,1 = 92,6 / 3 = 30,86 mg/mL
A questo punto, con i dati fin ora raccolti, possibile calcolare la quantit di proteine nellestratto
grezzo:
30,86 x 17,5 = 540,05 mg
Si calcola lefficienza di rottura: mg totali / g di cellule = efficenza di rottura
540,05 / 4,5 = 120
Una volta ottenuta lefficenza di rottura, possiamo eseguire la Gel-filtrazione con PD10.
Questa tecnica viene utilizzata perch durante la purificazione con FPLC stato aggiunto
dellimidazolo che non stabile, quindi prendiamo la PD10 e la calibriamo con il tampone di
Storage in cui lenzima stabile. carichiamo fino ad un massimo di 2,5 mL ed aspettiamo
leluizione del campione, possiamo seguirne la corsa dato che la proteina DAAO di colore giallo.
Quando la proteina si trova presso la bocca di uscita della PD10 la raccolgo usando una provetta
graduata. la frazione cha abbiamo raccolto il nostro Campione di Enzima Puro (EP).

PD10

Giornata 3
Determinazione dellattivit enzimatica nellestratto grezzo e in quello puro.
Determinazione spettro di assorbimento e concentrazione di His - RgDAAO
nel campione puro.
Si determina lattivit enzimatica nel campione EG e nellenzima purificato (campione EP) tramite
dosaggio continuo allo spettrofotometro. Il dosaggio dellattivit D-aminoacido ossidasi si effettuer
in maniera indiretta, cio mediante lutilizzo accoppiato dellenzima perossidasi da rafano (HRP) e
del suo substrato cromogenico, o-dianisidina (o-DNS). La perossidasi riduce lHO, uno dei
prodotti della reazione catalizzata dalla DAAO, ad acqua e ossida o-DNS portando allo sviluppo di
una colorazione rosso-bruna, con un massimo di assorbimento a 440 nm. Considerando la velocit
di comparsa della colorazione possibile monitorare la produzione di HO e a sua volta questa
proporzionale lattivit della DAAO per il substrato in esame, la D-alanina. Prima di proseguire con
la preparazione delle cuvette necessario diluire opportunamente i campioni con il Tampone di
Storage, in quanto si devono utilizzare concentrazioni di substrato che garantiscono un andamento
rettilineo iniziale, poich Vo deve essere simile a Vmax.
Prima di inserire le cuvette nello spettrofotometro, per la lettura dellassorbanza, si aggiunge in
ogni cuvetta 10 L di HRP, nelle cuvette per l estratto grezzo 10 L di campione EG 40X, e nelle
cuvette per lenzima purificato 10 L del campione EP, per un volume finale di 1000 L. Subito
dopo laggiunta del campione viene registrata per alcuni minuti lassorbanza della miscela di
reazione (EG o EP). Dalla parte iniziale del tracciato, regione rettilinea, si ricava il valore della
velocit iniziale di reazione, proporzionale allattivit della DAAO, espressa come A/min. Da tale
valore, conoscendo il coefficiente di estinzione dello-DNS, pari a 13 mMcm, si ottengono le
unit enzimatiche per unit di volume (U/mL).

DILUIZIONE EG 1/40
calcolo dellattivit enzimatica mediante le formule:

Estratto Grezzo lettura assorbanza a 40X

cuvetta

A/min

0,1084

0,1202

0,131

necessario tener conto delle diluizioni per considerare le unit presen2 nel volume di campione
aggiunto in cuve6a e per risalire alle unit nel campione originale

si calcola la media usando la Formula:

Lettura assorbanza del campione EP 100X

Cuvetta

A/min

0,2422

0,222

0,2000

calcolo la media:

Per ricavare la concentrazione di proteina si osserva lo spe6ro nellUV visibile in un intervallo di

lunghezza donda tra 342-800 nm, conoscendo ques2 da2 si u2lizza la legge di Lambert-Beer per
ricavare la concentrazione di estra6o puro:

Troviamo un valore di assorbanza pari a 0,0989 con il quale posso calcolare usando la formula di
Lambert-Beer:
c(mM) = 0,0989/ 12,6(mM-1cm-1)X1(cm) =0,0078mM

Considerando il fa6ore di diluizione 10X si oLene una concentrazione di campione EP pari a 0,078
mM. U2lizzando ora il peso molecolare della nostra proteina possiamo calcolare la concentrazione
di EP espressa in mg /mL , u2le poi per calcolare l aLvit specica.

ora possiamo calcolare laLvit specica di EP e EG:

-ALvit specica EG :

-ALvit specica EP:

10

a questo punto possiamo calcolare il fa6ore di puricazione, facendo un rapporto tra aLvit di EP
e aLvit di EG:

11

Giornata 4
DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI DELLA DAAO
Per determinare i parametri cine2ci di un enzima bisogna misurare la V a diverse concentrazione
di substrato, in modo da poter costruire sperimentalmente la curva di Michaelis-Menten. La
velocit di reazione viene misurata con lo spe6rofotometro, a diverse concentrazioni di D-alanina
in presenza di una concentrazione costante di enzima.
Per o6enere la concentrazione nale di D-alanina(mM) uso la formula:
Vi x Ci = Vf x Cf che diventa > Cf = Vi X Ci / Vf
quindi sos2tuisco e calcolo:
1) 10L X 25 mM/1000 L = 0,25mM
2) 20L X 25mM/1000 L =0,50mM
3) 50L X 25mM/1000 L =1,25mM
4) 100L X 25mM/1000 L =2,50mM
5) 200L X 25mM/1000 L =5mM
6) 400L X 25mM/1000 L =10mM

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

[D-Ala] (mM)

0,25

0,50

1,25

2,50

10

1/[D-Ala]
(mM-1)

1,96

0,80

0,40

0,20

0,10

V0
(Abs440/
min)

0,0544

0,0998

0,161

0,1234

0,1452

0,1658

1/v0
(Abs440/
min)-1

18,38

10,02

6,21

8,10

6,88

6,03

12



Dal graco o6enuto siamo in grado di iden2care:

-con alte concentrazioni di substrato la velocit tende ad un valore massimo che diviene costante.
Questo valore Vmax = 0.176.
-L indice di anit tra lenzima e il substrato, che coincide con la concentrazione di substrato a cui
si realizza met della Vmax, pari a Km = 0.431.
Trova2 i parametri cine2ci ora possibile calcolare Kcat , denita come il numero di molecole di
substrato conver2te per secondo. Si calcola:

13

Tenendo conto che la Vmax ricavata espressa come Abs/min abbiamo potuto calcolare Kcat
facendo:

Per determinare i parametri cine2ci u2le u2lizzare, oltre alla curva di Michaelis-Menten , la
linearizzazione dei doppi reciproci, che rappresenta una delle tecniche pi pra2che. Si riportano in
graco i valori di 1/[D-Ala] in ascissa e quelli di 1/V in ordinata.

14

!
Alla fine della giornata abbiamo preparato i campioni per la corsa elettroforetica,Per determinare il
peso molecolare della proteina DAAO, si utilizza la tecnica dellelettroforesi su gel di
poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE), la quale permette la separazione delle
proteine in base al peso molare. Inizialmente, si procede allestendo i campioni per la corsa
elettroforetica, miscelando in provette Eppendorf un volume di 4X Sample Buffer per SDS, con un
determinato volume di HO e di campione raggiungendo un volume finale di 80 L.
Per calcolare il volume di campione da aggiungere alla miscela, si considera nel caso dellestratto
grezzo il volume contenente 80 g di proteine totali in 10 L, mentre nel caso del campione di
enzima puro 5 g di His-RgDAAO in 10 L.

Calcoli per la preparazione dei campioni per la corsa ele6rofore2ca:

Vi X Ci = Vf X Cf > Vi= Vf X Cf / Ci =

15

Giornata 5

SDS_Page e controllo dei calcoli

Nella quinta giornata di laboratorio abbiamo alles2to i campioni per la corsa ele6rofore2ca e
abbiamo controllato che i calcoli esegui2 no a questo momento fossero correL.
lele6roforesi viene condo6a in una cella ele6rofore2ca ver2cale con lanodo posto inferiormente,
e prevede lu2lizzo di due gel di poliacrillammide contenen2 SDS, stra2ca2 luno sullaltro
(bifasica).
Dopo aver terminato lele6roforesi il gel viene so6oposto ad una procedura di colorazione per
poter vedere le bande proteiche. Il gel viene rimosso dalle lastrine di vetro e immerso per 5 minu2
in una soluzione di ssaggio, per poi essere immerso nella soluzione contenente il colorante,
Coomassie Blue . A questo punto il gel viene posto in una soluzione decolorante no a completa
decolorazione, evidenziando cos solo le bande proteiche:


Dopo la corsa elettroforetica, per determinare il peso molecolare del campione proteico (HisRgDAAO), si sfrutta la relazione lineare che c tra il logaritmo in base 10 del peso molecolare e la
mobilit elettroforetica (Rf), perci avendo effettuato contemporaneamente la separazione
elettroforetica di una miscela di proteina di peso molecolare noto (proteine marker) possibile
allestire una retta di taratura per la determinazione del peso molecolare del campione proteico in
esame( ci stato fatto nella sesta giornata di laboratorio).

16

Giornata 6
Determinazione dellattivit cinetica con substrati alternativi
Controllo western-blot e SDS-Page
La DAAO un enzima che agisce specificatamente su un buon numero di D-aminoacidi, pertanto in
questa giornata abbiamo determinato lattivit enzimatica dellenzima puro (EP) utilizzando diversi
D-aminoacidi come substrato. in nostro gruppo ha usato la D-metionina e il D-triptofano.
Calcolo della concentrazione nale di substrato con D-Me2onina

Analogamente a quanto gi ee6uato per la D-Ala, prima di alles2re le cuve6e necessario diluire
il campione EP di un Fd 100X (con due diluizioni da 10X). Anche in questo caso si determinano i
parametri cine2ci u2lizzando la curva di Michaelis-Menten e il metodo di linearizzazione dei doppi
reciproci.

17

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

Dosaggio

[D-aa](mM)

0,06

0,12

0,3

0,6

1,2

2,4

1/[D-aa]
(mM-1)

16,6

8,3

3,3

1,67

0,83

0,417

0,0540

0,0991

0,1242

0,1858

0,2428

0,2854

V0(Abs440/
min)
1/V0
(Abs440/
min)-1

Vmax= 0,302 +/- 0,013

Km= 0,327+/- 0,042

18

Cine2ca doppi reciproci


Y= 2,924+1,19X
Vmax= 1/ 2,924 = 0,342
Km= 1,191 / 2,924 =0,407mM
secondo substrato: D-Triptofano

19

20

alla fine della ultima giornata di laboratorio abbiamo costruito la retta dellenzima DAAO, usando
un righello abbiamo misurato la lunghezza delle bande, avendo come controllo delle proteine a peso
noto(vedi immagine sopra per i calcoli). una volta trovati tutti i dati, li abbiamo posizionati per
costruire la retta.
(vedi immagine sotto)

21

22