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SPETTROSCOPIA

Definizione Disciplina che studia qualitativamente e quantitativamente le sostanze poste in esame grazie allanalisi dellinterazione della materia con le radiazioni elettromagnetiche. Principio del Funzionamento Le radiazioni elettromagnetiche sono una forma di energia, rappresentabile da un movimento ondulatorio. Lintera gamma delle radiazioni elettromagnetiche rappresenta lo Spettro Elettrofotometricoe una parte di questultimo definito lo Spettro del Visibile, in quanto osservabile dallocchio umano ( da 400700 nm) (chiamato comunemente Luce). a) Nella materia gli elettroni sono distribuiti su diversi livelli energetici in modo tale da possedere il minor quantitativo energetico disponibile (stato Fondamentale) b) Nel momento in cui la materia viene colpita da una radiazione elettromagnetica pu passare a un livello energetico superiore (Stato Eccitato), in quanto gli viene ceduta un quantitativo denergia definito Spettro dAssorbimento Lenergia che viene assorbita sar pari alla differenza di energia posseduta dai livelli presi in considerazione : E= E1 E2 c) Nel momento in cui lelettrone dallo stato eccitato torna a quello fondamentale , emetter{ lenergia che aveva assorbito sotto forma di Spettro Demissione che caratteristico per ogni elemento. Lo studio dello Spettro di Assorbimento quindi un valido mezzo per la caratterizzazione di numerosi composti, da un punto di vista Qualitativo. Tecniche Spettroscopiche Vi sono diverse Tecniche analitiche che come parametri hanno Sensibilit, Specificit, Riproducibilit, Semplicit alte: Spettroscopia demissione: valuta quella parte denergia emersa sotto forma di radiazioni elettromagnetiche. (ex. Raggi Gamma) Spettroscopia DAssorbimento: studia lenergia delle radiazioni elettromagnetiche che viene assorbita dalla materia. (Ex1: Spettroscopia di Risonanza Magnetico Nucleare, si basa sulle propriet magnetiche di alcuni Isotopi/Atomi) (Ex2: Spettroscopia di Emissione a Raggi Gamma, in cui la Gamma Camera assorbe le radiazioni e permette di studiare forme e strutture delloggetto) (Ex3: Spettroscopia nellUltravioletto o nel Visibile ,normalmente usate nella Chimica Analitica) (Ex4: Spettroscopia Atomica o Raggi X, usata nei Laboratori di Doping e Tossicologici e Densitometria Ossea) (Ex5: Spettroscopia a Infrarosso o Vibrazionale, per lo studio dei legami Fisici/chimici)

Analisi Quantitativa Per Effettuare analisi quantitative si fa solitamente uso di raggi monocromatici (costituiti da radiazioni di una sola frequenza). Quando una radiazione elettromagnetica irradia una soluzione , essa viene assorbita pi o meno intensamente a seconda della concentrazione della soluzione in esame(lassorbimento dipende dalla concentrazione). Ex. Se si fa passare attraverso una soluzione dalla [ ] incognita una radiazione Monocromatica, cio con una e di Intensit Io , al di l della soluzione si trover una radiazione di intensit I, che sar minore di Io se una parte della radiazione stata assorbita dalla soluzione, o uguale a Io se non si verificato alcun assorbimento I La frazione di luce trasmessa, rispetto a quella incidente, si dice Trasmittanza (T) = --Io Lentit{ della radiazione Assorbita detta pi comunemente Assorbanza, ed pari al logaritmo del reciproco della Trasmittanza La Legge di Lambert-Beer ci permette di calcolare la concentrazione di un campione dal suo assorbimento A=x cxd con A = Assorbanza del Campione = Coefficiente di Estinzione Molare c = Concentrazione in mol/L d = Cammino ottico in cm Secondo tale legge quindi lAssorbanza direttamente proporzionale sia alla [ ] della sostanza Assorbente , sia allo spessore dello strato attraversato, per cui pi elevata la concentrazione della molecola e maggiore sar{ lassorbanza ( e maggiore sar{ la diminuzione di intensit{ del raggio incidente) Particolari dispositivi Rilevatori sono in grado di misurare lintensit{ del flusso luminoso. (sia quello in ingresso, sia quello in uscita) N.B. Per essere valida , tale legge ha bisogno che la concentrazione da analizzare sia Diluita. Analisi Qualitative Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi Policromatici, che vengono poi separati tramite Monocromatori nelle varie componenti ( radiazioni Monocromatiche) In pratica, le singole radiazioni minori si fanno passare , una alla volta attraverso le sostanze in esame , la quale assorbir in modo diverso , cio con diversa intensit, le diverse radiazioni. Per il fatto che Ogni sostanza ha il suo Spettro Dassorbimento, lesame di tali spettri ci consente di identificare una sostanza ( per confronto diretto con campioni noti) e di controllare il grado di purezza. La tecnica che meglio si presta allanalisi qualitative la Spettroscopia Infrarossa e soprattutto la RMN, che presenta serie di picchi direttamente collegabili alla struttura della molecola

Lo Spettrofotometro Lo Spettrofotometro costituito dalle seguenti componenti: 1- Sorgente, la quale deve emettere radiazioni Policromatiche , per la regione del visibile si usano Lampade ad Incandescenza ( a filamento di tungsteno o lampade quarzo-iodio) mentre per la regione UV si usano Lampade a Scarica in un Gas ( Deuterio o idrogeno) , davanti alla quale posta la Fenditura dingresso che serve ( associata a lenti) a rendere paralleli i raggi ed evitare luce soffusa nello strumento. 2- MonoCromatore, di due tipi: a) Basato sui Filtri Ottici ( contenenti apposite Sostanze che assorbono gran parte delle radiazioni visibili lasciando la banda desiderata; utilizzati nei Colorimetri comuni) o Interferenziali( si basano sullinterferenza ma essendo piu costosi sono presenti nei Colorimetri Migliori) che bloccano una parte della luce e fanno passare la parte desiderata. b) Basato su un Elemento Disperdente (Prisma o Reticolo) che separano le varie componenti delle Radiazione( grazie ad un Prisma) e ne permettono la successiva selezione della banda desiderata ( usati su spettrofotometri di qualit 3- Cella, contenente il campione da analizzare , di materiale trasparente (quarzo o vetro) e con un preciso Cammino Ottico (Lunghezza Percorsa dalla radiazione nel Campione) il quale deve essere sufficiente per avere assorbimenti rilevabili dallo strumento 4- Rilevatore, dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico che dipende dallenergia delle radiazioni che lo investono ( il segnale poi trasferito ad un indicatore analogico o elaborato per via elettrico) , ovvero la porzione dello strumento che fa le misurazioni vere e proprie ( quindi deve essere Molto Accurata e Sensibile) 5- Sistema di Elaborazione e presentazione dati N.B. La differenza fondamentale tra Spettrofotometri e Colorimetri che nei secondi si ha una maggiore ampiezza di banda passante. (tale differenza dipende dal fatto che vengono utilizzati diversi Monocromatori)

Pulsiossimetro
Definizione Lossimetro pulsato unapparecchiatura medica che ci permette di misurare la quantit di emoglobina legata nel sangue in maniera non invasiva. Non permette di stabilire con quale gas legata lHb, ma solo la percentuale di Hb legata. Normalmente lHb lega O2 , per cui possiamo anche, calcolare una stima dell O2 presente nel sangue. Il Pulsiossimetro Generalmente formato da una sonda che effettua le misurazioni e da ununit{ che calcola e visualizza il risultato della misurazione. La sonda di un normale ossimetro pulsato costituita da una pinza che viene applicata generalmente al dito del paziente. La sonda collegata ad ununit{ di calcolo che visualizza la misurazione tramite un monitor a Led. Principio di Funzionamento La sonda composta da due diodi che generano fasci di luce nel campo del rosso (circa 660 nm) & dellinfrarosso (tra 805 e 1000 nm) e da una fotocellula che riceve la luce dopo che i fasci attraversano la cute e quindi anche la circolazione del paziente. LHb ossigenata, caratteristicamente, assorbe la luce in quelle determinate lunghezze donda, quindi conoscendo la quantit{ di luce iniziale e quella finale ,lapparecchiatura pu calcolare la Saturazione dellossigeno nel paziente (SpO2 ) Gli ossimetri ottici si basano sui diversi spettri dassorbimento della Hb e dellHbO2 ( tra laltro questo la ragione del diverso calore del sangue arterioso e venoso) Il Coefficiente di assorbimento dellHb e dellHb02 uguale a 805 nm, per cui questa lunghezza donda detta Isobestica usata come Riferimento. Utilizzazione La sonda per funzionare ha bisogno di una zona pervasa da circolazione superficiale poich se troppo in profondit , i capillari, non sono raggiunti dai fasci di luce.(dito di una mano o lobo) Inolre grazie ad essa possiamo sapere anche la frequenza e lintensit{ di polso del paziente. Il suo uso previsto sia nei reparti ospedalieri, sia sui mezzi di soccorso in quanto un dispositivo non invasivo ed precoce nel riconoscere lipossia rispetto alle condizioni della Cianosi, permettendo una diagnosi di desaturazione dellossigeno prima di gravi complicanze. Lutilizzo libero, di solito viene usato sia da personale sanitario , sia da personale non sanitario addetto al soccorso.

Misurazioni Una misurazione fisiologica della Saturazione si attesta tra il 95 e il 100% Valori tra il 90 e il 95% un assenza dellossigeno (lieve ipossia). Valori < 90% seria deficienza di ossigeno (grave ipossia). Valori di 100% misurato in aria ambiente sintomo di Iperventilazione

A volte valori anche del 90% possono risultare normali, ma nel caso di persone afflitte da BPCO. Limitazioni dUso A falsare i risultati possono essere: - lo Smalto delle unghie pu schermare le Lunghezze donda generate dalla sonda rendendo imprecisa la misurazione; - la Vasocostrizione dei distretti periferici porta ad una diminuzione del flusso sanguigno rilevabile dalla sonda portando quindi ad elaborare dati falsati. - Lo Strumento misura solo la % di saturazione dellHb, mentre non rileva informazioni su quale gas va a legarsi. Questo pu portare dei problemi per esempio nel momento in cui c un intossicazione da CO ( in cui avremo unalta % di Hb saturata in quanto CO ha maggiore affinit{ per Hb dellOssigeno)

Spettroscopia di Riflettanza
Ogni volta che una radiazione elettromagnetica incontra la materia si possono avere diversi fenomeni dinterazione solitamente riconducibili ad uniniziale trasferimento di energia dalla radiazione alla materia, seguito da una completa remissione dellenergia sotto varie forme. I fenomeni sono: - Riflessione, ( si verifica quando unonda elettromagnetica viene respinta dalla superficie sulla quale incide) , di due tipi: a) Speculare o Regolare ( se la superficie liscia) b) Diffusa ( se la superficie irregolare) - Rifrazione - Diffusione - Diffrazione - Polarizzazione - Assorbimento Nelle analisi cliniche, una tecnica molto usata la Spettroscopia di Riflettanza ( il quale si basa sul fenomeno della Riflessione Diffusa) Il dispositivo pi comunemente usato per la misurazione della riflessione la sfera integratrice di Ulbrich ( ovvero una Sfera Cava con superficie interna perfettamente diffondente, che consente la riflessione totale della Luce, la quale entra attraverso una piccola fessura) Le Misure in genere interessano la regione dellUltravioletto e dellInfrarosso. Struttura degli strumenti per misurare la Riflettanza: 1- Strato di Diffusione: il quale deve permettere di distribuire uniformemente il campo in tutta larea della lastrina e contiene reagenti che filtrano le molecole grandi ( proteine, lipidi, Hb) che potrebbero interferire con la reazione.

2- Strato dei Reagenti: costituito da materiale poroso impregnato di reagenti quali enzimi, cataliti, tamponi necessari per lesecuzione delle reazioni chimiche. 3- Strato Indicatore: contiene un colorante che produce un complesso colorato la cui intensit{ proporzionale alla [ ] dellanalita considerato. 4- Strato dei Supporti Solidi, in genere cellulosa o materiale plastico nei quali vengono immobilizzati i reagenti ( deve consentire pero il passaggio della luce) Si pu quantificare lIntensit{ del colore attraverso la misura della Luce Riflessa dalla parte colorata, mediante il Fotorilevatore. La relazione tra intensit{ di luce e la [ ] dellanalita, non lineare, ma pu essere resa tale mediante luso di algoritmi. I Vantaggi sono: - E possibile applicare dei Diversi Reagenti sul supporto in modo tale da eseguire un gruppo fisso di misura ( ex. Esame delle Urine) - I reagenti sono presenti sul supporto allo stato Secco quindi Facilmente conservabili. - I reagenti , qualora siano piu di uno possono venire stratificati in spessori sottili e se necessario separati gli uni dagli altri in modo da reagire solo durante lanalisi. - La zona di supporto pu essere fatta in modo da assorbire un volume Standard di liquido fisiologico, rendendo piu facile lanalisi. - I Reattivi non devono essere preparati quindi non vi scarico di Acqua e di Rifiuti.

Analizzatore per Urine


Lanalisi delle urine sono importanti in quanto permettono di conoscere le informazioni allo stato epatico, renale, del metabolismo glucidico e altre importanti. Tale analisi si esegue mediante indagini semi-quantitative e microscopiche che permettono di rilevare la presenza di alcuni analiti e stimarne la concentrazione. La loro importanza e lelevata richiesta hanno portato allautomatizzazione delle analisi per una maggiore rapidit( infatti permettono di analizzare anche pi campioni alla volta) e semplicit. Tali tecniche sfruttano Fotometri per rilevare la Riflettanza e reattivi allo stato secco su strisce reattive. Loriginale procedura, oggi definita Semi-Automatica vede lintervento delloperatore nellimmersione delle strisce reattive nellurina e il successivo posizionamento nello strumento.

Turbidimetria
Definizione La turbidimetria una tecnica che permette di stabilire la torbidit di una soluzione di particelle che abbiano Dimensioni Sufficientemente Piccole e Uniformi da formare una Sospensione Omogenea. Questa tecnica si avvale di un normale Spettrofotometro equipaggiato con misure turbidimetriche, quindi utilizzante lunghezze donda corte (molto importanti per la sua sensibilit) e con un rilevatore posizionato in linea con la sorgente luminosa. Essa applicabile per soluzioni in cui le particelle sospese hanno dimensioni >100 nm e una [ ]>10^(-4) M, quindi molto utile per analizzare le Protenie Urinarie, Plasma e sue Proteine, Enzimi ed Isoenzimi. Tale tecnica , come la Nefelometria, si basa sulleffetto Tyndall che si verifica quando una soluzione irradiata da unonda elettromagnetica, la quale una volta giunta al bersaglio, subisce, a causa delle sostanze in soluzione( e delle loro dimensioni paragonabili alla Lunghezza donda), dei fenomeni di Rifrazione, Diffrazione e Riflessione. Tale interazione si traduce per una piccolissima parte in cessione di energia alla materia disciolta, con conseguente Riscaldamento e per la maggior parte in una Deviazione del raggio luminoso, che modifica la propria Traiettoria e diminuisce la propria intensit rispetto a quella iniziale. I fattori che influenzano maggiormente leffetto Tyndall sono: Dimensioni delle Molecole, le quali sono direttamente proporzionali al grado di luce diffusa Lunghezza donda del raggio incidente, la quale direttamente proporzionale al grado di luce diffusa [ ] della soluzione, la quale inversamente proporzionale al grado di luce diffusa , molto importante in quanto in base a se essa sia < o > di 10^(-4)M si decide se si vada o no a valutare lassorbimento dellonda luminosa da parte della soluzione (decidendo cosi se optare per la misura Turbidimetrica o Nefelometrica) la differenza tra gli indici di rifrazione della fase disperdente e della fase dispersa la stabilit temporale del sistema colloidale, di solito alta nella turbidimetria grazie alluso di colloidi stabilizzatori.

LAssorbanza che la soluzione dimostra direttamente correlata alla [ ] della sostanza e tale relazione regolata dalla Legge di Lambert-Beer.

Nefelometria
Definizione una tecnica ottica di analisi che permette di ricavare la quantit di sostanza oggetto determinata misurando lintensit{ della Radiazione Diffusa per Effetto Tyndall da una soluzione contenente aggregati (es. complessi Ab-Ag) Viene applicata per soluzioni in cui le particelle in sospensione sono particolarmente fini ( < 100 nm) e in [ ] <10^(-4) M. La Legge di Rayleigh lega lintensit{ della luce diffusa al numero di particelle presenti in sospensione. Le misure nefelometriche possono essere condizionate da diversi fattori ( in quanto molto sensibili). I principali sono: a) Dimensioni Particelle b) Stabilit della soluzione c) Forza Ionica d) pH del Mezzo e) Presenza di sostanze interferenti ( polimeri , colloidi) A differenza della turbidimetria, nella Nefelometria si effettua la misura della luce Diffratta e ci necessita che il rilevatore si posto a 90 rispetto alla direzione della sorgente ( al fine di captare la maggiore intensit di raggi possibile). Tuttavia si usano comunque degli Spettrofotometri equipaggiati con misure Nefelometriche, quindi molto spesso utizzanti un fascio luminoso costituito da un Raggio Laser( per maggiore precisione, utile soprattutto in Immunonefelometria)

Applicazioni Cliniche La nefelometria pu essere usata per la misurazione di livelli di proteine (Ag) o Anticorpi in fluidi Biologici quali: Siero, Plasma, Urine, Liquor. (come ad esempio la Beta2-microglobulina)

Luminescenza
Definizione un fenomeno che consiste nellemissione di fotoni di luce visibile o infrarossa da parte del materiale eccitato. Il fenomeno nasce dalla propriet di alcuni materiali di assorbire quantit discrete di energia, successivamente restituita sotto forma di Fotoni di energia inferiore. A seconda della natura delleccitazione parliamo di: 1. Bioluminazione, fenomeno per cui organismi viventi attraverso particolari reazioni chimiche (trasformazione di energia chimica in energia luminosa) emettono fotoni di luce sotto forma di radiazione luminosa permettendo quindi che le molecole ritornino dallo stato eccitato a quello fondamentale

, Ex. Nel caso in cui della Lucciola avviene la bioluminazione grazie a questa reazione: Luciferina+ATP+Mg+(luciferasi) Luciferina+ADP+Mg , Ex. Nei Batteri, avviene la Bioluminazione in presenza di Ossigeno(aerobi) 2. Chemiluminescenza, fenomeno che consiste nellemissione di radiazioni nel Visibile e nellIR a seguito di una reazione chimica con A e B reagenti A + B P* P + hv P*= prodotto eccitato P= prodotto standard Hv= Fotone , Ex1. Luminolo+H2 O2 + catalizzatore metallico , Ex2. Acridinio +H2 O2 (senza catalizzatore)

Vantaggi della misura Luminometrica: - Sensibilit - Economicit - Sensibilit

- possibilit di Automazione

Strumentazione (Luminometro) Strumento capace di determinare lintensit{ di una fonte luminosa convertendola in un segnale elettrico. Formato in ordine da Cella, Fotorilevatore e Amplificatore.

Applicazioni - Determinazione di enzimi - Effetti degli antibiotici - Determinazione della biomassa microbica - Immunorilevazione - Marcatori sonde DNA

Fluorescenza
Definizione Capacit{ di alcune sostanze di riemettere, a lunghezza donda maggiore e quindi energia minore, le radiazioni elettromagnetiche ricevute.( in particolare Assorbendo radiazioni Uv e riemettendole nel campo del Visibile) Lintensit{ del Fenomeno direttamente proporzionale alla [ ] della sostanza Fluorescente e perci essa pu essere usata come elemento per indagini quantitative. Il Fluorimetro, ovvero lo strumento che rileva tale fenomeno, molto simile ad un normale Spettrofotometro ma costruito in modo tale da ricevere le radiazioni della sostanza fluorescente con una sensibilit circa 1000-10000 volte superiore ma con specificit paragonabile.( il fotorilevatore posto a 90 rispetto allasse della sorgente luminosa-Cella)

Applicazioni Cliniche sono attraverso un metodo: - Diretto, il quale applicabile solo quando la sostanza da determinare Autofluorescente - Indiretto, applicabile quando la sostanza non Autofluorescente, ma lo diventa a seguito di una reazione con particolari reagenti. - Inibizione, nei quali la sostanza da analizzare riduce specificatamente e quantitativamente la fluorescenza di un determinato Fluoroforo. Tra le sostanze analizzate con pi frequenza ci sono: - Cortisolo - Estrogeni - Catecolammine - Tianina - Fenilalanina

Una tecnica che sfrutta la Fluorescenza la FISH ( Ibridazione Fluorescente in situ), una metodica citogenica che pu essere usata per rilevare e localizzare la presenza o lassenza di specifiche sequenze di DNA o RNA sfruttando la complementariet delle sequenze degli acidi nucleici avvalendosi di particolari sonde a Fluorescenza I Vantaggi della FISH sono: - Velocit - Precisione - Specificit - Sensibilit Il limite fondamentale dato dallElevato Costo della Tecnica.

Differenze tra Fluorescenza e Fosforescenza: Nella prima la radiazione generata in virt di transizioni tra stati con la stessa molteplicit di spin. Nella seconda la transizione comporta la variazione della molteplicit di Spin.

Differenza tra luminescenza e Fluorescenza Sono metodiche molto simili, infatti differiscono soltanto nel fatto che nella Prima , la sostanza eccitata torna allo stato normale riemettendo fotoni; invece nella Seconda, la sostanza torna al livello precedente emettendo fotoni stabilmente ( quindi per un periodo di tempo pi lungo della prima)

POCT ( Point of Care Testing)


Definizione Modalit con la quale si possono eseguire test analitici al di fuori delle strutture del laboratorio clinico, che possono richiedere spazi strutturali permanenti, ma anche Kit e strumentazione trasportabile manualmente in prossimit{ del paziente per lesecuzione immediata dei test clinici. Il principio su cui si basa quello della chimica solida ( Dry Chemistry) con reagenti secchi immobilizzati su un supporto inerte attraverso il quale passa il campione per capillarit Lo scopo principale quello di ottenere informazioni analitiche sui campioni biologici il pi Rapidamente possibile e con la maggiore accuratezza possibile.

Tale principio ne evidenzia cosi i vantaggi: -Semplicit -Velocit -minor quantit di campione -Buon impatto clinico Il termine POCT maggiormente diffuso in USA, NPT, ovvero Near Patient Test ,diffuso maggiormente in Europa ha lo scopo di sottolineare la conginuzione tra pratica clinica e di laboratorio a dispetto del contesto in cui si trova il paziente.

Tempo di Risposta (TAT) Uno dei motivi fondamentali per cui stato studiato il POCT il TAT ( Turn Around Time) ossia il tempo di risposta: - Nel Laboratorio il TAT < di 2h ( con campioni gi centrifugati) - Nel Laboratorio con servizio durgenza il TAT compreso tra i 20 e i 100 minuti ( con campioni gia centrufugati) - Con le metodiche POCT, il TAT < ai 20 minuti ( con campioni non preparati. Ex. Sangue Intero)

Casi di Utilizzo 1. Nella Medicina critica, ovvero unattivit{ multidisciplinare che tratta pazienti che sono a rischio o hanno subito un insufficienza mono-/multi- organo, le metodiche POCT permettono il monitoraggio Continuo e Immediato delle condizioni del paziente 2. Per Pazienti Diagnosticati ma gravemente Instabili 3. In Area Clinico-logistica, ovvero unattivit{ che gestisce pazienti in ricovero, soprattutto quando laboratorio e ospedale sono molto distanti

Controllo di qualit Ultimamente si discusso molto sulla qualit{ e lattendibilit{ che i POCT hanno , nei confronti dei test di laboratorio, ed per questo che si introdotto il TSN, ovvero il Testing Site Neutrally, ovvero un insieme di regole che devono valere sia a livello di laboratorio sia di POCT.

Strumentazione si avvale di: - Biosensori, ovvero dispositivi analitici che contengono un sistema biologico reattivo in intimo contatto con il trasduttore di segnale ( enzimi, anticorpi e batteri) - Reagenti in fase solida, infatti si usano tasselli di carta impregnati di reagenti su cui poi si va a depositare per capillarit il campione ed in seguito si misura il tutto tramite Fotometro o Biosensore - Dispositivi di alta precisione ( Microcomputer e Microelettronica)

Le -

Applicazioni in medicina ( pi frequenti) sono per la misurazione di: Urea - Alcool Glucosio - Droga Monossido di Carbonio - Gravidanza Danni Respiratori, Cardiaci e Renali

Cromatografia
Definizione La cromatografia fondamentalmente una tecnica che consente di separare sostanze chimiche fra loro diverse inizialmente in miscela, o meglio in soluzione, restituendole singolarmente nel tempo. Il principio alla base di tutte le tecniche cromatografiche si basa sulla propriet delle singole specie chimiche contenute nella miscela di ripartirsi in modo differente tra una fase detta stazionaria, ovvero una sostanza chimica che possiamo considerare virtualmente immobile, ed un mezzo di trasporto differente, costituito da unaltra sostanza chimica che si muove rispetto alla prima ed pertanto detta fase mobile. I componenti del campione interagiscono in maniera diversa con la Fase Stazionaria: - Alcuni Interagiscono fortemente ( trasportati piu lentamente dalla fase mobile) - Altri meno fortemente Esistono vari tipi di Cromatografia: 1- Cromatografia su Colonna, usata per la separazione delle Proteine , in cui la fase stazionaria costituita da un materiale che viene posto in un tubo di vetro o plastica (colonna), il campione da separare viene invece posto sulla sommit della colonna e la fase mobile , detta fluente, fatta scorrere lungo la colonna (alla fine lintero campione esce dalla colonna) 2- Cromatografia per Esclusione molecolare o filtrazione su Gel , in cui si separano molecole in base alle dimensioni. , si tratta di un tipo di cromatografia su colonna in cui la fase stazionaria consiste in particelle di Gel (di solito a forma di piccole sfere) rese porose(da Destrano o Agarosio o Poliacrilmaide). , quando si stratifica un campione sulla colonna, le molecole pi piccole sono intrappolate dai pori, mentre quelle pi grandi passano velocemente e sono eliminate eluite per prime , ogni gel ha il suo limite di esclusione che rappresenta il limite di grandezza di una proteina per entrare nei pori 3- Cromatografia per Affinit, nella quale si sfrutta un materiale polimerico come fase stazionaria ( materiale al quale legato covalentemente un composto detto ligando che lega selettivamente dei composti desiderati; il resto del composto viene allontanato dalla fase mobile) , Vantaggio di Ottenere Molecole Pure 4- Cromatografia a scambio Ionico, nella quale si usa una resina a scambio ionico che avr come ligando una carica: - Negativa Scambiatore di Cationi

- Positiva Scambiatore di Anioni , la colonna inizialmente equilibrata con tampone con pH e forza ionica idonei; poi sulla resina scambiatrice di ioni si inseriscono i Controioni ( i composti con carica opposta allo scambiatore si legheranno alla resina, quelle senza carica o con stessa carica saranno eluite) Strumentazione - Fase Mobile - Pompe ( ad elevata pressione, stabili, costanti e Riproducibili) per pompare la Fase Mobile - Colonna ( acciaio o vetro: 10-30 cm & di diametro: 4-10 mm) - Fase Mobile ( Particelle Pellicolari di 30-40 micrometri o Porose di 3-10 micrometri) - Rivelatori ( i pi importanti sono Assorbanza, Fluorescenza, Elettrochimici, a Serie di Diodi e Spettrometro di Massa) Applicazioni - Farmaceutiche ( Ricerca, Sviluppo, Controllo di qualit e Farmaco Genetica) - Clinica Chimica ( determinazione Hb Glicosilata, det. Componenti Hb minori e individuazione varianti Hb) - Biologia ( analisi proteine e AA, Separazione DNA,RNA e Polinucleotidi) - Ambientali ( H2O potabile , reflue e scarichi) - Alimenti ( Componenti alimenti Naturali, additivi alimentari e contaminanti)

HPLC ( Cromatografia ad alta prestazione o ad alta pressione) una tecnica cromatografica in cui il campione danalizzare iniettato allinizio della colonna cromatografica dove spinto attraverso la fase stazionaria dalla Fase Mobile applicando pressioni dellordine di centinaia di atm. Solitamente la fase Stazionaria costituita da Particelle molto ridotte ( da 3 a 10 Micrometri) e per questo motivo importante applicare unelevata pressione. Alla fine della colonna applicato un Rilevatore ( Spettrofluorimetro o Spettrometro di Massa) e un Calcolatore che permettono un analisi continua di ci che esce dalla colonna. Vantaggi: -Velocit di eluizione costante e regolabile - Velocit di esecuzione ridotta - Piccole quantit di campione necessarie - Accurata e precisa Svantaggi : - Elevato Costo

Microdialisi
Definizione una tecnica di Monitoraggio Tissutale del Metabolismo, ed applicata da alcuni anni alla clinica, in quanto permette lanalisi biochimica dei liquidi interstiziali. Meccanismo di Funzionamento Per la microdialisi viene usato un catetere flessibile dello spessore di un capillare che viene inserito nella parte specifica di tessuto o organo da cui vogliamo rilevare la concentrazione di determinati analiti. Tale catetere dotato di una Membrana Semipermeabile, attraverso la quale, mediante una pompa collegata a batteria, viene pompata una soluzione fisiologica che si arricchisce di metaboliti e altre sostanze del liquido interstiziale ,poi analizzate da un apposito analizzatore. In tal modo otteniamo un quadro Biochimico Clinico Completo del tessuto o organo che vogliamo monitorare. Applicazione Inizialmente concepita per la NeuroChirurgia, per monitorare lattivit{ cerebrale nei pazienti affetti da Trauma Cranico, in quanto il cervello non d nessun tipo di informazioni delle sue condizioni a livello ematico, la microdialisi permette anche di determinare indici del metabolismo energetico come Glucosio. Piruvato e Glicerolo. Nei Soggetti in morte cerebrale si osservano molto alti i Marker di danno Neuronale e del rapporto Lattato/Piruvato e a tempo stesso livelli molto bassi di Glucosio , prossimi allo zero. Oggi una metodica applicata alla Clinica ( anche al posto letto del paziente quindi POCT) e in vari campi tra cui i Trapianti dOrgano , Pediatria, Obesit{ e Pazienti Diabetici. La sua Applicazione per eccellenza la Terapia Intensiva Avanzata e la Medicina dello Sport in quanto garantisce un monitoraggio continuo e preciso , assolutamente non invasivo. I Vantaggi rispetto alle analisi del sangue sono che i metaboliti analizzati riguardano solo la sezione di corpo sotto osservazione, in modo tale da riscontrare pi velocemente i miglioramenti o peggioramenti del paziente.

Elettroforesi
Definizione Si basa sul movimento in un Campo Elettrico di particelle cariche verso lelettrodo di Carica Opposta. Le varie macromolecole hanno mobilit diversa in funzione della loro Carica, Forma e Dimensione. Per lelettroforesi vengono usati supporti diversi come la carta, un liquido , ma il pi usato il Gel, costituito da un Polimero di Agarosio o di Acrilamide.

La metodica di funzionamento prevede che il campione da analizzare venga posto nei pozzetti formati nel polimero di supporto e che venga successivamente applicato un campo elettrico che consenta lingresso delle proteine nel Gel e la loro Separazione. Dopo lelettroforesi il Gel viene colorato per mostrare la visualizzazione del campione separato. Tipi di Elettroforesi a) Elettroforesi SDS-Page, una variante dellelettroforesi su gel di poliacrilamide , in cui il campione proteico , prima di essere caricato sul Gel , viene prima trattato con il detergente Sodio DodecilSolfato (SDS) che si lega in maniera non specifica a composti in quantit proporzionale alla massa molecolare della sostanza. , questo processo nelle proteine va a rompere i legami Non Covalenti , rompendo quindi la struttura Terziaria e Quaternaria di queste ultime ( cosi le proteine possono essere studiate meglio per ogni sub-unit di cui sono composte) , di conseguenza con lanione SO3 tutte le proteine del campione hanno carica negativa. , quindi il detergente come se fungesse da setaccio offrendo maggiore resistenza a molecole grandi rispetto a quelle piccole. ( in quanto forma e carica sono le stesse, la dimensione della molecola rappresenta il parametro di separazione.) , sistema usato per valutare il PM. b) Focalizzazione Isoelettrica , che sfrutta il principio secondo cui proteine diverse hanno gruppi ionizzabili diversi, quindi di conseguenza anche punti isoelettrici differenti. ( valore di PM in cui la proteina non ha carica netta) , in questo caso nel gel viene creato un gradiente di PM mediante laggiunta di una miscela di sostanze provviste di cariche e quindi quando il composto migra nel gel sotto lazione del campo elettrico , incontra zone a PM differenti e si fermer nella zona in cui non ha carica netta (PI). , si possono cosi separare composti che hanno anche solo una carica di differenza. c) Elettroforesi Bidimensionale, tecnica che sfrutta le due elettroforesi precedentemente descritte sfruttando la focalizzazione isoelettrica in una dimensione e SDS-Page nella direzione perpendicolare alla prima. d) Elettroforesi Capillare, un elettroforesi in fase liquida , in cui un capillare di diametro molto piccolo ( 25-35 micrometri) riempito da un tampone appropriato. , le estremit del capillare pescano in 2 serbatoi separati , contenenti 2 elettrodi responsabili della generazione del campo. , allestremit{ Anodica del capillare si introduce una piccola quantit{ di Soluzione contenente il campione.( le molecole del campione migreranno a velocit differenti)

, tale tecnica rapida e automatizzata, con eccellente risoluzione, assenza di Colorante.

Applicazioni Cliniche 1) Vengono utilizzati per identificare proteine Plasmatiche ( Albumina, Globuline e Fibrinogeno) , ognuno delle quali presenter dei picchi caratteristici. 2) usato anche per le urine rappresentando il Gold Standard per le proteine di Bence-Jones. ( esse sono le catene leggere libere monoclonali rilevabili nelle urine , che se trovate sono un indicatore prognostico negativo)

Imaging molecolare
Lo scopo della medicina molecolare rilevare e monitorare Marker Biologici precoci di malattia , offrendo un approccio completamente diverso nella cura del paziente. Comprende 3 grandi branche: 1) Screening in vivo ( a livello di DNA e Proteine) 2) Terapia Molecolare 3) Imaging Molecolare, che permette la visualizzazione della funzione cellulare e il followup del processo molecolare negli organismi viventi senza perturbare gli eventi molecolari che in essa si verificano , molto utili per la diagnosi di patologie come Cancro, Malattie Neurologiche e Cardiovascolari Limportanza dellimaging molecolare sta nel fatto che permette la diagnosi precoce e lindividuazione dei cambiamenti che si verificano allinterno del tessuto, facilitando lo sviluppo dei medicinali e nellambito della ricerca permettendo inoltre di gestire e curare le malattie. Il medical imaging attualmente in grado , con varie tecniche di fornire informazioni su scala dal cm al micrometro (cellule) Le tecniche di imaging molecolare attualmente sono: - PET - MIR - f-NIRS

PET ( Tomografia ad Emissione di Positroni)


Definizione una tecnica di imaging diagnostico Non Invasivo, capace di generare immagini ad alta risoluzione relative alla funzioni e al metabolismo di un organo o apparato. La PET viene usata per valutare la funzione di un organo piuttosto che lanalisi della sua struttura anatomica. (a differenza invece dellRMN)

Utilit Utilizzando la pet il medico in grado di misurare la velocit del metabolismo regionale , il flusso sanguigno, la velocit di sintesi proteica e misurare i livelli di altri processi Biologici (enzimatici, ormonali e Farmacologici) Queste misurazioni sono utili per : - Guidare le Cure al Paziente - Monitorare Efficacemente la Terapia - Prognosticare degli stati Patologici

Strumenti su cui si Basa La pet si basa su Isotopi Instabili che emettono Positroni( preparati in un Ciclotrone). Il ciclotrone uno strumento costituito da 2 Semi-dischi che hanno carica opposta e nei quali viene praticato il vuoto: I. I 2 Semi-dischi sono posti tra i due poli di un potente elettromagnete ed il campo elettrico permette di accelerare le particelle cariche, mentre il campo magnetico deflette le particelle lungo orbite circolari. Invertendo la carica pi volte , le particelle sub-atomiche vengono accelerate ed inviate sul bersaglio scelto (costituito solamente da nuclei Stabili di Azoto, Carbonio e Fluoro) [Lincorporazione di un ulteriore protone nel nucleo ad opera del ciclotrone produce un isotopo instabile] A questo punto si sceglie una molecola di un supporto pi rappresentativa del processo biologico da studiare (ex. Glucosio) e la si marca con un Tracciante ,ovvero un atomo in grado di manifestare la propria presenza mediante lemissione di Radioattivit.[uno dei piu usati, soprattutto per il Glucosio il Fluoro 18, un isotopo radioattivo artificiale che , incorporato alla molecola di glucosio forma il Fluoro-DeossiGlucosio (18-FDG)] Una volta sintetizzato, il composto viene subito Iniettato nel paziente (a digiuno da 8h) e si attente il tempo necessario al prodotto di diffondersi nellorganismo (45 min) mentre il paziente fatto stendere su un lettino per essere sottoposto al processo diagnostico. Gli atomi radioattivi , che nel frattempo si sono concentrati nelle cellule da studiare, iniziano a decadere emettendo Positroni. Questultimi , dopo aver percorso nel corpo qualche mm, incontrano un elettrone di un altro atomo e , come succede ogni qual volta che una Particella e una Antiparticella si incontrano, danno origine ad una reazione di Annichilazione (ovvero si distruggono a vicenda sotto forma di Fotoni Gamma che si allontanano luno dallaltro in direzione opposta) [180 a 511 Kev] Queste Annichilazioni si producono diverse migliaia di volte al secondo nel corso dellesame. Dei Rilevatori posti a Corona intorno al Paziente registrano questi Impatti catturando i fotoni opposti emessi durante le annichilazioni e li trasformano in segnali elettrici che

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vengono analizzati da un Calcolatore che ricostruisce delle immagini in 203 dimensioni della zona analizzata.

Caratteristiche del Segnale Pet 1) il Metodo della rilevazione simultanea permette unesatta Localizzazione dei Siti in cui avvengono le emissioni dei raggi Gamma. 2) Il Segnale Pet dipende esclusivamente dalla concentrazione del Tracciante. ( lisotopo Radioattivo) 3) Il grado di Risoluzione quindi nellordine dei Millimetri, poi che la sede di Annichilazione del positrone che viene visualizzata con la Pet, pu trovarsi a parecchi mm di distanza dalla sede dorigine del Positrone stesso, le immagini mostrano lattivit{ di migliaia di cellule.

RadioFarmaco Nella PET applicata allo studio cerebrale, vengono usati : Radio-farmaci etichettati con uno degli emittenti di Positroni a breve Durata, solitamente C 11( con emivita di 20min) e F 18 ( con emivita di 110 min). Il radio-farmaco costituito da: un Vettore ( Farmaco) e da un RadioNuclide impiegato a scopo diagnostico o terapeutico. I Radio-Farmaci impiegati a scopo diagnostico sono detti anche Traccianti, in quanto sono impiegati per tracciare processi Fisiologici e Patologici. I principi del Radiofarmaco 1- Massa del Tracciante non superiore all1% della massa del sub-strato tracciato, per non perturbare i processi esaminati. 2- Elevata attivit specifica (per essere rilevabili a basse concentrazioni) 3- Comportamento Identico alle sostanze di cui tracciano il comportamento in vivo. 4- Spesso il tracciante ideale lanalogo radiomarcato della sostanza endogena. Un Radio-Tracciante deve esser inoltre: Puro, Stabile in soluzione e in vivo, con Elevata Attivit{ Specifica, alto Intrappolamento nella Sede di Interesse, Veloce nelleliminazione da sangue e con Basso Up-Take Aspecifico ( se finisce in altre sedi non deve provocare danni) Pet in Cardiologia Tecnica di riferimento nellindividuazione di zone di miocardio ancora vitali dopo un infarto. Studiando il metabolismo del Glucosio del miocardio possibile capire se una zona infartuata pu essere salvata da un intervento di vascolarizzazione. Pet in Neuroscienze e Psichiatria LFDG trova ampia applicazione nella diagnosi e valutazione di molte malattie neurodegenerative e in neuro-oncologia consentendo di studiare in vivo il metabolismo e la perfusione cerebrale regionale di cellule cerebrali normali e neoplastiche. Vengono studiati dalla PET: - Demenze, includono Alzheimer( PET a scopo Prognostico) , Parkinson( PET a scopo diagnostico) e Corea di Huntington.

Epilessie, nelle cui, la PET utile per localizzare larea Epilettogenica Corticale da Rimuovere neurochirurgicamente Psicosi, in cui la PET utile nella diagnosi differenziale della schizofrenia. Tumori, l80% della PET si effettua per lo studio dei tumori. , nelle cellule neoplastiche molti processi sono diversi dalle normali ( ex. Metabolismo di glucosio, ecc.) , le cellule neoplastiche hanno tipicamente un metabolismo di glucosio incrementato e una piu rapida proliferazione. Vascolari, in cui la PET ha contribuito alla comprensione dei meccanismi fisiologici.

N.B. Nello studio in vivo del metabolismo si usa il 18 FDG per studiare il metabolismo glucidico e lH2O per misurare il flusso ematico.

Risonanza Magnetica
Definizione una tecnica di Generazione dimmagini, usata generalmente a scopi diagnostici in campo medico e basata sul principio fisico della risonanza magnetica nucleare. Funzionamento Il fenomeno della risonanza magnetica nucleare si verifica nei nuclei degli atomi con PA e/o numero atomico Dispari poich questi posseggono un numero quantico di Spin diverso da 0. a) Somministrando energia sotto forma di Onde Radio, i nuclei immersi nel campo Magnetico Statico, passano ad uno Stato Energetico Superiore. b) Quando sinterrompe la sorgente energetica, i nuclei riemettono lenergia assorbita sotto forma di onde ,dette Segnali di Risonanza Magnetica, le quali hanno Lunghezza donda specifica per ogni nucleo. [la lunghezza donda del segnale di risonanza inoltre,varia in funzione del Microambiente Chimico nel quale immerso il nucleo; Fenomeno Chemical Shift che consente di individuare molecole diverse contenenti lo stesso Nucleo] Le indagini basate sul principio della RMN eseguibili sulluomo, si dividono in 2 categorie:

1- MRI ( Immagini di risonanza magnetica)


Le immagini di risonanza magnetica usano la Risoluzione Spaziale del forte segnale di risonanza del nucleo dellIdrogeno (1H) dellacqua per ricostruire immagini dettagliate delle strutture Anatomiche. Per essere capite necessitano una cultura squisitamente Radiologica.

Questa tecnica permette la generazione di immagini correlate alle propriet Fisico-Chimiche degli atomi didrogeno di cui il corpo ricco. Si basa sullacquisizione di unimmagini sfruttando i tempi di rilassamento ( R1 e R2) dei protoni di H2O, provocate dallinterazione con macromolecole presenti nei componenti cellulari ed extracellulari. Il segnale che viene rilevato dalla bobina il FID ( decadimento libero dallinduzione), segnale oscillante che decade nel tempo seguendo un andamento di tipo esponenziale. Mezzi di Contrasto Pi del 35% delle immagini MRI viene registrato con lausilio di mezzi di contrasto ( M. d. C.), che variando il tempo di rilassamento dei protoni dellH2 O, sono in grado di amplificare o creare il contrasto tra la regione Patologica ed il tessuto Sano. [Ex. Chelati di metalli paramagnetici, soprattutto di Gadolinio (Gd) i quali sono usati essenzialmente per processi patologici che si basano su alterazioni nella perfusione di organi e nella permeabilit della barriera Ematoencefalica] Preparazione Per ottenere unimmagini MRI bisogna: a) mettere il soggetto in un campo magnetico Statico b) Trasmettere onde radio al Paziente c) Spegnere il trasmettitore ed accendere il ricevitore di onde radio d) Convertire la radiazione a radio frequenza misurata in immagini Questa una tecnica non invasiva ed il Rischio pi serio consiste nellEffetto Proiettile che si crea quando materiali ferromagnetici ( Pacemaker, impianti acustici cocleari) si trovano allinterno dallapparato di RM.

2- MRS ( Spettroscopia di Risonanza Magnetica)


Utilizza i segnali pi deboli di altri nuclidi per ottenere informazioni quantitative e dinamiche su composti biochimici presenti nel tessuto in esame. Per interpretarli necessario una cultura biochimica. Ruolo della MRS nella diagnostica dei Tumori I principali nuclidi dinteresse chimico che presentano il fenomeno della risonanza magnetica sono il fosforo (31F) e lidrogeno (1H) legato a molecole organiche. In particolari MRS e FMR rappresentano un progresso rilevante per lo studio diretto delle attivit metaboliche e funzionali del SNC, organo difficilmente accessibile con altre metodiche e caratterizzato da una complessa regionalizzazione delle funzioni. MRS del Fosforo (31 f-MRS) Clinicamente tale tecnica utilizzata nella diagnosi delle malattie vascolari, infiammatorie degenerative e metaboliche del muscolo scheletrico , del cuore e dellSNC oltre che per la valutazione delleffetto delle terapie con la finalit{ di definire il miglior dosaggio per ogni paziente o della Citotossicit delle terapie anti-tumorali.

MRS del Protone ( 1H-MRS) Buona parte delle applicazioni cliniche riguardano le patologie del cervello umano. molto importante anche per la diagnosi e per il trattamento al Tumore della Prostata e Della Mammella.

MRS nel Tumore Cerebrale MRS ti consente di determinare la composizione biochimica del tessuto di un tumore. Tale genere di scansione raggiunge solo il 60-90% di precisione a seconda del tipo e del grado di neoplasia. Permette diagnosi differenziale nelle demenze neurodegenerative nella fase iniziale. MRS nel Muscolo Rappresenta un metodo non invasivo per lo studio del metabolismo intracellulare che consente osservazioni sequenziali durante lesercizio e a riposo. Lanalisi fornisce informazioni su importanti molecole implicate nellenergia muscolare: Fosfocreatina, Fosfato inorganico, componente Alfa-Beta-Gamma della molecola di ATP. Generalmente si valuta il rapporto tra Fosfocreatina e Fosfato Inorganico durante e dopo lesercizio fisico. ( in condizioni normale, tale rapporto aumenta lievemente e il pH muscolare si riduce Lievemente)

3- fMRI ( Risonanza Magnetica Funzionale)


La risonanza magnetica funzionale una tecnica di imaging biomedico che consiste nelluso dellimaging a risonanza magnetica per valutare la funzionalit{ di un organo o apparato ed spesso usata come sinonimo di risonanza magnetica funzionale Neuronale. Questa tecnica in grado di visualizzare la risposta Emodinamica correlata allattivit{ neuronale del cervello e del Midollo Spinale. Le variazioni di emodinamica ( flusso sanguigno ed ossigenazione sangue) nel cervello sono correlate allattivit Neuronale. Quando le cellule nervose sono attive, consumano ossigeno. Effetto di questo consumo un aumento del flusso sanguigno nelle regioni ove si verigica maggiore attivit neuronale. Il segnale dato da sangue nella risonanza magnetica nucleare (RMN) varia in funzione del livello di ossigenazione. Questi differenti segnali possono essere rilevati usando unappropriata sequenza di impulsi RMN, ad esempio il contrasto Blood Oxygenation Level Dependent (BOLD). Maggiori intensit del segnale BOLD derivano dalla diminuzione nella [ ] di Hb non ossigenata. Incrementi del flusso ematico cerebrale . porteranno ad un maggiore segnale BOLD, aumento dellattivit{ Neuronale. Il segnale BOLD generato dal complessivo afflusso sanguigno cerebrale da parte delle grandi arterie e vene, piccole arteriole e da parte dei capillari. Vantaggi: - Pu registrare segnali cerebrale in modo non invasivo senza uso di radiazioni ionizzanti( ex. PET) - Risoluzione Spaziale da 3 a 6 mm

Genomica
La scienza del Genoma, o genomica, lo studio della struttura, della composizione, dellorganizzazione e dellevoluzione del genoma. Al suo sorgere la Genomica si occupava solo della determinazione delle sequenze di nucleotidi del DNA, tuttavia ben presto gli interessi si sono rivolti anche alla funzione dei geni, delle proteine e particolarmente allorganizzazione Genica. Si distingue: a) Genomica Funzionale, che si occupa di tutte le ricerche che mirano a definire le funzioni dei geni contenuti in un genoma, studiandole a livello biochimico, cellulare e fenotipico allo scopo di assegnare a ciascun gene una funzione biochimica, fisiologica o di sviluppo ben definito. b) Proteomica, studia invece la funzione e la struttura delle proteine e delle loro interazioni. c) Trascrittomica, ovvero lo studio degli RNA e dei loro relativi livelli di utilizzo in un particolare tipo di cellula o tessuto d) Metabolomica, infine consiste nellidentificazione della struttura e della distribuzione di piccole molecole e metaboliti derivate dallespressione genica Utilizzando queste metodiche si sta cominciando a migliorare le conoscenze della fisiologia molecolare che alla base delle malattie come Cancro, Cardiopatie, Infiammazione Cronica, Malattie e Disordini Neuropsichiatrici. In definitiva, la Medicina Genomica si propone lidentificazione di nuovi biomarker molecolari che comportano la comprensione di meccanismi che determinano i sintomi della malattia e delle caratteristiche uniche che differenziano gli individui tra loro. La Metabolomica descrive il profilo chimico in termini dei metaboliti a basso peso molecolare presenti in tutte le cellule, tessuti, organi e fluidi biologici; le sue componenti, i metaboliti, possono essere visti come il prodotto finale dellespressione genica o dellattivit{ proteica (enzimi), che definiscono con il fenotipo biochimico di un sintomo biologico nel suo insieme, compreso luomo.

Proteomica
Lapplicazione della proteomica utile per lo sviluppo di terapia e metodi di diagnosi piu sofisticati per tumori: - E in grado di analizzare le proteine presenti nelle cellule tumorali dei singoli pazienti per costruire un catalogo delle molecole presenti nelle cellule malate ma non in quelle sane - molto utile per ricercare marcatori delle proteine correlate con tipi di tumori pi aggressivi e per sviluppare Test Diagnostici piu efficaci Lo scopo della proteomica quello di associare ad ognuna malattia , un profilo molecolare che ha alla base lattivit{ delle proteine stesse.

Inoltre la Proteomica: a) Identifica nuovi bersagli proteici per i farmaci b) Compara tessuti malati e tessuti tumorali o trattati farmacologicamente c) Determina marker di patologie nei fluidi corporei d) Analizza i tessuti nelle patologie tumorali Gli approcci allo studio della proteomica sono sostanzialmente divisi in 2 Strategie: 1) Strategia Top-Down, che formula una visione generale del sistema senza scendere nel dettaglio di alcuna delle sue parti , cerca di separare il pi alto numero di proteine intatte possibili tramite lelettroforesi bidimensionale, la cromatografia, la digestione delle proteine isolate e lanalisi dei peptidi tramite MS , i Vantaggi sono: - identificazione di variazioni delle proteine intatte e ricavarne informazioni qualitative e quantitative , gli Svantaggi sono: - Capacit di identificare meno sequenze e proteine 2) Strategia Bottom-Up, in cui parti individuali del sistema sono specificate nel dettaglio , in essa le proteine sono frazionate in peptidi che vengono separati con tecniche cromatografiche e analizzati tramite spettrofotometria di massa , i Vantaggi sono: - Alta efficienza di separazione cromatografica dei peptidi, di identificazione di sequenza e numero di proteine , gli Svantaggi sono: - Mancanza di informazioni nella variazione delle proteine intatte e di informazioni strutturali incomplete. Queste parti sono connesse tra loro in modo da formare componenti pi grandi, che vengono a loro volta, interconnessi sino a realizzare un sistema completo.