Senzori si Biosenzori

recunoastere moleculara ingineria proteinelor tehnologia receptorilor

BIOLOGIA

recunostere moleculara sinteza polimeri membrane imobilizare

CHIMIA

optica semiconductori

FIZICA

ELECTRONICA
optoelectronica tehnologia siliciului procesarea si controlul datelor

SENZORI BIOSENZORI
INSTRUMENTATIE microinstrumentatie discreta prezentarea datelor portabila

OPORTUNITATI DE PIATA in flux in vivo implantabile

ELECTRONICA MOLECULARA -bioelectronica -retele neuronale

Principiul recunoasterii moleculare

semnal

+
receptor analit complex

 Un biosenzor este prin

definitie un instrument (sistem) analitic care v v incorporeaza o componenta v v ANALIT biologic activa numita v (bio)receptor, integrata sau in receptor contact cu un traductor BIORECEPTOR fizico-chimic care transforma semnalul biologic intr-un semnal electric digital continuu sau semicontinuu. Semnalul analitic inregistrat TRADUCTOR este proportional cu compusul sau clasa de compusi, care prezinta AMPLIFICATOR interes analitic. DE SEMNAL In comparatie cu tehnicile de analiza clasice (cromatografia Reprezentarea schematica si spectroscopia) biosenzorii principiul de functionare al sunt instrumente analitice unui biosenzor. care prezinta o serie de avantaje precum detectia rapida, sensibila si selectiva a analitului.

DEFINIREA BIOSENZORILOR

BIOSENZORI CATALITICI Functionarea lor are la baza o reactie catalizata de biomolecule (enzime)

BIOSENZORI DE AFINITATE

BIOSENZORII

Principiul de functionare are la baza interactia analitului de interes cu componente biologice printro reactie de tip afin (AG-AC) BIOSENZORI METABOLICI Functionarea lor foloseste transformarea unui substrat, mediu,compus printro reactie metabolica (celule, microorganisme)

ANALITI SI REACTII CONTROLATE Biosenzorii pot fi clasificati dupa analiti, sau dupa reactiile pe care le controleaza: Monitorizarea directa a substratului reprezinta aplicatia principala a biosenzorilor si se refera atat la detectia substratului, cat si a compusilor care intervin sau se formeaza in timpul procesului biocatalitic. Un astfel de biosenzor poate fi aplicat cu succes pentru monitorizarea directa a activitatii enzimatice prin masurarea continua sau secventiala a produceri sau consumari unui anumit compus. Monitorizarea indirecta biosenzori bazati pe monitorizarea directa a compusilor organici sau anorganici (metale grele, fluor, cianuri etc.) si a altor substante ce inhiba sau influenteaza proprietatile biocatalitice ale elementului/receptorului biologic al biosenzorului.

Principiul de functionare

semnal

proba

receptor traductor

electronica

Evolutia constructiva
prima generatie a doua generatie a treia

generatie

(biochip)

Componentele principale
tehnicile chimice si bioanalitice
senzori chimici biosenzori bioanaliza

Receptori: enzime, celule, microrganisme, anticorpi, ADN, chemo-receptori etc. Traductori: electrochimici (ISE,O2, H2O2), optici, tranzistori (ENFET), termistori, piezoelectrici etc. Semnale: substante chimice, lumina, pH, temperatura etc.

Biosenzorii enzimatici
Biosenzori enzimatici/metabolici pot fi reprezentati in mod schematic

ca fiind alcatuiti din doua parti principale si anume: biocomponenta care asigura transformarea chimica a analitului si traductorul care transforma semnalul chimic intr-un semnal fizic, de obicei electric. Analitul difuzeaza din masa solutiei in stratul biocatalitic, unde are loc transformarea enzimatica. Biosenzori enzimatici reprezinta cel mai mare grup mult mai mare de biosenzori cu aplicatii practice.
Realizari: dezvoltarea unui senzor electrochimic continuu pentru detectia

fenolilor din matricele complexe; detectia dioxidului de sulf din curenti de gaz folosind electrozi serigrafiati; dezvoltarea unui biosenzor optic bazat pe reductaza in scopul monitorizari cu o limita de detectie a nitritilor de numai 0,93M, valoare sub limita admisa a concentratiei impuse de normele Comunitatii Europene, care este de 2,2 M.

Tipuri de biosenzori enzimatici

E + S k1

direct

E
traductor

k2

E-S

kcat

E + P

E1 E E
secvential
traductor traductor

E2
competitiv

reciclare substrat

E
traductor

E1

E2
traductor

reciclare dubla

Enzimele
Catalizatori biologici (conditii de lucru:37C, pH 6,5 - 7,5) Caracteristici: Vmax > 106 to 1012 x Vmax al reactiilor fara enzime Turnover: 107 substrat de molecule / minut Specificitate ridicata Independente din punct de vedere al modului de detectie

Structura:

Mari, macromolecule complexe, constand din proteine mari De obicei contin un group prostetic (unul sau mai multi atomi metalici)

Cinetica enzimatica

ES

k1 k1

k ES E P
cat

Reprezentare clasica

v vmax vmax/2

Km S

max S

Reprezentare Lineweaver-Burke

1/v

max

Km 1 max s

/vmax 1/[S]

Km

[S]

-1/Km

Enzime
Clasificare:

ES
+

k1 k1

k ES E P
cat

Oxidoreductaze Transferaze Hidrolaze Liaze Isomeraze Ligaze

Transfer de electroni Transfer de grupari functionale Transfer de grupari functionale in apa Transfer de grupari la sau de la duble legaturi Transfer de grupari in molecule Transfer de grupari de legatura

Imobilizarea enzimelor

De ce?
Pentru a asigura un contact si un raspuns maxim Reutilizarea biosenzorului Garanteaza stabilitatea enzimei Mai putin sensibile la interferente

Atentie la:
Denaturarea enzimei Pierderea activitatii enzimatice Sensibilitatea semnalului electrochimic

Immobilizarea enzimelor
Entrapare
E E E E E E

Adsorbtie

Legare covalenta

E
EE EE

EE EE

Micro-incapsulare

Reticulare
E E E E

E E E

Imobilizarea enzimelor
Entrapare
Un gel polimeric este adaugat la o solutie ce contine enzime.

EE EE
EE

E EE E

- Gel poliacrilamida - PEG -Agaroza

Dezavantaje:

Avantaje:

Usor, simplu si rapid

Bariere difuzionale mari Pierderea continua a activitatii enzimei

Poate fi aplicat oricarei enzime Stabilitate: 3-4 saptamani

Imobilizarea enzimelor
Micro-incapsularea
O membrana inerta este folosita pentru a prinde enzima in traductor

E E

- Strans legata de traductor - Se adapteaza usor - Este sigura - Stabilitatea si eficienta enzimei raman neschimbate (Acetat de celuloza, policarbonat, colagen, PTFE)

Stabilitate 1 saptamana

Imobilizarea enzimelor
Adsorbtia - Cea mai simpla cale, pregatire minima
E E

- Adsorbtie fizica, legaturi slabe (legaturi Van der Walls, ionice sau polare) - Depinde de substrat

Adsorbtia depinde foarte mult de: pH, temperatura solventului, taria ionica!Stabilitate: 1 zi

Imobilizarea enzimelor
Reticularea - Foarte utila pentru stabilitatea enzimelor adsorbite
E

- Agenti bifunctionali folositi: Glutaraldehida CH2CHO-CH2-CH2CHO

-Poate duce la distrugerea enzimei -Bariere difuzionale

Imobilizarea enzimelor
Legaturi covalente cu membrana sau cu traductorul - Legatura dintre o grupare functionala a enzimei si suport (i.e., traductorul)
E E

- Conditii pentru realizarea legaturii: temperatura scazuta, pH neutru

Stabilitate: 4-14 luni

Imobilizarea enzimelor
Legaturi covalente cu membrana sau cu traductorul

Cu bromura de cianogen

Prin grupari acil prin tratarea hidrazidelor cu acid azotos

Cu carbodiimida

Imobilizarea enzimelor
Legaturi covalente cu membrana sau cu traductorul

Cu clorura de cianuril

Prin diazotare si cuplare

Prin grupari tiol

Imobilizarea enzimelor
Electrozi modificati

Electrod pasta de carbune: Enzima este adaugata in matrice Electrod polimer: Polimeri cu conductivitate electrica
Poliacetilena, polipirol, polianilina... KCl: 0.1 M oxidatrea polipirolului la 0.8V vs SCE

Polimeri schimbatori de ioni

5 nm
SO3 - SO3 - SO3 SO3 SO3 SO3 -

SO3 -

SO3 - SO3 SO3- SO3 SO3 SO3 - SO3 -

SO3 -

SO3 SO3 - SO3 -

4 nm

SO3-

1 nm

Canal de Gierke, T.D. J. Membr. Sci.Micele307) (Hsu, W.Y.; interconexiune 1983, 13, inverse

Imobilizarea enzimelor
Caracteristici ale enzimelor imobilizate Datorita imobilizarii, eficienta enzimatica este diferita fata de cea din solutie

Interiorul membranei prezinta un pH aparent Accesibilitate

Membrana incarcata negativ

pH mai mic decat in solution

Actiune inhibitoare a speciilor acumulate in spatiul limitat

Schimbari ale valorilor Km

Exemple enzyme electrodes (2/7) Part IV: Examples ofde electrozi enzimatici
Electrod de oxigen L.C. Clark Jr and C. Lyons (1962) Ann. N. Y. Acad. Sci., 102, 29 GO x Glucoza+O 2 +H 2O Acid Gluconic+H 2O2
Catre inregistrator Electrolit Anod de argint Catod de platina Membrana de teflon
Membrana de celofan Glucozoxidaza in gel poliacrilamidic

- Prima generatie

- Scaderea concentratiei de oxigen

- Reducerea oxigenului: -0,7V

Example de electrozi enzimatici

Electrod de oxigen Trei tipuri diferite de reactii: Reducerea oxigenului-in reactii de oxidare catalitica

Glucoza+O2 +H 2O Acid Gluconic+H2 O2

Consum de oxigen prin oxigenare

GO x

Fenol + O 2 chinona+H 2O
Oxidarea NADH si NADPH

tirozinaza

NADP + salicilat + O 2 catecol+H 2O+NADP

salicilat hidroxilaza

Exemple de electrozi enzimatici Part IV: Examples of enzyme electrodes (3/7) Example
Electrod cu apa oxigenata
GO x

Glucoza+O 2 +H 2O Acid Gluconic+H 2O2

apa oxigen apa igen apa oxigen H 2 O2

H 2 O2 H 2 O2 H 2 O2

ee ee

Membrana GOX Acetat de policarbonat reticulat celuloza

Oxidarea H2O2: 0,7 V

Exemple de electrozi enzimatici

Electrod cu apa oxigenata

Se obtine un curent in platou proportional cu cantitatea de glucoza

Rata de formare a apei oxigenate = Rata de oxidare a apei oxigenate
Current (nA)

Factorul de limitare a curentului este dat de difuzia glucozei , limitarile nu sunt legate de enzima

Time (s)

Exemple de electrozi enzimatici

Utilizarea mediatorilor

Contacte catre potentiostat

Electrod de lucru tiparit

Gox imobilizata in membrana

Electrod de referinta tiparit

OPTRODE
produs de reactie analit

ENFET / IMFET

indicator colorat

Si SiO2 Al2O3

membrana selectiva

ER

Exemple de electrozi enzimatici

Utilizarea mediatorilor Reactia globala de oxidare a glucozei:
GOx Glucoza O2 H 2O Acid Gluconic+H 2 O2

si

De fapt are loc:

Glucoza GOx( FAD) Acid Gluconic+GOx( FADH 2 )

GOx( FADH 2 ) O2 GOx( FAD) H 2 O2
FAD: flavin adenin dinucleotidul, grupare prostetica ce asigura transferul de electroni din substrat Dependenta de oxigen este depasita prin folosirea unui mediator:

GOx( FADH 2 ) M ox GOx( FAD) M red 2 H

anod M red e M ox

si

Exemple de electrozi enzimatici

Utilizarea mediatorilor
CH2OH CH2OH

H2O + OH HO

O OH OH HO

OH

O O + H2O2 OH

Mediatori:

Ferocenul si derivatii sai Tetracianochinodimetan (TCNQ) Tetratiafulvalena (TTF)

Gox(FAD

Enzima

Gox(FADH2)

O gama larga de oxidoreductaze Electrodzi utilizati:

Electrodul modificat de pasta de carbon Electrod din carbon imprimat

2 Fe(cp)

Mediator
2 e-

2 Fe(cp)+

Electrode

Aplicatii
senzor electrochimic biosenzor enzimatic

Sensor

Biosenzori pe baza de anticorpi si receptori

Elementele de biorecunoastere bazate pe molecule de anticorpi si

receptori au arii de aplicatie si functionalitate similare. Analitii vizati in ultimi ani acopera un domeniu larg de aplicati de la antibioticele din lapte, monitorizarea generala a mediului pana la metalele grele. O arie de aplicati traditionala a imunosenzorilor o reprezinta detectia pesticidelor din probele de mediu si matrici alimentare. Realizari: dezvoltarea unui senzor potentiometric pentru simazina si aplicat in analiza alimentelor precum extractele din carne , lapte, rosi si castraveti. alti poluanti ai mediului incluzand si PCB-urile sunt detectati folosind electrozi serigrafiati. utilizarea unor imonosenzori dezvoltati special pentru analize patogenice, dar numai uni dintre acestia au demonstrat ca au limite de detectie excelente intr-un timp de analiza relativ scurt. Principalele directii in utilizarea acestui tip de biosenzori se indreapta spre obtinerea unor limite de detectie din ce in ce mai mici.

 Biosenzorii cu celule sunt

instrumente analitice care utilizeaza celulele ca biocomponenta imobilizata pentru a detecta sau a raspunde la interacti specifice cu substantele din mediu. Biosenzorii cu celule pot fi inclusi in clasa senzorilor metabolici - recunoasterea substratului de catre receptorul imobilizat (enzime in diferite grade de integrare, organele, microorganisme sau tesuturi) este urmata imediat de o conversie chimica la un produs corespondent care este detectabil. Intr-o ierarhie a biocomponentelor utilizate la realizarea biosenzorilor, celulele se afla la polul opus enzimelor, reprezentand gradul cel mai inalt de complexitate.

Biosenzorii cu celule
Enzime izolate cooperative Sisteme de enzime cuplate competitive secvential cu amplificare

Organite celulare (mitocondri, microzomi, perete celular) Celule bacteriene intacte Sectiuni de tesut (animal, vegetal, ciuperci) bacterii drojdii

Biosenzori celulari/microbieni
analit

O2

amperometric

NH3 H2S CO2 H+ potentiometric

semnal

oxigen

lumina caldura

optic termistor

componenta traductor biologica amoniac, uree, nitriti, sulfati, fosfati, fenol, naftalina, metan, clorofenol, acid formic, benzoat, Fe, Al, Hg, SO2

O2 H2O

H+ substrat

NH3 CO2

Biosenzori bazati pe tesuturi si organisme intregi (superioare)

Plante si tesuturi dar si organisme superioare intregi au fost utilizate in

constructia biosenzorilor. Numarul aplicatilor cu acest tip de biosenzori este minuscul in comparatie cu alte elemente de biorecunoastere, dar cu toate acestea sunt aplicabili pe aproape orice tip de sistem biologic ca element de biorecunoastere in biosenzori. Realizari : folosirea boabelor de soia si a raspunsului lor electropsihologic la ploaia acida si alte conditi de stress din mediu ca un potential sistem de biosenzori tesutul de cartof dulce a fost imobilizat intr-un electrod de grafit ca sursa de peroxidaza si utilizat pentru detectia hidrazinei din apa folosita la fierberea alimentelor chemoreceptori insectelor au fost inglobati cu tranzistori de silicon pentru determinarea compusilor organici din aer microalga Chlorella vulgaris a fost folosita pentru detectia metalelor grele prin imobilizarea celulelor pe un fascicul de fibre optice si pentru detectia acivitati fosfatazei alcaline.

 Datorita utilizari lor ca senzori pentru determinarea toxicitati si a genotoxicitati, biosenzori bazati pe celule intregi ca elemente de recunoastere au ca subiect de analiza produselor farmaceutice si contaminantii din alimente. Realizari: - dezvoltarea unui senzor bacterian prevazut cu un mecanism de corectie interna a raspunsului analitic prin introducerea unei gene aditionale raportoare; - folosirea biosenzorilor bazati pe detectia respiratorica pe baza de microbi si celule din plante pentru detectia CO2, NH2 - folosirea Pseudomonas sp. pentru detectia influentei microbiologice in unele procese metabolice.

structura ADN

tranductor piezoelectric

Recunoastere moleculara spatiala

imobilizare orientata

Producatorii comerciali
Life Scan (Milpitas, CA, USA) MediSense Inc. (Waltham, MA, USA) Oriental Electric Co.Ltd (Tokyo, Japonia) Pegasus Biotechnology (Agincourt,Ontario,Canada) Prfegertewerk Medingen GmbH (Feitel, Germania) ThermoMetric AB (Jrflla, Suedia) YSI (Yellow Springs, OH, USA)

Compania productoare

Analitul
Glucoza din snge Glucoza din snge (ExacTech) degradarea ATP (indicator al prospeimii petelui) indicator pentru prospeimea crnii i a petelui (MICROFRESH) Glucoz i lactat din snge (ESAT) Acizi organici, uree, antibiotice, metale grele,etc. Glucoz, alcooli, amidon

Tehnologia de realizare
Enzim GOD/POD Electrod cu enzime amplificare Electrod enzimatic Electrod enzimatic amperometric Electrod enzimatic Detecia modificrilor de temperatur n urma reaciei enzim-analit. Electrod enzimatic

Numeroi biosenzori au fost dezvoltati de laboratoarele de cercetare insa putine sisteme practice s-au bucurat de un succes comercial

Prezinta avantaje analitice

Specificitate mare Sensibilitate Ofer posibilitatea determinarii nu numai a compusilor chimici dar si a efectelor biologice Pot furniza atat concentratia totala cat si cea biodisponibila a substantei Portabilitate, miniaturizare, lucrul on-site, capacitatea de a masura substante direct din matricii complexa cu minim de prelucrari, raspuns rapid etc.

Aspecte practice la aplicarea biosenzorilor

Matricea probei poate afecta dramatic aplicarea biosenzorilor in medii reale Nivelul variat de carbon organic Alegerea solventilor organici Stabilitatea compusilor biologici

Tendinte actuale si perspective viitoare

Monitorizarea continua Determinarea multi-analit Nanotehnologii Miniaturizarea Elemente biosenzitive noi
- biosenzorii cu SPR (rezonanta suprafetei plasmei) constituie tipul cel mai de succes al instrumentelor comerciale

Ingrijorarea la nivel global privind impactul pe care contaminarea mediului

o poate avea asupra sanatatii publice si a mediului va conduce la:

- cresterea cererii pentru biosenzori cu detectie rapida - aparitia de aplicatii noi ale sistemelor de biosenzori bazati pe noi tehnologii

Validarea. Biosenzorii trebuie comparati cu sistemele analitice

conventionale in termenii sigurantei, sensibilitatii, selectivitatii, specificitatii determinarilor. Validarea poate implica unele dificultati: aspecte legate de stabilitatea elementului biologic sau a elementului imobilizat in/pe traductor.

miniaturizare
anod catod teflon
membrana enzimatica membrana filtranta 0,6-0,8 mm senzor implantabil potentiostat sistem analitic ER EL EA
detectie amperometrica

 Micro si nanobiosenzori reprezinta in mod cert una

din directiile viitoare in cercetarea din domeniul biosenzorilor. Posibilitatile par nelimitate atunci cand combinam aceste ari diferite si sperantele rezolvarii problemelor curente: prepararea probelor, portabilitate, detectia moleculelor, pana la viteze analitice veritabile si fiabilitate. Multe obstacole tipice pentru subsisteme si pentru senzori bioanalitici vor trebui depasite pentru a indeplini toate aceste sperante.
Realizari recente: dezvoltarea unui sistem complet automat de

Microbiosenzori Nanobiosenzori

preparare a probelor pentru detectia organismelor patogene. dezvoltarea unei biosenzor bazat pe fibre optice folosind bacteri recombinate pentru detectia toxicitati mediului. dezvoltarea unui microsenzor in care anticorpii au fost discret imobilizati pe o varietate de suprafete, prin aceasta asigurandu-se o separare a elementelor de biorecunoastere.

BIOCHIPUL -lab on a chip-

Aplicare: Sanatate, Economie, Legalitate, Religie

Biosenzorul identifica prezenta sau absenta a 33 de specii animale diferite in orice produs alimentar prin detectia secventelor AND specifice.

Bazati pe chipuri/arrays anticorpi, probe bazate pe activitate, suprafete activate chimic Eliberarea controlata
Electrozii

Detectie multipla

Biozenzori

Utilizarea biochipurilor cu ADN

IN ANALIZA CLINICA:
Detectia polimorfismului apo-lipoproteinei E din sangele uman Detectia genelor specifice legate de speciile de Mycrocystis Denaturarea oxidativa a ADN Detectia hibridizarii ADN legate de virusul hepatitei B Interactia intre ADN cu echinomicina, mitomicina, tiotepa, complexul Cu(II)-mitoxantrona Determinarea originii unor boli

Detectia aminelor aromatice toxice din apele reziduale Detectia aducturilor formate intre benzo[]pyrene si ADN Detectia interactiei intre ADN si carboplatin Detectia poluantilor mutagenici: atrazina, PCB, PAH, bifenoli,
daunomicina, aflatoxina B1

IN ANALIZA MEDIULUI: