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Metodi di separazione

I metodi di separazione di una miscela si basano sulle


differenti proprietà chimico- fisiche dei componenti della
miscela.

Cristallizzazione
Sublimazione
Distillazione
Estrazione
Cromatografia
ANALISI dei FARMACI 1

• Cromatografia

Teoria della cromatografia


Tecniche cromatografiche
Cromatografia liquida
– Cromatografia di ripartizione
– Cromatografia a scambio ionico
– Cromatografia di esclusione molecolare
– Cromatografia di affinità
Gas cromatografia

Strumentazione

2
Recenti progressi nelle scienze farmaceutiche (ricerca e
sviluppo di nuove molecole, studi di farmacocinetica e
metabolismo, controllo qualità nella produzione,) sono stati
possibili grazie agli sviluppi delle tecniche analitiche in genere,
ma soprattutto delle tecniche cromatografiche.

Tecniche cromatografiche

Metodologie analitiche in grado di separare, identificare,


determinare selettivamente i farmaci e le loro impurezze in
matrici semplici (materie prime) o complesse (forme
farmaceutiche, prodotti naturali)
Tecniche cromatografiche

Ruolo fondamentale nella caratterizzazione dei prodotti del


metabolismo dei farmaci e della loro determinazione nei fluidi
biologici.

Importanza fondamentale durante tutte le fasi di sviluppo di un


farmaco per studi di interazione farmaco-bersaglio molecolare.
TIPICHE APPLICAZIONI della CROMATOGRAFIA

 Farmaceutico
 Biochimico
 Alimentare
 Prodotti chimici
 Chimica ambientale
 Chimica Forense
 Medicina clinica
Cromatografia

I metodi cromatografici sfruttano le diverse affinità delle


molecole nei confronti di due fasi diverse: la fase
stazionaria e la fase mobile che viene fatta scorrere in
modo continuo sulla fase stazionaria
1. Caricamento della miscela 2.Eluizione con FM
Flusso di
liquido (FM)

3.Separazione dei componenti

4. Raccolta dei componenti separati


Impieghi
.

Analitici: esaminare una miscela ed i suoi componenti


Identificativi: determinare l’ identità di una miscela o dei
componenti (utilizzando standard di riferimento)
Separativi/purificativi: separare i componenti della mescela
in modo da isolare con elevato grado di purezza
quello/quelli di interesse per studi successivi
Quantificativi: determinare la quantità dei componenti
presenti nella miscela
Classificazione dei metodi cromatografici
Un metodo di classificazione dei metodi cromatografici si basa sullo stato della fase
mobile (liquido – gassoso)

Cromatografia

Cromatografia liquida Gas cromatografia


(fase mobile liquida) (fase mobile gassosa)

Sulla base dello stato della fase stazionaria si ha una ulteriore suddivisione

• liquido - solido • gas - solido


• liquido - liquido • gas - liquido
I metodi cromatografici, per la cromatografia in fase liquida,
vengono inoltre classificate in base al meccanismo principale di
separazione che interviene:

1) Adsorbimento
2) Ripartizione Le interazioni che si instaurano tra le
3) Scambio ionico sostanze da separare e le due fasi
cromatografiche (FM e FS) possono
4) Esclusione
essere:
5) Affinità  legami a idrogeno
 interazioni dipolo-dipolo, dipolo-dipolo
indotto, forze di Van der Waals,
 Interazioni lipofile
 interazioni ioniche
 interazioni steriche
 interazioni specifiche con un ligando
Tipi generali di Cromatografia
Classificazione sulla base
del supporto
• Planare
• Su Colonna

•Classificazione sulla base di


FM e FS
•Gas
•Liquida
• Sottocategorie sulla
base del meccanismo
di separazione
Meccanismo di ritenzione
1. Adsorbimento: la fase stazionaria è un solido in granuli e la fase mobile può essere
un gas o un liquido. La fase stazionaria è in genere un composto inorganico o un polimero
organico. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami deboli
(interazioni dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazione idrofobiche) con le molecole della miscela.

Fase mobile

Fase stazionaria (solido)

Adsorbimento: interessa solo la parte superficiale


Assorbimento: interessa l’intera massa dell’assorbente
2. Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido (supportato da un solido granulare inerte)
in cui le sostanze da separare si solubilizzano. La fase mobile può essere un gas o un liquido e
comunque deve essere immiscibile con la fase liquida. Durante l’eluizione le molecole si
ripartiscono dinamicamente nelle due fasi (stazionaria e mobile) sulla base delle caratteristiche
chimiche.

Fase mobile

Fase stazionaria (liquido)

supporto
3. Scambio ionico: la fase stazionaria è costituita da un polimero contenente siti attivi
ionizzati (cationici o anionici), i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica
dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio
tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione.

Fase mobile -
controioni
- - - - - -
+ + + Siti attivi + + +

Fase stazionaria Fase stazionaria

- -

- - - - - -
+ + + + + +

Fase stazionaria Fase stazionaria


4. Esclusione: tecnica per la separazione di macromolecole. La fase stazionaria è un solido
poroso o, più comunemente, un gel con i pori di dimensioni variabili. Le molecole dell’analita di una
determinata dimensione molecolare, penetrano nei pori dove permangono per un certo periodo; le
molecole troppo grandi, però, vengono escluse dai pori e perciò escono dalla colonna in tempi
brevi.
•5. Affinità:Utilizzata per purificare biomolecole che si assorbono in modo
SPECIFICO e REVERSIBILE ad un ligando immobilizzato sulla matrice.

molecole che si legano in


maniera selettiva e
reversibile a molecole dell’
analita presenti nel
campione:
Anticorpo
Inibitore enzimatico
Proprietà degli analiti Tecnica
Grandezza molecolare Cromatografia
gelfiltrazione/esclusione
molecolare
Carica/proprietà acido-base Cromatografia a scambio
ionico
Idrofobicità/idrofilia Cromatografia ad interazione
idrofobica (RP, HIC) e
idrofilica (HILIC)
Attività biologica Cromatografia di affinità e
specifica/affinità non IMAC
specifica
Le tecniche cromatografiche possono essere inoltre distinte in:

 Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una


superficie piana. Le tecniche principali sono la cromatografia su
strato sottile (Thin Layer Chormagraphy, TLC) e la cromatografia
su carta (paper chromatography).

 Cromatografia su colonna

• a bassa pressione: ampiamente utilizzata per separare i


componenti di miscele (scopi preparativi o semipreparativi).

• a pressione elevata (High Performance Liquid Chromatography,


HPLC): ampiamente utilizzata per l’identificazione e
quantizzazione di molecole.
Parametri cromatografici
La successione dei vari picchi, corrispondenti alle varie sostanze in uscita dalla colonna,
costituisce il 'cromatogramma '.

Il cromatogramma si
presenta come in figura,
dove in ordinate é riportata
la risposta del rivelatore e in
ascisse i tempi di uscita delle
varie sostanze.

Ogni picco è caratterizzato da:


- Altezza del picco. E’ la distanza fra il
massimo del picco e la sua base, misurata
perpendicolarmente all’asse dei tempi.
- Ampiezza del picco. E’ il segmento
delimitato sulla base del picco dai punti di
intersezione delle tangenti tracciate nei
punti di flesso di ambedue i lati.
ALCUNI CONCETTI ESSENZIALI

Selettività implica la capacità del sistema di eluire in


tempi differenziati specie chimiche/
macromolecole diverse

Efficienza capacità di accorpare le molecole


strutturalmente identiche in un’unica banda
compatta, che si traduce , nel tracciato, in un
picco unico molto stretto

Risoluzione implica la capacità del sistema di separare in


modo netto e distinto i diversi analiti
PARAMETRI FONDAMENTALI

Costante di distribuzione (Kd): Kd = Cs / Cm

Cs corrisponde alla concentrazione dell’analita di interesse


nella fase stazionaria e Cm nella fase mobile

La costante di distribuzione dipende dalla natura della fase mobile e della fase
stazionaria, ed è tipica di ciascun composto. Da essa dipende il tr
PARAMETRI FONDAMENTALI

Tempo di ritenzione (tr) tempo impiegato da ciascuna sostanza per fluire


dal sito di iniezione (tempo zero) al rivelatore e si misura all’apice del picco presente
nel tracciato cromatografico.
Si esprime generalmente in minuti e dipende principalmente da:
- Caratteristiche chimico-fisiche
- Affinità per la fase stazionaria

Volume di ritenzione (Vr) tempo di ritenzione (min) x Velocità di flusso


(mL/min)

Tempo morto (tm)


tempo di ritenzione di una
sostanza che non è trattenuta
dalla colonna (tipicamente il
solvente)
PARAMETRI FONDAMENTALI

Fattore di ritenzione (k) è correlato al tempo di ritenzione dalla formula:

k = (tr – tm)/tm

Per avere una buona separazione è necessario che il fattore di ritenzione sia >2

Dipende da: - natura della fase mobile


- natura della fase stazionaria
- granulometria e spessore della fase stazionaria (area superficiale)

Non dipende da: - lunghezza della colonna


- flusso
PARAMETRI FONDAMENTALI

Selettività (a) è espressa dall’equazione

a = k2(B)/k1(A)

Perché ci sia separazione cromatografica a deve essere > 1, con α = 1 sia ha coeluizione
In pratica è consigliabile che α sia > 1,2
PARAMETRI FONDAMENTALI
Efficienza è la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le molecole di
una data specie chimica con la stessa velocità in modo da formare bande strette e
quindi picchi stretti

Il parametro che descrive l’efficienza è


l’ampiezza della base del picco W
che sarà espressa in minuti o secondi

Un altro parametro utilizzato è il NUMERO DI PIATTI TEORICI N, che descrive


l’efficienza di una colonna cromatografica

N = 16 (tR/ wb)2
N= L/H
N=5,54 (tR/ wb1/2)2
Altezza equivalente al piatto teorico H = L / N dove L è la lunghezza della colonna
(una colonna è tanto più efficiente quanto più H è piccolo)
DA COSA DIPENDE L’EFFICIENZA CROMATOGRAFICA?
Principalmente dalla NATURA FISICA della FASE STAZIONARIA

1. Forma delle particelle. Sferica o irregolare. Le fasi sferiche danno una


maggiore efficienza (piatto teorico più basso di circa il 10-20%) e una migliore
riproducibilità di impaccamento.

2. Dimensione delle particelle. La silice irregolare, in quanto non


caratterizzata da una sola dimensione, ha una granulometria puramente nominale
che arriva come minimo a 10 µm. La silice sferica viene prodotta in granulometrie
fino a 3 µm. La più diffusa per scopi analitici è 5 µm. Scendendo con la
granulometria aumenta la contropressione della colonna.
3. Dimensione dei pori. Varia da 60 a 150 Å per scopi analitici tradizionali; da
300 a 500 Å per analisi di peptidi e proteine.

4. Area superficiale. Espressa in m2/g, questa risulta essere direttamente


proporzionale a k1 e alla capacità di carico ed inversamente proporzionale alla
dimensione delle particelle e dei pori.

5. Distribuzione e volume dei pori. Una distribuzione uniforme dei pori è


essenziale per avere picchi cromatografici simmetrici, perciò la curva di distribuzione
dovrebbe essere la più stretta possibile. La lunghezza dei pori influisce sul
meccanismo di separazione degli analiti in quanto nelle silici microporose la velocità
di ingresso e uscita dai pori, anche in rapporto alla velocità di flusso e alla viscosità
della fase mobile, dà un contributo importante all’allargamento dei picchi.
I pori dovrebbero essere corti e numerosi mentre dovrebbero essere il più possibile
assenti le comunicazioni tra singoli pori.
PARAMETRI FONDAMENTALI

Risoluzione Questo fattore tiene conto sia della selettività che dell’efficienza, e
indica il grado di effettiva separazione ottenuto per due sostanze in un processo
cromatografico
In termini matematici la risoluzione tra due picchi adiacenti (Rs) è espressa dal
rapporto fra le loro distanze e la semisomma delle rispettive larghezze alla base

tR2 – tR1
Rs=
w1 + w2
2

Per Rs= 1.5 la separazione è


considerata completa
Scarsa selettività ed efficienza
= picchi non risolti Aumento di efficienza

Aumento di selettività Aumento di efficienza ma


non di selettività
Variazione di N

Aumento del numero di piatti: aumento della lunghezza della colonna


riduzione dell’altezza equivalente del piatto

Variazione del fattore di ritenzione

Modifica della fase mobile : GC variazione della temperatura


LC variazione della composizione della FM
Variazione del fattore di ritenzione (k compreso tra 1 e 10)

Modifica della fase mobile : GC variazione della temperatura


LC variazione della FM
Variazione della FS

Variazione delle modalità di eluizione

Eluizione isocratica
Eluizione a gradiente
Figure di merito

TIPO DI FASE STAZIONARIA granulometria della FS, lunghezza e diametro


della colonna es: RP 18 (5 micron) 125 x 4,6 mm

FASE MOBILE

FLUSSO
lunghezza d’onda a cui è
RIVELATORE, se UV detector
stata effettuata l’analisi

TEMPERATURA (eventualmente)

A PARITA’ DI CONDIZIONI SOSTANZE UGUALI AVRANNO


TEMPI DI RITENZIONE UGUALI

E’ BENE RIFERIRSI SEMPRE AI


TEMPI DI RITENZIONE CORRETTI
Schema di un HPLC

Per la separazione dei composti in miscela giocano un ruolo chiave la


fase mobile (solvente) e la fase stazionaria (colonna).
L’identificazione del composto ha luogo grazie al rivelatore
(detector).