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Tecniche Cromatografiche

Seconda parte
Cromatografia per interazione idrofobica
(HIC)
un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di
proteine, le separa sulla base della loro idrofobicit di
superficie.
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni
idrofobiche, sottraendo le molecole d acqua ordinate
le proteine tendono cos ad interagire fra loro (salting out).
Nella HIC queste regioni cos esposte tendono ad interagire
con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.
una cromatografia che vantaggioso applicare ad esempio
dopo il frazionamento con ammonio solfato.
Leluizione pu essere fatta con forza ionica decrescente oppure
per spiazzamento con detergenti non ionici (Tween 20, Triton
X-100).
Potenziali svantaggi:
in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare
denaturazione.
non predicibile, pu applicarsi bene ad alcune proteine
ma non ad altre.
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Proteina
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Proteina
Molecole d'acqua
legate in modo ordinato
alla superficie idrofobica
Molecole d'acqua
liberate in seguito alla
interazione idrofobica
alla superficie idrofobica
O
O CH
3
OH
O
O
OH
CH
3
O
O
OH CH
3
CH
3
CH
3
O
O
OH
Butil Sefaroso
Octil Sefaroso
Fenil Sefaroso
Alchil Sefaroso
Cromatografia di affinit
OH
OH
OH
O
O H
O
OH
OH
O
O H
Resina
Braccio spaziatore
Ligando
Cromatografia
di affinit
Un ligando ad alta affinit
per la proteina legato alla
matrice
La proteina di interesse si
lega al ligando e viene
immobilizzata sulla colonna
Le altre proteine vengono
lavate via.
La proteina di interesse
viene eluita usando una
soluzione di ligando.
Metodi di eluizione nella cromatografia di affinit
Cromatografia di affinit
VANTAGGI
Alta affinit, costanti di
dissociazione nellordine del
mM, nM o anche pM.
Legame tutto o nulla:
Possibili molte variazioni
(affinity tags)
SVANTAGGI
Lingombro sterico spesso
abbassa la capacit
Il braccio spaziatore pu
avere influenza sul legame
Leluizione pu richiedere un
eluente specifico
Affinity tags
Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di
proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse legato un tag che
presenta affinit con un ligando:

TAG
GST
MBP
biotina
Poli-His
Proteina A

LIGANDO
Glutatione
Maltosio
Avidina
Nichel, Zinco
Anticorpi
Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per
cromatografia di affinit con i ligandi legati alla colonna.
Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag
attraverso proteolisi specifica.
Purificazione di anticorpi monoclonali
Cromatografia di affinit con anticorpi
Proteine di fusione (es. GST, glutatione-S-transferasi)
Immobilized metal ion Affinity Chromatography
(IMAC)
Matrici attivate per immobilizzare
uno specifico ligando
Protocollo generale di purificazione proteine
Obiettivi:
Cattura
Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio

Purificazione intermedia
Eliminare la maggior parte dei contaminanti

Polishing
Ottenere la massima purezza possibile
AC: affinity chromatography
IEX: ion exchange
HIC: hydrophobic interaction chromatography
GF: gel filtration
RPC: reverse phase chromatography
Desalting
Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi.
Cattura e purificazione intermedia mediante IEX
Esempio di cattura mediante HIC
1) Cattura IEX su resina Q
2) Purificazione con HIC
3) Polishing per GF
Gas cromatografia
(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
Schema a blocchi di un gascromatografo
Schema di iniettore
Colonna
Rivelatore a ionizzazione di fiamma
Esempio separazione gas-cromatografica di
urina di paziente con elevata aciduria
Accoppiamento di gascromatografo con spettrometro di
massa (sorgente a ionizzazione diretta)