SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

• Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o
quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione.
• E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato
enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici.
• Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un
particolare enzima.

CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO

 Controllo del pH con una soluzione tampone
 Controllo della temperatura
 Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli)

SAGGI DI ATTIVITA’ { CONTINUI

DISCONTINUI o A PUNTI FISSI
In un saggio di attività enzimatica misuriamo il prodotto della reazione, più di
rado misuriamo il consumo di substrato.
SAGGI CONTINUI
 Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui
 Per lo più usano metodi spettrofotometrici

• SAGGI DIRETTI
E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo
o fluorescente – fluoroforo)
Esempio:
O O-
C
C O + NADH
CH3

Piruvato Lattato
Deidrogenasi
(LDH)
O O-
C
H C OH
+ NAD+
CH3

Lattato
• SAGGI ACCOPPIATI

E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)

E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato)

L-treonina
Esempio: COO-
aldolasi COO-
O
+H N C H
3 +H N
3 C H + H3C C
H
H3C CH2 H
OH
L-treonina glicina acetaldeide
alcol
O
deidrogenasi OH
H3C C
H
+ NADH H3C CH2 + NAD+
acetaldeide alcol etilico

ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE

E1 E2
A B  C
[Etot] = 0,13 mM Vmax = 26  0,3 mM min-1

KM = 0,19  0,01 mM kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1

 SAGGI DISCONTINUI

Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo

1) Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o

fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono
diverse da quelle del saggio.

2) Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto

(o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio
HPLC, saggi biologici o immunologici.

1) Presenza di un fondo (background) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta

alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla
lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il
saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.
 ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI

PRELIEVO DI ALIQUOTE
AD INTERVALLI DI TEMPO
ENZIMA REAZIONE
+  La reazione viene bloccata con
IN
SUBSTRATO CORSO acido, denaturanti delle proteine,
calore, inibitori dell’enzima
 Il prodotto di reazione viene
quantificato con vari metodi

2a FASE
P-X metodi
colorimetrici
1a FASE X
Quantificazione
E1 + S  E1 + P con HPLC

E2 Trasformazione in un composto che può

essere quantificato colorimetricamente o
in altro modo

Metodi radioisotopici
Esempio:

1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA)

2a FASE GSA + DMBA     COMPOSTO COLORATO

[GSA] = 1 mM

Pendenza = vi (mM s-
[GSA] = 0,7 mM
1
)

[GSA] = 0,5 mM
[GSA] = 0,4 mM
 Come si misura l’attività di un enzima ?

Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo

v = - d [S] / dt = d [P] / dt

DO = lc c = DO/l
v = d[S]/dt
v =d[DO/l]/dt

La misura della variazione di DO nel tempo è la misura della velocità di reazione.

Quando si vuole misurare la velocità di una reazione enzimatica si misura la
variazione di DO nel tratto iniziale: in questo intervallo il reagente si trasforma in
prodotto alla massima velocità dopodichè la velocità diminuisce man mano che si
instaura l’equilibrio.
 In quali condizioni fare i dosaggi?
Per valutare l’attività di un enzima si lavora in eccesso di substrato
Vi = Vmax [S] / [S] + Km se [S] > > Km Vi = Vmax
(condizioni di Vmax )
Per dosare l’attività della LDH si misura la velocità iniziale della reazione
catalizzata dall’enzima per concentrazioni di piruvato (substrato) saturanti.
Enzimi in Biochimica Clinica
 Enzimi in diagnostica
Enzima Sorgenti
• Alanina amminotransferasi • Danni epatici
• Fosfatasi acida • Prostata
• Fosfatasi alcalina • Ossa
• Amilasi • Pancreas
• Creatina chinasi • Muscoli
 -glutammil transferasi • Fegato
• Lattico deidrogenasi • Varie sorgenti
 Gli enzimi presenti nel plasma sono stati distinti in due grandi categorie:
- enzimi plasma specifici
- enzimi non plasma-specifici.

Gli enzimi plasma-specifici svolgono la loro funzione nel plasma (gli enzimi
che regolano la coagulazione, la lipoproteina lipasi, la lectina-colesterolo
aciltransferasi, etc.).

Gli enzimi non plasma-specifici non esercitano nel plasma alcuna funzione
fisiologica.
Si distinguono in:
- enzimi di secrezione che si trovano nel siero perché secreti da alcune
cellule ghiandolari (amilasi, lipasi, fosfatasi) e vengono eliminati attraverso le
vie biliari o attraverso le urine.
- enzimi legati al metabolismo cellulare che sono presenti nelle cellule in
elevata concentrazione.
 Alterazione dei livelli plasmatici
dovuta a :
• Alterata sintesi
• Variazione della quantità di tessuto
• Variazione nella permeabilità cellulare
• Alterazione nella velocità di inattivazione/
degradazione
• Ostruzione di una normale via di escrezione
• Altri fattori che influenzano l’attività (inibitori,
carenza di cofattori...)
Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli
enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo
sanguigno.

Un aumento della loro concentrazione nel campione può

rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno
cellulare.
 Transaminasi

Le transaminasi sono enzimi ubiquitari, ma particolarmente abbondanti

in fegato e muscolo striato, che catalizzano reazioni di trasferimento di
un gruppo amminico da un aa. donatore su un -chetoacido accettore,
secondo lo schema generale:
AA1 + KA2  KA1 + AA2

Le transaminasi contengono un coenzima vitaminico, il piridossal

fosfato (PLP), che durante la catalisi riceve il gruppo –NH2 dal Glu
e diventa piridossamina fosfato (PMP)
Il meccanismo catalitico richiede la formazione di una base di Schiff
tra il gruppo aldeidico del PLP e il gruppo amminico dell’aa.
ALT, Alanina aminotransferasi (Sinonimo GPT): 0-35 U/L
L’enzima è localizzato principalmente nelle cellule epatiche dalle quali fuoriesce in
seguito a danni a carico della loro parete.
E’ un indicatore abbastanza specifico di un danno epatico senza però chiarirne la causa.

Esso catalizza la reazione reversibile:

L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> piruvato + L-glutammato

Per dosare l'ALT si utilizza una reazione accoppiata utilizzando l'enzima lattico
deidrogenasi che agisce sul substrato piruvato prodotto dall'ALT. Quanto più acido
lattico si forma dal piruvato ad opera della lattico deidrogenasi tanto più è presente
l'ALT.
Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm allo spettrofotometro misura
l'attività enzimatica dell'ALT

L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> L-glutammato + acido piruvico

 Dosaggio accoppiato
ALT, Alanina aminotransferasi (Sinonimo GPT): 0-35 U/L
Esso catalizza la reazione reversibile:

L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> piruvato + L-glutammato

Si aggiunge un enzima ausiliario (LDH) e il NADH

LDH
Piruvato + NADH + H+ <=> Lattato + NAD+
Si segue la scomparsa del NADH a 340 nm
AST, Aspartato aminotransferasi (Sinonimo GOT): 0-35 U/L
E’ contenuto in diverse cellule ma risulta particolarmente concentrato in particolari
distretti delle cellule epatiche (mitocondri) e del tessuto muscolare e cardiaco.

Il fatto che siano localizzati all’interno di subunità cellulari fa sì che si abbia , un rilascio
più lento dell’enzima nel sangue a seguito di danni che coinvolgono il fegato, ma ciò
indica anche un danno più grave alle cellule del fegato o dei muscoli.

catalizza la reazione reversibile:

L-aspartato + alfa-chetoglutarato ----------> ossalacetato + L-glutammato  

Per dosare l'AST si usa l'enzima malato deidrogenasi che utilizza come substrato
l'ossalacetato prodotto dall'AST. Quanto più acido malico si forma dall'ossalacetato ad
opera della malato deidrogenasi tanto più è presente l'AST.
Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm allo spettrofotometro misura l'attività
enzimatica dell'AST.

L-aspartato + alfa-chetoglutarato ----------> L-glutammato + ossalacetato 

ossalacetato  + NADH + H + Malato + NAD+
Metodi accoppiati: A a 340 nm
 ISOENZIMI
Gli isoenzimi sono proteine che catalizzano la stessa reazione, ma
presentano diversa carica elettrica, diversa solubilità, cioè diverse
caratteristiche chimico-fisiche.
 La determinazione di una forma isoenzimatica è importante nella
diagnosi di una specifica patologia.

I metodi di studio degli isoenzimi possono essere:

 di tipo generale consentono di determinare l’attività e/o espressione di tutti i possibili
isoenzimi presenti nel materiale biologico
 di tipo specifico diretti alla misura del singolo isoenzima di interesse diagnostico.
Tra i metodi generali troviamo l’elettroforesi, la cromatografia, l’ elettrofocalizzazione.

I metodi selettivi si basano sull’ inibizione selettiva di uno o più isoenzimi, seguita dalla
misura dell’attività residua.

Es di isoenzimi sono LDH, CK, ALP, ACP

 Gli isoenzimi possono differire
in:
• Parametri cinetici
• Specificità
• pH ottimale
• Caratteristiche di carica (pI)
• Sensibilità all’inibizione
• Sensibilità al calore (termostabilità)
Lattico deidrogenasi (LDH).(120-240 U\L)
Enzima della glicolisi presente nella maggior parte dei tessuti e in
concentrazione più elevata nel cuore, fegato, muscolo scheletrico,
rene, eritrociti.
E’ costituito da quattro monomeri (H, M) per cui può esistere in cinque
isoenzimi che differiscono per caratteristiche chimico-fisiche utili per
l’identificazione.

L'isoenzima M4 (LDH5) è predominante nei muscoli e nel fegato,

mentre H4 (LDH1) nel cuore e H3M1 (LDH2) negli eritrociti.
L'isoenzima cardiaco (LDH1) è facilmente riconoscibile perché è in
grado di catalizzare la trasformazione dell'α-idrossibutirrato in α-cheto-
butirrato.
 LDH (lattico deidrogenasi)
• Composta da 4 subunità di 2 tipi H (heart) e
M (muscle)
• 5 possibili combinazioni
H H LDH 1, LDH 2, LDH 3, LDH 4, LDH 5
H H H H M M
H H M H
H M M M M M
M M

• Catalizza la reazione
Ac. piruvico + NADH + H+  Ac. lattico + NAD+
 Isoforme LDH
e prevalenza nei tessuti
m. scheletrica
rene

5 4 3 2 1 5 4 3 2 1
m. cardiaca

fegato
5 4 3 2 1
emazie

5 4 3 2 1
5 4 3 2 1
 Valori elevati di LDH si osservano:
Nell’infarto del miocardio
In malattie epatiche
In anemie emolitiche e anemia perniciosa
Nella leucemia
In malattie muscolari (es. distrofia muscolare).
 Dosaggio dell’LDH

Dosaggio degli isoenzimi dell’LDH

La separazione degli isoenzimi avviene mediante elettroforesi su acetato di cellulosa.

La striscia di carta viene messa a contatto con acido lattico e NAD al termine della
reazione si forma piruvato e NADH.

Quest'ultimo sviluppa colore sulle bande isoenzimatiche in presenza di appositi

reagenti.

L'intensità del colore è proporzionale alla quantità plasmatica di isoenzima.

Le fosfatasi sono una classe di enzimi idrolasi che catalizzano la
rimozione di gruppi fosfato. In pratica, rappresentano i catalizzatori
della reazione di defosforilazione. In relazione al pH in cui operano, si
distinguono due tipi di fosfatasi: la fosfatasi acida (ACP) e la fosfatasi
alcalina (ALP).

Fosfatasi alcalina.
La fosfatasi alcalina (AP) è una glicoproteina a struttura dimerica
contenente zinco, che catalizza l'idrolisi a pH alcalino di numerosi
fosfomonoesteri. Essa è specificatamente associata a membrane
citoplasmatiche e microsomi delle cellule della mucosa dell'intestino
tenue e del tubulo convoluto prossimale del rene, degli osteoblasti,
degli epatociti e del sinciziotrofoblasto placentare.
Prodotta dal tessuto osseo , fegato, intestino, placenta.
Ne sono noti vari isoenzimi.

AUMENTA nell’accrescimento e in gravidanza (cond. fisiologiche), e

nell’epatopatie e nelle malattie osse (cond. patologiche).
Significato clinico della fosfatasi alcalina totale

Valori normali:
bambini fino a 15 anni <300 UI/L;
ragazzi da 15 a 18 anni <400 UI/L;
adulti <170 UI/L.

I valori elevati di bambini e adolescenti sono dovuti al

maggiore ricambio osseo. Valori superiori alla norma
possono essere indice diartrite deformante, carcinoma
biliare, epatite, malattia di Paget, metastasi epatiche e
ossee, alterazioni delle vie biliari, mieloma, mononucleosi,
osteomielite, rachitismo, sarcoidosi, fratture ossee,
insufficienza renale, sarcoma osteogenico.
Valori inferiori possono essere causati da anemia, età
avanzata, ipotiroidismo, malnutrizione.
Combinazione di metodi immunologici, elettroforetici e di
digestione enzimatica per distinguere le isoforme ossea ed epato-
biliare di fosfatasi alcalina.
 Creatin-fosfo-chinasi (CPK)
• Enzima deputato al trasporto dell’ATP dall’interno dei
mitocondri al citoplasma delle cellule muscolari
Si tratta di un enzima addetto alla produzione di energia (ATP) a partire dalla fosfocreatina

Interno del Membrana Citoplasma fibrocellula

mitocondrio mitocondriale muscolare

ATP ATP creatina creatina ATP

Fosforilazione Energia per

CPK
ossidativa CPK contrazione

ADP ADP fosfocreatina fosfocreatina ADP

 CPK - isoenzimi
• CPK formato da due diverse sub unità M (muscle) e B (brain)
• 3 possibili combinazioni isoenzimatiche (M-M M-B B-B)

M M M B B B

• Contenuto nei tessuti:

– Muscolatura scheletrica 96 4 0%

– Muscolatura cardiaca 80 20 0%

– Cervello 96%
 Gli isoenzimi della
creatina chinasi
• Dimero costituito di subunità B
(brain) e M (muscle)
• Nell’infarto aumentano precoce-
mente CK totale, CK-MB(2) e CK-
MM(3)
 Determinazione

• CPK totale con metodo cinetico

• CK-MB metodo cinetico con immuno-inibizione delle
subunità M e valutazione delle % del CK-MB rispetto al
totale
• CK-MB massa
CK–MB massa
• Maggiore sensibilità del test immunochimico rispetto a
quello di cinetica enzimatica
• Maggiore specificità dovuta ad Ab moc e mancanza di
interferenze
• Vengono comunque dosate le quote di CK-MB massa
provenienti dalla muscolatura scheletrica
• Marcatore sensibile, poco specifico
 CK-MB massa

• Incremento tra 2-6 ore, picco 10-24 ore,

rientro entro 3 gg.
• Utile (insieme alla Mioglobina) nelle prime 10
ore dall’inizio della sintomatologia
• Correla con estensione della zona infartuata
 Differenza misurazione
ponderale-funzionale
• Nella misurazione ponderale si misura la
quantità di sostanza presente attraverso reazioni
chimiche o immunochimiche indipendentemente
dalla sua capacità di svolgere o meno la corretta
funzione
• Nella misurazione funzionale si valuta l’attività
della sostanza in esame non considerando
eventuali molecole alterate e quindi non
funzionanti
 Metodi di misurazione
• Ponderale
– Unità di misura espressa in peso/volume:
• mg/dL
• Moli/litro
• Ecc.
• Funzionale
– Unità di misura espressa in:
• Unità/Volume [U/L (misurazioni di cinetica enzimatica)]
• Tempo (misurazione coagulative)
• Ratio oppure % di attività rispetto a un campione di
riferimento (misurazione coagulative rispetto a pool di plasmi di
riferimento)
• Ecc.
 Esempi di diverse misurazioni
• Ponderali:
– Glicemia mg/dl
– Creatininemia mg/dl
– CEA ng/mL
– CK-MB massa ng/mL
– Troponina ng/mL
• Funzionali
– CPK U/L
– AST U/L
– Tempo di protrombina secondi
Esempio di utilizzo degli isoenzimi CK-MB ed LDH1 nella diagnosi di
laboratorio dell’ infarto del miocardio

Enzima Inizio Picco Basale

CK-MB 4h 18h 48h

AST 8h 24-48h 4 giorni
LDH1 24h 3 giorni 12 giorni
Valutazioni
cliniche e
quadro
enzimatico
 Andamento temporale
dei marcatori cardiaci

CK-MB massa

Myo

cTpn

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 24 36 48 60
 Gli enzimi sono proteine dotate di attività catalitica

L’enzima accelera la velocità di formazione del

complesso ES abbassando l’energia di attivazione

E+S ES EP E+P

L’attività enzimatica si esprime in unità,

quantità di enzima che catalizza la
conversione di una micromole di substrato
per minuto in condizioni definite di temperatura, pH e
concentrazioni di substrato.
 Come si misura l’attività di un
enzima ?
• Velocità di reazione: quantità di substrato
trasformato nel tempo
v = - d [S] / dT = d [P] / dT
• Si misura la variazione nel tempo di una
qualsiasi grandezza correlata alla
concentrazione del substrato o del prodotto
 Che cos’è l’attività specifica

Attività specifica = attività / quantità totale proteine

In quali condizioni fare i
dosaggi?
 Velocità iniziale
• La velocità dipende dal substrato, ma [S]
cambia nel tempo (si consuma)
• per semplicità, la cinetica viene studiata in
condizioni iniziali (tempo = 0)
• in queste condizioni,
– [S] >> [E]
– [P]  0 (la reazione inversa da P a S è
trascurabile)
 Precauzioni nei dosaggi enzimatici
• Substrati, tamponi, ecc. di alta purezza
• Anche la prep. enzimatica non deve contenere
composti che interferiscono col saggio
• L’enzima dovrebbe essere stabile
• Controllo di pH e temperatura
• La velocità deve essere costante nell’intervallo
considerato (v0)
• Reazioni accoppiate: enzima ausiliario puro e
non limitante, se possibile con Km piccola
• Escludere/valutare la presenza di reazioni non
enzimatiche
 “Stopped-flow Spectroscopy”

Fluorescence
Optical
Absorbance
Path
Cell

Mixer Stopping
Syringe

Oxyferryl-Hb Indole

Drive
 “Stopped-flow Spectroscopy”

Fluorescence
Optical
Absorbance
Path
Cell

Mixer Stopping
Syringe

A B

Drive
 Equazioni cinetiche

v = k [A] [B] (Equazione 1)

[B] ~ [B]0

Metodo per isolamento

k‘ = k [B]

v = k‘ [A] = - d[A] / dt (Equazione 2)

Andamento cinetico relativo alla scomparsa di A

[A] = [A]o e-K't

Concentrazione A (M)

Tempo [s]
 Calcolo della costante bimolecolare

K' [s-1]

α tang α = K'/[B] = K

Concentrazione di A [M]