Alessandro Medda Laboratorio di Biochimica

RELAZIONE SULLA CROMATOGRAFIA PER SCAMBIO IONICO

Nel terreno di coltura del nostro Pleurotus sono presenti numerose sostanze di diverse dimensioni e di diversa natura. Il nostro intento quello di estrarre la nostra proteina laccasi (Lc), l'enzima in grado di degradare la lignina. La metodologia utilizzata per la purificazione della laccasi la cromatografia per scambio ionico. Poich le sostanze inquinanti sono numerose e diverse, impossibile effettuare una purificazione completa in un solo passaggio e per questo sono state effettuate 3 esperienze: cromatografia a scambio ionico su massa; cromatografia a scambio ionico su colonna con alta forza ionica; cromatografia a scambio ionico su colonna con bassa forza ionica. Le cromatografie per scambio ionico si basano su delle interazioni reversibili che si creano tra specie chimiche dotate di cariche opposte. I supporti su cui avviene la cromatografia hanno la capacit di dissociarsi come acidi o basi; tali supporti sono per insolubili e per questo necessario che ogni gruppo carico abbia nelle proprie vicinanze uno ione di segno opposto a bilanciare la carica totale. Per questo avviene che con il passaggio di determinate sostanze si avranno degli scambi ionici che faranno si che alcune sostanze restino intrappolate all'interno del supporto (scambiatore). Cromatografia a scambio ionico su massa Questo procedimento il primo che si effettua e serve a eliminare i vari pigmenti che possono inquinare l'enzima. Viene effettuato su un gel di costi bassissimi e non su colonna perch le sostanze inquinanti sono numerosissime e potrebbero rendere impossibile rigenerare la resina della cromatografia su colonna che di solito molto costosa. Per effettuare questo passaggio si utilizza un gel di fosfato di calcio Ca4(PO4)2(OH)2 formato da cloruro di calcio e fosfato trisodico; esso viene tamponato con acido fosforico sciropposo a pH 6 e il gel recuperato tramite centrifugazione. La soluzione enzimatica viene poi salata (NaCl 0.2M) per innalzare la forza ionica ed evitare interazioni della Lc con il gel e viene amalgamata a quest'ultimo. Questo gel utile per l'eliminazione dei numerosi pigmenti acidi presenti nel terreno di coltura. La miscela enzimatica con una prima purificazione pu essere estratta attraverso semplice centrifugazione. Cromatografia a scambio ionico su colonna con alta forza ionica Il secondo passaggio avviene su una colonna su cui viene caricata la fase stazionaria e successivamente la fase mobile; al termine presente un setto per trattenere la fase stazionaria ed un rubinetto. Le sostanze che interagiscono con la fase stazionaria

vengo rallentate in maniera differente ed per questo possibile raccogliere separatamente le diverse sostanze. Il supporto su cui viene effettuata la cromatografia la DEAE (dietilaminoetil) cellulosa, una resina molto idrofila ma allo stesso tempo insolubile e scambiatore di tipo anionico. Fattore molto importante da tenere in considerazione il pH a cui avviene la cromatografia: essa deve avvenire in condizioni non estreme affinch la laccasi non venga denaturata e che essa sia dissociata in una sola isoforma. Il pH giusto per la purificazione della Lc in DEAE cellulosa 6. E' proprio per questo che la prima sostanza che deve fluire all'interno della colonna un tampone a pH 6. Il tampone utilizzato in questo caso il tampone potassio fosfato (K2HPO-KH2PO4), costituito da 3 ioni: K+, HPO42-, H2PO4-. Successivamente viene fatta fluire una soluzione di NaCl 0.2M in maniera che le sostanze pi acide della laccasi interagiscano con la DEAE cellulosa e che noi possiamo raccogliere la laccasi ancora leggermente inquinata ma molto meno. Il sale aumenta la forza ionica e la concentrazione indicata sufficiente perch la laccasi non interagisca con la resina. Ora la colonna viene rigenerata con numerosi lavaggi e poi conservata in etanolo. Cromatografia a scambio ionico su colonna con bassa forza ionica. L'ultimo passaggio della purificazione simile al precedente solamente che in questo caso la laccasi rester in un primo momento attaccata alla resina e far fluire tutte le sostanze inquinanti rimaste. Questo possibile perch la forza ionica viene abbassata notevolmente facendo passare all'interno della colonna dell'acqua deionata e per diluizione della soluzione enzimatica; poi la laccasi, che interagisce con la DEAE lasciando andar via tutte le impurit. In seguito la laccasi purificata viene separata dalla colonna con l'aggiunta di NaCl 0.2M .E' possibile verificare l'effettivo passaggio del nostro enzima versando una piccola quantit di siringaldazina in una navicella assieme ad una goccia di soluzione che esce dal rubinetto della colonna. La lc viene raccolta in un contenitore separato.