-S.I.C.S.I.

(VIII ciclo)-

Laboratorio di chimica analitica

Prof. S. Andini

Cromatografia ad esclusione
molecolare
Destinatari:
• alunni di una classe IV di un Istituto Tecnico ad indirizzo
Chimico-biologico

Tempi:
•2 lezioni da 50 minuti + 1 esercitazione di laboratorio
Prerequisiti:
•Cenni di chimica organica, i legami chimici e le interazioni
intermolecolari, generalità sulla cromatografia, TLC,
cromatografia su gel di silice, spettroscopia UV-VIS e legge
di Lambert-Beer

Obiettivi:
•Conoscere il principio base della cromatografia ad esclusione
molecolare ed applicazioni della tecnica
Tecnica di separazione basata sulla diversa
affinità che i componenti di una miscela
possono manifestare nei confronti di
determinate sostanze o materiali. I vari
componenti di una miscela tendono a
ripartirsi in modo diverso tra due fasi.
Una fase rimane fissa (la fase stazionaria), ed è
generalmente un solido o un gel, un'altra fase,
liquida o gassosa, (la fase mobile) fluisce su di
essa trascinando con sé in quantità maggiore i
componenti della miscela che le risultano più
affini.
Quando fu scoperta la Cromatografia?
(dal greco: chroma, colore + graphein, scrivere)

Scoperta da un botanico russo per separare i pigmenti delle foglie

mediante l’uso di assorbenti solidi
 Cricamento del prodotto

Camera di sviluppo
 Cromatografia su colonna
La cromatografia su colonna è un sistema analogo alla TLC, ma
gravitazionale per cui le sostanze che “corrono” di più si
trovano nel basso della colonna e vengono eluite per prime.
Cromatografia di adsorbimento su colonna
(in fase diretta)
Cromatografia per gel filtrazione o
esclusione molecolare
Si basa sulle diverse dimensioni dei soluti da separare

Granulo di resina

Miscela da separare

pori

Beaker di raccolta
 Le
molecole
piccole
penetrano
dentro i
granuli di
gel e sono
ritardate

Le molecole
più grandi
eluiranno più
velocemente
Fase stazionaria: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte)
Fase mobile: solvente

I soluti di dimensioni minori possono penetrare nei pori, e migrano più lentamente

I soluti le cui dimensioni superino il diametro dei pori (limite di esclusione), ne

rimangono esclusi, e passano più velocemente attraverso gli spazi interstiziali dei
granuli
 Esclusione Molecolare

Frazioni

E’ tra i metodi di separazione più “gentili” grazie alla mancanza di interazioni

chimiche con la resina
Sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, a seconda del
LIMITE DI ESCLUSIONE e dell’ INTERVALLO o CAMPO DI
FRAZIONAMENTO

Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (kD)

SephadexIl limite
G-10 di esclusione
Destrano è il peso molecolare della più
0.05 - 0.7
piccola
Sephadex G-25 molecola incapace
Destrano di penetrare nei pori
1 - 5del gel,
Sephadex G-50 per cui ne viene esclusa.
Destrano 1 - 30
Sephadex G-100 Destrano 4 - 150
Sephadex G-200 Destrano 5 - 600
L’intervallo di frazionamento è l’intervallo dei pesi
molecolari
Bio-Gel P-2 delle molecole frazionate. Il limite superiore
Poliacrilammide 0.1 - 1.8 è
Bio-Gel P-6
costituito Poliacrilammide 1-6
proprio dal limite di esclusione.
Bio-Gel P-10 Poliacrilammide 1.5 - 20
Bio-Gel P-30 Poliacrilammide 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Poliacrilammide 5 - 100
Bio-Gel P-300 Poliacrilammide 60 - 400

Sepharose 6B Agarosio 10 - 4000

Sepharose 4B Agarosio 60 - 20000
Sepharose 2B Agarosio 70 - 40000
 Fasi stazionarie
Sephadex
Struttura del destrano
E’ un carboidrato polimerico
ramificato. La ramificazione determina
le dimensioni dei pori della matrice.Può
essere ulteriormente ramificato
impiegando epiclorina

Epicloridrina:

Sephadex LH-20
I gruppi idrossilici sono alchilati
Limiti di esclusione 0.7-800 KDa
 Fasi stazionarie
Bio-Gel

Struttura della poliacrilammide

 Fasi stazionarie
Sepharose

Struttura dell’ agarosio

E’ un polisaccaride derivante da
particolari alghe rosse ed è
costituito da residui alternati di
D-galattosio e 3,6-galattosio Limiti di esclusione 10-40000 KDa
anidro

cellulosa

Epicloridrina:
 Come si prepara una colonna
cromatografica?
Scelta della fase stazionaria.

La resina è venduta in forma DISIDRATATA. È necessario perciò

idratare la resina (RIGONFIAMENTO) con acqua o con il solvente della
miscela proteica.

 Il caricamento della colonna va effettuato lentamente, onde evitare

la formazione di bolle d’aria.

 Si sovrappone alla fase stazionaria la soluzione della miscela

proteica da separare

Si fa fluire la fase mobile (soluzione tampone) per gravità

 Si raccoglie l’eluato in provette e lo si analizza attraverso un

rivelatore, in genere uno spettrofotometro
 Come facciamo a conoscere quali frazioni
contengono le proteine?
Le proteine totali possono essere identificate misurando l’assorbanza a
280 nm in uno spettrofotometro grazie alla capacità degli aminoacidi
aromatici di assorbire la luce a questa lunghezza d’onda.

Grafico di eluizione
Picchi

A280

Frazione

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

A280 00025200025852002520
Frazione

Quanto più sono lontani i picchi tanto più la matrice è selettiva nei
confronti del campione
 Quali frazioni contengono la proteina di
interesse?
Si può misurare l’attività enzimatica eseguendo un dosaggio su ciascuna
frazione che contiene proteine; l’attività maggiore misurata è generalmente in
corrispondenza di picchi.

Frazione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

A280 00025200025852002520

Risultati del
dosaggio

E’ possibile a questo
A280 punto scartare I
tubi dove non è
presente l’attività di
interesse e riunire
quelli in cui è
presente attività
Frazione #
 Applicazioni della cromatografia ad esclusione
molecolare

Purificazioni Determinazione Mr Dissalazione Concentrazione

Dal momento che le proteine e Soluzioni di

Esempi di Stima della altre macromolecole biologiche sostanze ad
sostanze massa hanno dimensioni molto piu’ alto peso
purificate con molecolare grandi rispetto ai sali e ad altre molecolare
questa tecnica: piccole molecole, questa tecnica possono
e’ particolarmente efficiente essere
proteine, enzimi,
per concentrate
ormoni, anticorpi,
acidi nucleici, • rimozione di sali aggiungendo
polisaccaridi. Sephadex G-
• cambio di buffer 25 secco
Molto usata
• rimozione di marcatori (ad es.
anche per
radioattivi) dalle macromolecole
separare le forme
marcate
monomeriche da
quelle
polimeriche.
La filtrazione su gel puo’ essere usata per
stimare la massa molecolare

Log Molecular weight

Elution time or volume