CHIMICA ORGANICA I CON LABORATORIO

Modulo 2
Chimica e tecnologie per l’ambiente e per i materiali. Curriculum: Ambiente, Energia, Rifiuti
Università di Bologna – Polo di Rimini – a.a. 2015/2016

Metodi
cromatografici
Introduzione

Come in una gara le auto si “separano” poiché si muovono a velocità

differenti, le miscele di diversi composti possono essere separate
tramite processi cromatografici.
Introduzione

La cromatografia nasce come metodo per la

separazione di pigmenti colorati per opera del
botanico russo M. Tswett (1903) che mise una
soluzione di pigmenti estratti dalle piante con
etere di petrolio in un tubo riempito di calcio
carbonato. Notò che aggiungendo altro etere di
petrolio, i pigmenti venivano separati in bande di
diversi colori come “i raggi di luce dello spettro”.
Chiamò quindi questa preparazione chromatogram
e la tecnica chromatographic method dalle parole
greche Chromo or Khromatos (colore) e Graphein
(scrittura).
Metodi cromatografici

La cromatografia può essere definita come una distribuzione selettiva delle

sostanze da separare tra una fase stazionaria ed una fase mobile

La fase stazionaria può essere un solido oppure un liquido, mentre la fase

mobile è un gas oppure un liquido.
Metodi cromatografici

La separazione di miscele di composti nei vari componenti dipende dalle loro

proprietà fisiche e dalle loro interazioni con le due fasi che vengono
impiegate nelle cromatografia: la fase stazionaria (quella che non si muove!)
e la fase mobile (quella che si muove attraverso la fase stazionaria!).

I concetti da tenere ben presenti per capire la cromatografia sono:

•le forze intermolecolari
•la solubilità
•La pressione di vapore

I componenti di una miscela possono interagire con la fase stazionaria in

vari modi:
Possono essere adsorbiti dalla fase stazionaria
Possono essere disciolti nella fase stazionaria
Possono reagire con la fase stazionaria
Metodi cromatografici

I metodi cromatografici possono essere suddivisi secondo

il tipo di processo fisico che è responsabile della separazione

il tipo di tecnica (apparecchiatura) utilizzata.

tipo di processo fisico

Proprietà Tipo di cromatografia

Adsorbività Adsorbimento

Solubilità Partizione

Carica Scambio ionico

Dimensione molecolare “Size exclusion”

Interazioni specifiche Affinità

 tipo di tecnica

• gascromatografia (GC, la fase mobile è un gas solitamente elio o azoto),

• cromatografia su strato sottile (TLC, la fase stazionaria è un strato sottile

e uniforme di solido applicato ad una lastra di supporto),

• la cromatografia su colonna (la fase stazionaria è solida, la fase mobile è

liquida),

• la cromatografia su carta (la fase stazionaria è liquida (acqua) adsorbita

dalla carta carta e la fase mobile è liquida,

• la cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC, la fase mobile è un

liquido che viene forzato attraverso una colonna contenente la fase
stazionaria).

• la cromatografia in «fase inversa», la fase stazionaria è un liquido non

polare o una cera non polare applicato o adsorbito su un supporto inerte o
una silice modificata e la fase mobile è un liquido polare.
Cromatografia di adsorbimento

L’adsorbimento è un processo in cui molecole di un soluto interagiscono con la

superficie di un solido, chiamato adsorbente.

• I più comuni adsorbenti sono la silice (SiO2) e l’allumina (Al2O3)

• I siti dell’adsorbente nei quali si ha interazione con il soluto
vengono definiti “siti attivi”
• Le interazioni che si realizzano possono essere di diverso tipo:
dipolo-dipolo, legami idrogeno, ecc.
Cromatografia di adsorbimento

silice (SiO2) allumina (Al2O3)

Cromatografia di adsorbimento

A fm
B

Anche l’eluente, la fase mobile,

compete per i siti attivi
dell’adsorbente.
Il componente del soluto che
realizza interazioni più blande,
(in questo caso A), viene
spostato preferenzialmente,
mentre il componente che dà
interazioni più forti (B) viene
spostato più lentamente.
Cromatografia su strato sottile (TLC)

Thin Layer Chromatography

La fase stazionaria è composta da un

sottile strato di adsorbente su un
supporto solido. La fase mobile è un
liquido chiamato eluente. È un
processo di adsorbimento.
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1. Il campione da esaminare viene depositato sulla lastrina.

2. La lastrina viene introdotta nella camera per TLC, che contiene sul
fondo la fase mobile. L’eluente sale per capillarità muovendosi sulla
fase stazionaria e trascinando, in diversa misura, i costituenti del
campione.
3. Quando il fronte dell’eluente è prossimo al bordo superiore, la lastrina
viene rimossa dalla camera e sviluppata per rivelare le macchie.
Esecuzione di una analisi TLC

1. Selezionare il tipo di fase stazionaria: le più comuni sono a base di silice o di

allumina a diverso grado di attività. Esistono diversi tipi di supporto solido
che fa da base per lo strato sottile di adsorbente: vetro, alluminio, plastica.
2. Seminare la lastrina con il campione da analizzare: una soluzione del
campione da analizzare (ca. 0,1 – 5%) in un solvente volatile viene depositata
mediante un sottile capillare di vetro sulla lastrina.
Esecuzione di una analisi TLC
3. Sviluppo del cromatogramma.
cromatogramma Dopo che il solvente di semina è evaporato, la
lastrina viene immessa nella camera di sviluppo che contiene l’eluente. Il
livello dell’eluente non deve coprire le macchie di campione sulla lastrina.
Quando l’eluente ha raggiunto l’80-95% dell’altezza, la lastrina viene rimossa
ed asciugata. Il livello raggiunto dal solvente (fronte del solvente) viene
segnato con una matita per essere misurato. La camera viene mantenuta
satura dei vapori dell’eluente per mezzo di un rivestimento di carta.
Esecuzione di una analisi TLC

4. Visualizzazione del cromatogramma.

cromatogramma Nella maggior parte dei casi le macchie
sono incolori. Le lastrine vengono spruzzate con sostanze che reagendo con le
macchie danno luogo a prodotti colorati rivelandone la posizione sulla lastrina.
Nelle lastrine commerciali è omogeneamente spalmato un indicatore di
fluorescenza. Quando la lastrina viene esposta ad una luce UV di una
opportuna lunghezza d’onda (254 o 366 nm) l’indicatore assorbe questa luce
ed emette nel visibile (luce verde o blu).

Se le sostanze che costituiscono le macchie assorbono questa luce, la loro

presenza viene rivelata da macchie scure, in quanto nessuna luce raggiunge
l’indicatore che pertanto non emette nel visibile.
 Esecuzione di una analisi TLC

4. Visualizzazione del cromatogramma.

cromatogramma Le sostanze che si impiegano per
visualizzare le TLC sono le più svariate e dipendono dal tipo di composti in
esame.
http://www.reachdevices.com/TLC_stains.html
Esecuzione di una analisi TLC

5. Analisi del cromatogramma. Dopo che le macchie sono state visualizzate

vengono identificate dal loro rapporto al fronte. Questo è definito come il
rapporto la distanza percorsa dalla macchia in esame e la distanza percorsa
dall’eluente.

distanza percorsa dalla macchia X

Rf  
distanza percorsa dall'eluente Y
Esecuzione di una analisi TLC

L’ Rf dipende da diverse variabili:

• Lo spessore dell’adsorbente
• La sua natura dell’ adsorbente ed il grado
di attivazione
• La fase mobile
• La quantità di campione applicata

Per questo gli Rf sono difficili da riprodurre e

non sono un criterio di identità per le
sostanze. Inoltre sostanze diverse, in
determinate condizioni, possono presentare lo
stesso Rf. Nei casi dubbi si fa una analisi in
parallelo con uno standard.
Scelta delle condizioni di una analisi TLC

I due elementi più importanti che influenzano l’analisi TLC sono la forza
adsorbente della fase stazionaria e la polarità della fase mobile

Costante
Eluente
dielettrica
Adsorbenti in ordine di forza
decrescente Etere di petrolio 1,89

Carbone attivo Cicloesano 2,02

Allumina (Al2O3) Toluene 2,38

Silice (SiO2) Dietil etere 4,34

Calcio fosfato Etile acetato 6,02

Diclorometano 8,93
Terre diatomee
Acetone 20,7
Amido
Il grado di attivazione di allumina e silice può Metanolo 32,7
essere modulato per incorporazione di
quantità definite di acqua. Acqua 80,1

Per modulare la polarità dell’eluente molto spesso si ricorre all’uso di miscele di

solventi
Scelta delle condizioni di una analisi TLC

• La polarità dell’eluente dovrebbe essere paragonabile a quella delle sostanze da

separare.

• L’attività dell’adsorbente dovrebbe essere bassa per sostanze polari ed alta

per sostanze non polari.

Idrocarburi alifatici R–H

Alchil alogenuri R–X
Idrocarburi insaturi R – CH = CH – R
Idrocarburi aromatici Ar – H
Alogenuri aromatici Ar – X
Polarità

Eteri R–O–R
Esteri R – COOR
Chetoni R – CO – R
Aldeidi R – CHO

Amidi R – CONH2

Amine R – NH2

Alcol R – OH
Fenoli Ar – OH
Acidi carbossilici R – COOH

Amino acidi H3N+ – CHR – COO-

Esempi di separazione

Per illustare la
relazione fra
polarità e successo
della separazione…
Esempi di separazione
Cromatografia su colonna

• La colonna viene riempita con un adsorbente

• L’adsorbente deve essere “impaccato”, cioè
omogeneneamente distribuito all’interno della
colonna, per evitare la formazione di percorsi
preferenziali per l’eluente.
• L’impaccamento viene fatto a secco (applicando
una pressione di gas inerte) o più comunemente
ad umido.
• In quest’ultimo si prepara una miscela
eterogenea dell’adsorbente con l’eluente che
viene versata in colonna. L’eluente in eccesso
viene fatto uscire battendo dolcemente la
colonna per impaccarla. Lo strato di adsorbente
non deve mai essere mandato a secco.
• Il tipo di adsorbente e di eluente vengono
determinati mediante analisi TLC del campione
da separare.
Cromatografia su colonna

Sopra l’adsorbente viene messo un sottile strato di sabbia che ha lo scopo di

facilitare il caricamento del campione senza mandare a secco l’adsorbente.
In (b) il campione è stato caricato per mezzo di una pipetta. In (c) il rubinetto
in fondo alla colonna viene aperto per far fare in modo che il campione vada a
secco sulla SABBIA. In (d) un po’ di eluente fresco viene immesso e (e)
mandato a secco sulla sabbia per completare l’adsorbimento del campione. In (f)
si aggiunge eluente fresco in quantità necessaria per l’esecuzione della colonna.
Cromatografia su colonna

• Il liquido in uscita dalla colonna viene

raccolto in provette.
• La presenza della sostanza separata
viene rivelata mediante analisi TLC
delle singole provette.
• Si può anche accoppiare un sistema
di rivelazione-registrazione
strumentale
Materiale per approfondire

http://www.reachdevices.com/Chromatography.html

http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/chrom1.htm
Cromatografia di partizione
La separazione è governata dal coefficiente di partizione delle sostanze da
separare, ovvero dalle loro solubilità. La fase stazionaria è un liquido mentre la
fase mobile è un gas o un liquido immiscibile con la fase stazionaria.

A
[ A] S [A]m=conc. fase mobile
K mA/ s  m  mA
[ A]s S s [A]s=conc. fase stazionaria

[S]m=solubilità fase mobile

[ A] [S]s=solubilità fase staz.
[ A]s  A m
Km/ s
Cromatografia di partizione

[ A]m S mA [ A]m
K A
  A [ A]s 
m/s
[ A]s S s K mA/ s
Isoterme di partizione per due composti A e B.
In questo caso KA > KB, quindi A si sposta più
velocemente di B

Partizione dei due composti A e B

tra la fase fissa e la fase mobile.
In questo caso KA > KB, quindi A si
sposta più velocemente di B ed
esce prima dalla colonna.
 Gas-cromatografia
La fase mobile è un gas (gas di trasporto) che scorre in una sottile colonna riempita
con la fase stazionaria, composta da un solido od un liquido.

Il tempo di ritenzione (tR) dipende da

diversi fattori tra cui: il punto di
ebollizione, la massa molecolare, la polarità.
 Il campione da analizzare viene
vaporizzato nell’iniettore quindi
entra in colonna

Il flusso di gas in uscita dalla colonna viene inviato al detector. I due più utilizzati sono a
ionizzazione di fiamma (FID) e a conducibilità termica (TCD). Nel primo le sostanze che
escono, bruciando creano degli ioni che vengono intercettati da un elettrodo generando una
corrente che viene inviata al detector.

FID TCD

Il secondo (TCD) si basa sulla diversa conducibilità termica tra gas di trasporto e sostanze
che escono. Quando dalla colonna escono delle sostanze le due resistenze non si trovano più
alla stessa temperatura quindi varia la resistenza e si crea una corrente che viene misurata
dal detector.
Analisi quantitativa
L’area del picco che si ottiene è proporzionale alla concentrazione della sostanza nel
campione da analizzare.

Il picco viene approssimato ad un triangolo A  h  w1 2

Picco fortemente asimmetrico: si suddivide il picco in

diverse aree triangolari o rettangolari. Oppure si “pesa”
il picco sulla bilancia analitica

Picchi sovrapposti: si cerca di individuare la larghezza

a metà altezza w1/2
Cromatografia liquida (HPLC)

• In questa tecnica la fase mobile (un liquido)

viene forzato mediante pompe attraverso la
colonna che contiene la fase stazionaria.
• Rispetto alla GC permette l’analisi di
sostanze non volatili e termicamente labili.
• Manca un detector di tipo generale come lo
sono il FID o il TCD per la GC. Esistono
diversi detector (a UV, a indice di
rifrazione, a fluorescenza, ecc.).
• Pertanto a seconda del campione da
analizzare ogni volta deve essere
opportunamente scelto il detector da
utilizzare.
Cromatografia liquida (HPLC)

HPLC: High performance liquid chromatography

E’ una tecnica di analisi molto efficace e molto usata.
I principi su cui si basa sono gli stessi della TLC e della colonna
cromatografica.
Possiamo considerare questa tecnica come un’evoluzione molto performante
della colonna cromatografica.
La fase mobile viene spinta in colonna tramite le pompe e attraversa una fase
stazionaria costituite di particelle finemente suddivise (0.003 mm). Le piccole
dimensioni delle particelle forniscono una elevatissima area superficiale e
quindi le interazioni tra la fase stazionaria e le molecole eluite migliorano
notevolmente, favorendone la separazione. Vengono inoltre minimizzati i
fenomeni di diffusione aumentando l’efficienza. Ovviamente questo causa una
velocità di flusso molto bassa che può essere superato solo con l’ausilio della
pompa per spingere la fase stazionaria.
I detector, estremamente sensibili, permettono l’analisi di quantità minime di
sostanza dando modo di rilevare la presenza di impurezze presenti in tracce.
Tutto questo fa si che l’HPLC sia una delle principali tecniche di analisi.
HPLC SYSTEMS
1) Serbatoi solvente
3) Valvola per gradiente
5) Pompa
7) Loop di iniezione
9) Colonna
11) PC per acquisizione dati
2) Degasser per i solventi
4) Camera di miscelazione dei solventi
6) Valvola di iniezione (inject /load)
8) Guard column (precolonna)
10) Detector
12) Bottiglia di raccolta (scarti o raccolta)
Colonne HPLC

La colonna è ovviamente il cuore del sistema. La qualità della separazione

dipende dalla fase stazionaria usata. Sono costituite da tubi di acciaio del
diametro di 2-7 mm e della lunghezza di 10-60 cm passando da colonne
analitiche a colonne semi-preparative o preparative. La pressione a cui
possono essere sottoposte dipende dal materiale di cui è costituita la fase
stazionaria così come i solventi con cui possono essere utilizzate.

Normal phase

Reverse phase

Chiral phase
Revers phase chromatography

La fase stazionaria è un solido non

polare: per esempio una silice
modificata con delle lunghe catene
idrocarburiche.
La fase mobile (eluente) deve essere
più polare della fase stazionaria:
solitamente si usa acqua in miscele
di con solventi in essa miscibili come
etanolo, metanolo acetonitrile.

In questo caso anche l’ordine di uscita dei composti è OPPOSTA: i

composti poco polari vengono trattenuti maggiormente rispetto a quelli più
polari.
Detector HPLC

I detector più utilizzati per i sistemi HPLC sono:

UV-Vis: (diode-array: permette di lavorare su tutto lo spettro contemporaneamente).

Fluorescenza: (molto più sensibile, irraggiamento e quindi misura della luce emessa a
90°).

Indice di rifrazione: differenza IR tra solvente e campione per applicazioni specifiche o

nella preparativa.

Spettrometro di Massa: electronspray ionization (ESI).

Evaporative light scattering: misura la luce “diffusa” dalle particelle di analita rimaste
dopo la nebulizzazione ed evaporazione della fase mobile. (utile per analiti che non
assorbono all’UV-visibile)