Cromatografia

La cromatografia comprende una serie di tecniche

analitiche di separazione di miscele complesse nei
singoli componenti basata sulla distribuzione
differenziale degli analiti fra due fasi, una mobile l’altra
fissa.
•Separazione
•Identificazione
•Determinazione
 Cromatografia
• Planare
• Su Colonna

•Gas
•Liquida

•Elettrostatico,
•Dipolo-dipolo,
•Van Der Waals
•Scambio ionico
MODALITA’ di SEPARAZIONE in CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Cromatografia in fase inversa
E’ di gran lunga la tecnica di separazione in cromatografia liquida più
utilizzata nei laboratori moderni, e la sua popolarità è confermata dall'ampia
scelta di colonne attualmente prodotte

Cromatografia in fase normale

Prima dello sviluppo delle fasi legate in fase inversa, la cromatografia in fase
normale era la tecnica di separazione più comune. Essa si basa
sull'interazione tra gli analiti ed i gruppi funzionali polari sulla superficie della
fase stazionaria, che è più forte quando la fase mobile è costituita da
solventi non polari.

HILIC (cromatografia ad interazione idrofilica)

La cromatografia ad interazione idrofilica viene praticata da molto tempo,
ma il termine HILIC è diventato di uso comune solo in tempi recenti. Gli
analiti sono composti molto polari come, ad es. metaboliti, carboidrati o
peptidi.
L'HILIC può essere considerata un'estensione della cromatografia in fase
normale nell'ambito delle fasi mobili acquose.
Descrittori cromatografici

•Volume di ritenzione (Vr)

•Volume morto (V0)

•Fattore di ritenzione (k)

•Selettività (a)

•Risoluzione (R)
 Migrazione differenziale

t t V V
Fattore di capacità k r k o
r o

t V 0
0

V V k
Selettività a  r ,1 o 1

V V k r,2 0 2
 Allargamento della banda cromatografica

2 2 2
tr tr tr
N N  16 2 N  5,55 2
 2
w w 1/ 2
L
N
HEPT
CALCOLO DEI PIATTI TEORICI
 RISOLUZIONE
1  a 1  k
Si può ricavare la relazione che
R N  B
correla la risoluzione alla
4  a  kB  1
ritenzione e alla selettività:  ’ 

scarsa risoluzione
picchi non separati

buona risoluzione dovuta a buona efficienza

picchi stretti

buona risoluzione dovuta a buona selettività

picchi distanti

scarsa risoluzione dovuta ad un basso

fattore di capacità

picchi non separati

FATTORE DI SIMMETRIA
Allargamento della banda cromatografica

1. PERCORSI MULTIPLI
2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE
3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE
4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE
STAGNANTE
5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE
STAZIONARIA
 PERCORSI MULTIPLI

dp= diametro delle particelle

l = costante legata all'impaccamento

DIFFUSIONE LONGITUDINALE

Lunga permanenza in colonna

Breve permanenza in colonna

g =coefficiente legato alla distribuzione delle particelle nella fase fissa

Dm=coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile
v=velocità lineare media di flusso della fase mobile
 1. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE
2. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE
3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA

dp =diametro delle particelle

Dm=coefficiente di diffusione
v =velocità lineare media di flusso
=fattore dipendente dall'impaccamento e dal tipo di colonna
spessore della fase stazionaria permeabile al soluto
 HPLC Vantaggi
Rapidità e precisione in analisi quantitative
Tipico tempo di analisi di 5 - 20 min.
Precisione (errore < 0,5 - 1%)

Analisi automatizzate
Usando autocampionatori ed elaboratori di dati

Alta sensibilità
Limite di rivelabilità (LOD) di ng a pg

Recupero del campione quantitativo

Tecniche preparative da μg a g

Adatta a diversi tipi di campioni

Può analizzare più del 60% di tutti i composti
 TIPICHE APPLICAZIONI
della CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE

 Farmaceutico
 Biochimico
 Alimentare
 Prodotti chimici
 Chimica ambientale
 Chimica Forense
 Medicina clinica
 METHOD DEVELOPMENT

Step 1: Define method objectives and understand the

chemistry (10%)
Determine the goals for method development (e.g., what is
the intended use of the method?), and to understand the
chemistry of the analytes and the drug product.

Step 2: Initial HPLC conditions (20%)

Develop preliminary HPLC conditions to achieve minimally
acceptable separations. These HPLC conditions will be
used for all subsequent method development experiments.

Step 3: Sample preparation procedure (10%)

Develop a suitable sample preparation scheme for the drug
product
 METHOD DEVELOPMENT

Step 4: Standardization (10%)

Determine the appropriate standardization method and the
use of relative response factors in calculations.

Step 5: Final method optimization/robustness (20%)

Identify the “weaknesses” of the method and optimize the
method through experimental design.
Understand the method performance with different
conditions, different instrument set ups and different
samples.

Step 6: Method validation (30%)

Complete method validation according to ICH guidelines
Metodo analitico HPLC

Composizione fase mobile

Ritenzione Chimica
pH e dell’analita
Selettività
e
della fase
stazionaria
Temperatura
 Tecniche di ottimizzazione
Variazione dell’ampiezza del picco
La risoluzione migliora con l’aumentare della radice quadrata del numero
dei piatti teorici, ma questo aumento può comportare un eccessivo
aumento dei tempi d’analisi a meno che l’aumento di N non sia realizzato
attraverso la riduzione dell’altezza del piatto e non attraverso l’aumento
della lunghezza della colonna.

• Diametro delle particelle

• Diametro della colonna
• Spessore di fase stazionaria liquida (LC)
• Temperatura della colonna (GC)
• Ottimizzazione del flusso
 COMPOSIZIONE DELLA FASE MOBILE

LC
Eluizione isocratica= stessa composizione di fase mobile
durante l’eluizione
Eluizione a gradiente=variazione della composizione
della mobile durante la corsa cromatografica
GC
Eluizione isotermica= stessa temperatura durante
l’eleuizione
Eluizione a temperatura programmata= aumento della
temperatura durante l’eluizione
 ORDINE DI POLARITA’ DELLE FASI MOBILI

H2O> ACETONITRILE>METANOLO>ETANOLO>
TETRAIDROFURANO>PROPANOLO>CICLOESANO
>ESANO

SOLVENTE
DEBOLE

SOLVENTE
FORTE

FORZA
INTERMEDIA

GRADIENTE
DI SOLVENTE
Sono numerose le possibili FM utilizzabili in HPLC ma
tutte devono possedere delle caratteristiche comuni:

 Purezza
 Compatibilità con il rivelatore
 Solubilità del campione
 Bassa viscosità
 Inerzia chimica
 Prezzo ragionevole
CARATTERISTICHE DELLA FASE MOBILE
CARATTERISTICHE DELLA FASE MOBILE
 EFFETTO del pH

• Un soluto nel suo stato ionico è più polare che nel suo stato
neutro, quindi spenderà meno tempo in interazioni idrofobiche
• Un soluto dovrebbe esistere in una solo forma per avere una buona
forma del picco
• Un soluto nella sua forma ionizzata può dare interazioni ioniche
indesiderate
Viscosità dell’eluente
pH FM vicino al pKa dell’analita
EFFETTO DELLA TEMPERATURA

Maggiore efficienza
Minori tempi di ritenzione
Sviluppo di un metodo cromatografico
Errori comuni in Method Development:

• Inadeguata individuazione degli obiettivi del metodo

• Scarsa conoscenza della chimica dell’analita
• Uso di FS in modo inconsapevole
• Trial and Error con diverse fasi mobili

Risultati

• Laborioso e poco efficiente sviluppo del progetto

• Fallimento del metodo rispetto ai risultati attesi
HPLC Method Development – Proposta di Procedura
A tavolino
• Definire le proprie conoscenze sul campione
• Definire gli obiettivi del metodo separativo
• Scegliere le colonne da considerare

In Laboratorio
Scegliere la fase mobile
Scegliere il rivelatore e I parametri di partenza
Valutare la colonna in relazione all’analita
Ottimizzare le condizioni di separazione (isocratiche o gradiente)
Convalidare il metodo
La scelta della FS è dettata sia dalla conoscenza
del campione che dall’obiettivo della separazione

Benefits di un approccio sistematico:

• Piccolo investimento iniziale

• Grande risparmio in laboratorio

• Scelta consapevole della colonna

• Efficienza migliore rispetto al “trial and error”

Knowledge of the Sample Influences the Choice of
Column Bonded Phase Characteristics

Conoscenza del campione

• Structure of sample components?

• Number of compounds present?
• Sample matrix? Chimica della Colonna
• pKa values of sample components? (bonded phase, bonding type,
endcapping, carbon load)
• Concentration range?
• Molecular weight range?
• Solubility?
• Other pertinent data?
CARATTERISTICHE DELL’ANALITA

1. Alchilbenzeni
2. Alchilfenoni
3. Alchilparaben
Functional Group Polarity Comparisons
Polarity Functional Group Structure Bonding Types Intermolecular Forces Displayed
Low Methylene R (CH2)2  London

Phenyl ,p London

R

Halide R F, Cl, Br, I  London, Dipole-Dipole

R O
Ether  London, Dipole-Dipole, H-bonding
R
-
O
Nitro R
+
N O ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding

O
Ester R ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding
O R
O
Aldehyde ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding
R H
O
Ketone R ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding
R

Amino R NH2 ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding, Acid-base chemistry

Hydroxyl R OH  London, Dipole-Dipole, H-bonding

O
High Carboxylic Acid R ,p London, Dipole-Dipole, H-bonding, Acid-base chemistry
OH
Choosing the Bonded Phase

Draw the molecular structures for all known components of the

mixture. Identify the two compounds whose structures are the
most similar.

e.g.:
HO HO

O O
OH O OH
HO

O O

Prednisolone Prednisone
Choosing the Bonded Phase

For these two molecules, circle the structural features that differ. It
is these differences that should be exploited to optimize the
separation.

e.g.: HO HO

O O
OH O OH
HO

O O

Prednisolone Prednisone
Choosing the Bonded Phase

Use the results of the structural comparison to select a bonded

phase showing optimal selectivity for these two molecules. In this
case consider using a silica column (no bonded phase) for its ability
to retain polar solutes through hydrogen bonding.

HO HO

O O
OH O OH
HO

O O

Prednisolone Prednisone

CN bonded phase for its ability to retain polar solutes

by dipole-dipole and CN ••• C=0 (p- p) interactions.
Choosing the Bonded Phase
Examples of bonded phases used for HPLC packing media:

C18 or Octadecylsilane (ODS)

Very nonpolar - Retention is based on London (dispersion)
interactions with hydrophobic compounds.

R
Si (CH2)17 CH3
R
Choosing the Bonded Phase

Each bonded phase has unique selectivity for certain sample types.
As a practical example, to separate toluene and ethyl benzene:
• Note a difference of one -CH2- unit
• Choose a C18 bonded phase for retention by hydrophobicity
• Maximize hydrophobic selectivity with a high silica surface area,
high carbon load material

Toluene Ethyl Benzene

Choosing the Bonded Phase

Phenyl
Nonpolar - Retention is a mixed mechanism of hydrophobic and p
- p interactions.

H H
R C C
Si (CH2)3 C C H
R C C
H H
Choosing the Bonded Phase

Cyanopropyl
Intermediate polarity - Retention is a mixed mechanism of
hydrophobic, dipole-dipole, and p - p interactions.

R
Si (CH2)3 C N
R
Chimica della fase stazionaria

Si O
O Si
Si O
O Si
Si O
O Si
Si O- Fe2+ Fe2+
-
CH 3

O N

O H 3C CH 3

O-
Na+ Na+
O- CO

O- C 2H 5

O- O Si
Si O O Si
Si O O Si
Si O
Composti basici e silanoli liberi

CH3

N CH3
N
H
H2 N

Me+
Si Si
Si
O
Si
O O-Scambio ionico
Si
H +
Interazioni idrofobiche H
+
 Modificatore organico
TRIETHYLAMINE
O Si
O Si
O Si
Fe2+ - +NHEt
O 3
O Si
Na+ O- +NHEt3
O- +NHEt3
O Si
Mg2+
O Si
O Si
O- +NHEt3
O Si
O
Si

MODIFICAZIONE IRREVERSIBILE (?)

 pH della fase mobile

pH acido pH basico

O Si O Si

O Si O Si
H + CH3 CH3 CH3 CH3
N N
Fe2+ Fe2+
OH CO NH O- CO NH

Na+ O Si CH3
Na+ O Si CH3

OH O-
Mg2+ Mg2+
OH O-
O Si O Si

• Silanoli non dissocciati • Silanoli dissociati

• Composti basici con

• Composti basici in forma
non ionizzata
carica (positiva)
Stabilità chimica
OH
OH
Fe2+
Idrolisi della
OH

pH < 2.5 Na+ OH

parte legata
OH
Mg2+
O Si

O Si

Si

pH > 9 Dissoluzione
della silice
Goals for the Separation Influence the Choice of
Column Particle Physical Characteristics

}
Obiettivi della separazione
• Max. resolution of all components?
• Partial resolution?
• Fast analysis? Parametri fisici della
• Economy (low solvent usage)? colonna
• Column stability and lifetime?
(particle bed dimensions,
• Preparative method? particle shape, particle
• High sensitivity? size, surface area, pore
size)
• Other goals?
Choosing the Particle Physical Characteristics
Use the Column Selection Chart
• Use “default” column as starting point
• Match up method goals with individual particle physical characteristics
• Change only those particle parameters that affect the method goals
• Recognize the “optimum” column as a possible compromise

Example:
Sample Type: hydrophobic compounds
Method Goal: highest resolution
Choosing the Particle Physical Characteristics
Column Dimensions
• Length and internal diameter of packing bed

Particle Shape
• Spherical or irregular

Particle Size
• The average particle diameter, typically 3-20µm

Surface Area
• Sum of particle outer surface and interior pore surface, in m2/gram
Column Dimensions
Effect on chromatography

Column Dimension
• Short (30-50mm) - short run times, low backpressure
• Long (250-300mm) - higher resolution, long run times
• Narrow ( 2.1mm) - higher detector sensitivity
• Wide (10-22mm) - high sample loading
Choosing the Particle Physical Characteristics
Pore Size
• Average size of pores or cavities in particles, ranging from
60-10,000Å

Bonding Type
• Monomeric - single-point attachment of bonded phase molecule
• Polymeric - multi-point attachment of bonded phase molecule

Carbon Load
• Amount of bonded phase attached to base material, expressed as
%C

Endcapping
• “Capping” of exposed silanols with short hydrocarbon chains after
the primary bonding step
Particle Shape

Effect on chromatography
Spherical particles offer reduced back pressures and longer column
life when using viscous mobile phases like 50:50 MeOH:H2O.

Particelle sferiche garantiscono una maggiore efficienza

Particle Size

Effect on chromatography
Smaller particles offer higher efficiency, but also cause higher
backpressure. Choose 3µm particles for resolving complex, multi-
component samples. Otherwise, choose 5 or 10µm packings.
Surface Area

Effect on chromatography
High surface area generally provides greater retention, capacity
and resolution for separating complex, multi-component samples.

Low surface area packings generally equilibrate quickly, especially

important in gradient analyses.
Pore Size

Effect on chromatography
Larger pores allow larger solute molecules to be retained longer
through maximum exposure to the surface area of the particles.
Choose a pore size of 150Å or less for sample MW  2000. Choose
a pore size of 300Å or greater for sample MW > 2000.
Bonding Type

Effect on chromatography
Monomeric bonding offers increased mass transfer rates, higher
column efficiency, and faster column equilibration.

CH3 R
monomeric
OH + X Si (CH2)17 CH3 Si (CH2)17 CH3
bonding
CH3 R

OH CH3 O CH3
polymeric
+ X Si (CH2)17 CH3 Si
bonding
OH X O (CH2)17 CH3

Polymeric bonding offers increased column stability, particularly when

highly aqueous mobile phases are used. Polymeric bonding also
enables the column to accept higher sample loading.
Carbon Load

Effect on chromatography
Higher carbon loads generally offer greater resolution and longer run
times. Low carbon loads shorten run times and many show a
different selectivity.
Endcapping
Effect on chromatography
Endcapping reduces peak-tailing of polar solutes that interact excessively with
the otherwise exposed, mostly acidic silanols. Non-endcapped packings provide
a different selectivity than do endcapped packings, especially for such polar
samples.
 FASE STAZIONARIA
MONOLITICA

UNA FASE STAZIONARIA MONOLITICA E’ UNA

STRUTTURA POROSA UNITARIA, PREPARATA PER
POLIMERIZZAZIONE IN SITU O PER
CONSOLIDAMENTO DEL MATERIALE (INORGANICO
O POLIMERICO) ALL’INTERNO DEL CILINDRO CHE
COSTITUISCE LA COLONNA.
MORFOLOGIA E’ LA DIRETTA CONDEGUENZA DELLA TECNICA DI
POLIMERIZZAZIONE ADOTTATA.

MESOPORI

FIG.

MACROPORI
Confronto tra colonne HPLC impaccate con silice particellare
(5 e 3.5 mm) e colonne monolitiche.
 FAST SEPARATIONS

Esempio di separazione di 5 b-bloccanti a diversi

flussi
colonna Chromolith C-18 (50x4.6mm I.D.)

Da Flusso 1ml/min, pressione 13 bar.

Durata analisi 5 min
A Flusso 9ml/min, pressione 72 bar.
Durata analisi 30 sec.

a COSTANTE