Titoli principali

Cromatografia liquida HPLC. Caratteristiche

dell'uso della cromatografia liquida ad alte
prestazioni nei prodotti farmaceutici
Introduzione.

Il rapido sviluppo della cromatografia liquida negli ultimi 10 anni è dovuto

principalmente allo sviluppo intensivo di fondamenti teorici e l'uso pratico della
sua versione ad alta efficienza, nonché la creazione e la produzione industriale
dei necessari assorbenti e attrezzature.

Una caratteristica distintiva della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

è l'uso di assorbenti con una granulometria di 3-10 µm, che fornisce un rapido
trasferimento di massa con un'efficienza di separazione molto elevata.

Attualmente, l'HPLC ha preso il primo posto tra i metodi strumentali in termini di

velocità di sviluppo, superando persino la gascromatografia. Il vantaggio più
importante dell'HPLC rispetto alla gascromatografia è la capacità di studiare
quasi tutti gli oggetti senza alcuna restrizione sulle loro proprietà fisico-chimiche,
ad esempio sul punto di ebollizione o sul peso molecolare.

Oggi, HPLC è un metodo strumentale ben formato che è ampiamente utilizzato

in vari campi della scienza e della tecnologia. La sua importanza è
particolarmente grande in settori così importanti come la biochimica, biologia
molecolare, controllo dell'inquinamento, nonché nell'industria chimica,
petrolchimica, alimentare e farmaceutica.

poiché è necessario tenere conto di una serie di requisiti molto specifici a causa
delle seguenti caratteristiche della metodologia.
ma. Le colonne per HPLC sono riempite con un supporto con un diametro delle
particelle molto piccolo. Di conseguenza, sulla colonna vengono generate
pressioni elevate alle velocità spaziali del solvente richieste per una rapida
separazione del campione.

B. I rivelatori utilizzati nell'HPLC sono sensibili alle fluttuazioni del flusso e della
pressione dell'eluente (rumore). Inoltre, quando si utilizzano rivelatori di
concentrazione, è richiesta una stabilità ancora maggiore della velocità del
volume dell'eluente.

in. Il processo di separazione cromatografica è accompagnato da una serie di

effetti antagonisti, ad esempio la dispersione del campione nella fase mobile
porta alla miscelazione dei componenti separati e riduce la concentrazione
massima della sostanza nel picco di eluizione (nel rivelatore). La dispersione si
osserva in tutte le parti del sistema dal punto di iniezione del campione al
rivelatore.

d. I solventi che agiscono come fase mobile sono spesso in grado di corrodere le
apparecchiature. Ciò si applica principalmente ai solventi utilizzati nella
cromatografia in fase inversa, che è preferita nelle applicazioni HPLC
biochimiche.

Le specifiche dell'HPLC come tecnica strumentale devono essere prese in

considerazione nel processo di sviluppo, creazione e funzionamento di questi
sistemi. Ci sono voluti più di dieci anni di ricerca e ricerca per creare campioni
commerciali di sistemi cromatografici e dei loro componenti che fossero
sufficientemente affidabili, semplici e sicuri per operare con un rapporto
accettabile tra prezzo e caratteristiche tecniche. emergendo Ultimamente le
tendenze a ridurre le colonne (sia in lunghezza che in diametro) impongono
nuove esigenze agli utensili.

1.1. EFFICIENZAESELETTIVITÀ

La cromatografia è un metodo per separare i componenti di una miscela in base

alla differenza nella loro distribuzione di equilibrio tra due "fasi immiscibili, una
delle quali è stazionaria e l'altra è mobile. I componenti del campione si muovono
attraverso la colonna quando sono nella fase mobile e rimangono in posizione
quando sono maggiore è l'affinità del componente per la fase stazionaria e
minore per la fase mobile, più lentamente si muove attraverso la colonna e più a
lungo viene trattenuto in essa. A causa della differenza nell'affinità della
componenti della miscela per il stazionario e mobile un tempo accettabile la
miscela in singole bande (picchi) dei componenti mentre si muovono attraverso
la colonna con la fase mobile.

Di questi idee generaliè chiaro che la separazione cromatografica è possibile

solo se i componenti del campione, entrando nella colonna durante l'iniezione del
campione, in primo luogo saranno disciolti nella fase mobile e, in secondo luogo,
interagiranno (rimangono) con la fase stazionaria. Se alcuni componenti non
sono in soluzione quando il campione viene iniettato, verranno filtrati e non
parteciperanno al processo cromatografico. Allo stesso modo, i componenti che
non interagiscono con la fase stazionaria passeranno attraverso la colonna con
la fase mobile senza separarsi in componenti.

Accettiamo la condizione che alcuni due componenti siano solubili nella fase
mobile e interagiscano con la fase stazionaria, ovvero che il processo
cromatografico possa procedere senza disturbi. In questo caso, dopo aver fatto
passare la miscela attraverso la colonna, si possono ottenere cromatogrammi
della forma a, b o in(Fig. 1.1). Questi cromatogrammi illustrano separazioni
cromatografiche che differiscono per efficienza (ma e b) con uguale selettività e
selettività (B e in) con uguale efficienza.

L'efficienza della colonna è tanto maggiore quanto più stretto si ottiene il picco a
parità di tempo di ritenzione. L'efficienza della colonna è misurata dal numero di
piastre teoriche (NPP) n: più alto è l'ef-

Riso. 1.2. Parametri del picco cromatografico e calcolo del numero di piastre
teoriche:

t R - tempo di ritenzione di picco; h - altezza del picco; Wj/j - larghezza del picco
a metà della sua altezza

Riso. 1.1. Tipo di cromatogramma in funzione dell'efficienza e della selettività

della colonna:

ma- selettività convenzionale, efficienza ridotta (meno piastre teoriche); b -

selettività ed efficienza convenzionali; in - efficienza convenzionale, maggiore
selettività (maggiore rapporto tra i tempi di ritenzione dei componenti)
efficienza, maggiore è l'FTT, minore è l'espansione del picco della banda
inizialmente stretta mentre passa attraverso la colonna, più stretto è il picco
all'uscita della colonna. NTT caratterizza il numero di passaggi per stabilire
l'equilibrio tra le fasi mobile e stazionaria.

Conoscere il numero di piastre teoriche per colonna e la lunghezza della

colonna l (µm), nonché il diametro medio della grana del sorbente dc (µm), è
facile ottenere l'altezza equivalente alla piastra teorica (HETP) e l'altezza
equivalente alla piastra teorica ridotta (PHETP):

HETT = l/ n

PVETT \u003d B3TT / d c .

Con i valori NTT, HETP e PHETP, le efficienze delle colonne possono essere
facilmente confrontate tipi diversi, di diverse lunghezze, riempiti con assorbenti di
diversa natura e granulazione. Confrontando l'NTT di due colonne della stessa
lunghezza, confrontare la loro efficienza. Quando si confronta l'HETP, le colonne
vengono confrontate con assorbenti della stessa granulazione, aventi lunghezze
diverse. Infine, il valore di PVETT consente a due colonne qualsiasi di valutare la
qualità del sorbente, in primo luogo, e la qualità del riempimento delle colonne e,
in secondo luogo, indipendentemente dalla lunghezza delle colonne, la
granulazione mediante assorbenti della sua natura.

La selettività delle colonne gioca un ruolo importante nel raggiungimento della

separazione cromatografica.

La selettività di una colonna dipende da moltissimi fattori e l'abilità dello

sperimentatore è in gran parte determinata dalla capacità di influenzare la
selettività della separazione. Per fare ciò, il cromatografo ha nelle sue mani tre
fattori molto importanti: la scelta della natura chimica del sorbente, la scelta della
composizione del solvente e dei suoi modificatori, e la considerazione della
struttura chimica e delle proprietà dei componenti da essere separato. A volte un
notevole effetto sulla selettività è esercitato da una variazione della temperatura
della colonna, che modifica i coefficienti di distribuzione delle sostanze tra le fasi
mobile e stazionaria.
Quando si considera la separazione di due componenti in un cromatogramma e
la si valuta, la risoluzione è un parametro importante. Rs, che mette in relazione i
tempi di uscita e le larghezze di picco di entrambe le componenti separate

La risoluzione come parametro che caratterizza la separazione dei picchi

aumenta all'aumentare della selettività, riflessa da un aumento del numeratore, e
l'efficienza, riflessa da una diminuzione del valore del denominatore a causa di
una diminuzione dell'ampiezza dei picchi, aumenta. Pertanto, il rapido progresso
della cromatografia liquida ha portato a un cambiamento nel concetto di
"cromatografia liquida ad alta pressione" - è stato sostituito da "cromatografia
liquida ad alte prestazioni" (mentre è stata preservata la notazione abbreviata del
termine in inglese HPLC come la più corretta caratterizzazione della direzione di
sviluppo della moderna cromatografia liquida).

Pertanto, il lavaggio della colonna viene ridotto e l'efficienza aumenta quando si

utilizzano assorbenti più fini, più uniformi (a taglio stretto), più densamente e
uniformemente impaccati nella colonna, fasi legate più sottili, solventi meno
viscosi e portate ottimali.

Tuttavia, oltre alla sbavatura della banda della zona cromatografica durante la
separazione nella colonna, può anche essere imbrattata nel dispositivo di
iniezione del campione, nei capillari di collegamento iniettore-colonna e colonna-
rivelatore, nella cella del rivelatore e in alcuni dispositivi ausiliari ( microfiltri per
intrappolare particelle meccaniche da campioni installati dopo l'iniettore,
precolonne, bobine reattore, ecc.) - La sfocatura è tanto maggiore quanto
maggiore è il volume extra-colonna rispetto al volume trattenuto del picco.
Importa anche dove si trova il volume morto: più stretta è la chiamata
cromatografica, maggiore sarà la sfocatura del volume morto. Pertanto, è
necessario prestare particolare attenzione alla progettazione di quella parte del
cromatografo in cui la zona cromatografica è la più stretta (l'iniettore e i dispositivi
dall'iniettore alla colonna) - qui lo striscio fuori colonna è il più pericoloso e
colpisce più. Sebbene si ritenga che in cromatografi ben progettati, le fonti di
striscio aggiuntivo fuori colonna dovrebbero essere ridotte al minimo, tuttavia
ogni nuovo dispositivo, ogni alterazione del cromatografo, deve necessariamente
terminare con il test sulla colonna e il confronto del cromatogramma ottenuto con
quello del passaporto. Se si osserva una distorsione del picco, una forte
diminuzione dell'efficienza, è necessario ispezionare attentamente i capillari e
altri dispositivi introdotti di recente nel sistema.
Lo striscio fuori colonna e il suo errore di valutazione possono portare a una
significativa perdita di efficienza (oltre il 50%), soprattutto quando si tenta di
utilizzare cromatografi relativamente vecchi per HPLC ad alta velocità, HPLC a
microcolonne e altre moderne applicazioni HPLC che richiedono microiniettori ,
collegando capillari con interno di diametro minimo 0,05-0,15 mm, colonne con
capacità 10-1000 µl, rivelatori con microcuvette con capacità 0,03-1 µl e con
registratori e integratori ad alta velocità e alta velocità.

1.2. RITENZIONE E FORZA DEL SOLVENTE

Affinché gli analiti siano separati sulla colonna, come accennato in precedenza, il
fattore di capacità K" deve essere maggiore di 0, cioè le sostanze devono essere
trattenute dalla fase stazionaria, il sorbente. Tuttavia, il fattore di capacità non
dovrebbe essere troppo grande per ottenere un tempo di eluizione accettabile.
Se si sceglie una fase stazionaria per una data miscela di sostanze, che le
contiene, il lavoro ulteriore sullo sviluppo di una procedura di analisi consiste
nella scelta di un solvente che fornisca, nel caso ideale, diverso per tutti i
componenti, ma accettabilmente non molto grande K". Ciò si ottiene modificando
la forza di eluizione del solvente.

Nel caso della cromatografia ad adsorbimento su gel di silice o allumina, di

norma, la forza di un solvente bicomponente (ad esempio esano con aggiunta di
isopropanolo) viene aumentata aumentando il contenuto del componente polare
(isopropanolo) in esso , o ridotto diminuendo il contenuto di isopropanolo. Se il
contenuto del componente polare diventa troppo basso (inferiore allo 0,1%),
dovrebbe essere sostituito con un potere di eluizione più debole. Lo stesso
avviene, sostituendo la componente polare o non polare con altre, anche se il
sistema dato non fornisce la selettività desiderata rispetto alle componenti della
miscela di interesse. Quando si selezionano i sistemi di solventi, vengono prese
in considerazione sia le solubilità dei componenti della miscela che le serie
eluotropiche di solventi compilate da autori diversi.

Approssimativamente allo stesso modo, la forza del solvente viene selezionata

nel caso di utilizzo di fasi polari innestate (nitrile, amino, diolo, nitro, ecc.),
tenendo conto di possibili reazioni chimiche ed escludendo solventi pericolosi per
la fase (ad esempio , chetoni per la fase amminica).

Nel caso della cromatografia in fase inversa, la forza del solvente viene
aumentata aumentando il contenuto della componente organica (metanolo,
acetonitrile o THF) nell'eluente e ridotta aggiungendo più acqua. Se non è
possibile ottenere la selettività desiderata, si utilizza un altro componente
organico o si tenta di cambiarlo con l'aiuto di vari additivi (acidi, reagenti a coppie
di ioni, ecc.).

Nelle separazioni mediante cromatografia a scambio ionico, la forza del solvente

viene modificata aumentando o diminuendo la concentrazione della soluzione
tampone o modificando il pH, in alcuni casi viene utilizzata la modifica con
sostanze organiche.

Tuttavia, soprattutto nel caso di miscele naturali e biologiche complesse, spesso

non è possibile scegliere la forza del solvente in modo tale che tutti i componenti
del campione vengano eluiti in un tempo accettabile. Quindi è necessario
ricorrere all'eluizione a gradiente, cioè utilizzare un solvente il cui potere di
eluizione durante l'analisi cambia in modo da aumentare costantemente secondo
un programma predeterminato. Questa tecnica consente di ottenere l'eluizione di
tutti i componenti di miscele complesse in un periodo di tempo relativamente
breve e la loro separazione in componenti sotto forma di picchi stretti.

1.3. GRANDEZZA, PERMEABILITÀ ED EFFICIENZA DELLE PARTICELLE

ASSORBENTI

Considerando il washout della colonna, abbiamo sottolineato che l'efficienza

della colonna (HETP) dipende dalla dimensione delle particelle assorbenti. In
larga misura, il rapido sviluppo dell'HPLC negli ultimi 10-12 anni è stato dovuto,
in primo luogo, allo sviluppo di metodi per ottenere assorbenti con dimensioni
delle particelle da 3 a 10 μm e con una composizione frazionata ristretta, che
forniscono un'elevata efficienza con buona permeabilità e, in secondo luogo, lo
sviluppo di metodi per il riempimento di colonne con questi assorbenti e, in terzo
luogo, lo sviluppo e la produzione in serie di cromatografi liquidi con pompe
progettate per alte pressioni, iniettori e rivelatori con cuvette di piccolo volume in
grado di registrare piccoli picchi di volume.

Per colonne di impasto liquido ben impaccate, l'altezza equivalente della piastra
teorica (REHP) può essere 2 indipendentemente dal fatto che per
l'impaccamento siano state utilizzate particelle da 3, 5, 10 o 20 µm. In questo
caso otterremo rispettivamente colonne (con una lunghezza standard di 250 mm)
con un'efficienza di 41670, 25000, 12500 e 6250 tonnellate. Sembra naturale
scegliere la colonna più efficiente riempita con particelle da 3 µm. Tuttavia,
questa efficienza ha il costo del funzionamento a pressioni molto elevate e una
velocità di separazione relativamente bassa, poiché è probabile che la pompa
disponibile sia in grado di pompare il solvente attraverso una tale colonna ad una
velocità spaziale elevata. Qui ci troviamo di fronte alla questione del rapporto tra
la dimensione delle particelle del sorbente, l'efficienza e la permeabilità delle
colonne.

Se esprimiamo da qui il fattore di resistenza della colonna - un valore

adimensionale, otteniamo la seguente equazione:

Il fattore di resistenza per colonne impaccate con microparticelle dello stesso tipo
con lo stesso metodo cambia in modo insignificante e ammonta ai seguenti
valori:

Vista particellare"....Sferica irregolare

modulo

Imballaggio a secco. . . . . 1000-2000 800-1200

imballaggio a sospensione. . . 700-1500 500-700

La pressione di ingresso della colonna è proporzionale alla portata lineare, al

fattore di resistenza della colonna, alla viscosità del solvente e alla lunghezza
della colonna e inversamente proporzionale al quadrato del diametro delle
particelle.

Applicando questa dipendenza per le colonne di cui sopra con particelle con un
diametro di 3, 5, 10 e 20 μm e assumendo una velocità di flusso lineare costante,
fattore di resistenza della colonna e viscosità del solvente, otteniamo un rapporto
di pressione di ingresso di 44:16:4:1 per colonne di uguale lunghezza. Pertanto,
se per un assorbente in fase inversa con una dimensione delle particelle di 10
micron quando si utilizzano sistemi a solvente metanolo - . l'acqua (70:30) è
solitamente su una colonna standard ad una portata di solvente di 1 ml/min, la
pressione in ingresso alla colonna è di 5 MPa, quindi per particelle di 5 micron -
20 MPa e per 3 micron - 55 MPa. Quando si utilizza il gel di silice e un sistema
solvente meno viscoso esano - isopropanolo (100:2), i valori saranno
significativamente inferiori: rispettivamente 1, 4 e 11 MPa. Se nel caso di un
sorbente in fase inversa l'uso di particelle con una dimensione di 3 μm è molto
problematico e 5 μm sono possibili, ma non su tutti i dispositivi, allora per un
sorbente in fase normale non ci sono problemi di pressione. Va notato che i
moderni HPLC ad alta velocità utilizzano tipicamente portate di solvente più
elevate rispetto all'esempio precedente, quindi i requisiti di pressione aumentano
ancora di più.

Tuttavia, nei casi in cui è richiesto un certo numero di lastre teoriche per la
separazione ed è desiderabile eseguire un'analisi della velocità, l'immagine
cambia leggermente. Poiché la lunghezza delle colonne con assorbenti con una
granulometria di 3, 5, 10 micron, a parità di efficienza, sarà rispettivamente di
7,5; 12,5 e 25 cm, quindi il rapporto di pressione all'ingresso della colonna
cambierà a 3,3:2:1. Di conseguenza, la durata dell'analisi su tali colonne di
uguale efficienza sarà correlata come 0,3:0,5:1, cioè, quando si passa da 10 a 5
e 3 μm, la durata dell'analisi sarà ridotta di 2 e 3,3 volte. Questa analisi più
rapida ha il prezzo di una pressione di ingresso della colonna proporzionalmente
più alta.

I dati forniti sono validi per quei casi in cui assorbenti di diversa granulazione
hanno le stesse curve di distribuzione granulometrica, le colonne sono impaccate
allo stesso modo e hanno lo stesso fattore di resistenza della colonna. Va tenuto
presente che la difficoltà di ottenere frazioni strette del sorbente aumenta al
diminuire della dimensione delle particelle e che. le frazioni di diversi produttori
hanno una diversa composizione frazionaria. Pertanto, il fattore di resistenza
della colonna varierà a seconda della dimensione del grano, del tipo di
assorbente, del metodo di impaccamento della colonna, ecc.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI HPLC SECONDO IL MECCANISMO DI

SEPARAZIONE

La maggior parte delle separazioni HPLC si basa su un meccanismo misto di

interazione di sostanze con un assorbente, che garantisce una maggiore o
minore ritenzione dei componenti nella colonna. I meccanismi di separazione in
forma più o meno pura sono nella pratica piuttosto rari, ad esempio
l'adsorbimento quando si utilizzano gel di silice assolutamente anidro ed esano
anidro per separare idrocarburi aromatici.

Con un meccanismo di ritenzione misto per sostanze di diversa struttura e peso

molecolare, è possibile valutare il contributo di adsorbimento, distribuzione,
esclusione e altri meccanismi alla ritenzione. Tuttavia, per una migliore
comprensione e comprensione dei meccanismi di separazione nell'HPLC, è
consigliabile considerare le separazioni con una predominanza dell'uno o
dell'altro meccanismo in relazione a un certo tipo di cromatografia, ad esempio la
cromatografia a scambio ionico.

2.1.1 CROMATOGRAFIA PER ADSORBIMENTO

La separazione mediante cromatografia ad adsorbimento viene effettuata come

risultato dell'interazione di una sostanza con adsorbenti, come il gel di silice o
l'ossido di alluminio, che hanno centri attivi sulla superficie. La differenza nella
capacità di interagire con i centri di adsorbimento di diverse molecole campione
porta alla loro separazione in zone nel processo di spostamento con la fase
mobile attraverso la colonna. La separazione delle zone componenti ottenuta in
questo caso dipende dall'interazione sia con il solvente che con l'adsorbente.

L'assorbimento sulla superficie di un adsorbente avente gruppi ossidrile si basa

su una specifica interazione tra la superficie polare dell'adsorbente e i gruppi o
regioni di molecole polari (o polarizzabili). Tali interazioni includono l'interazione
dipolo-dipolo tra dipoli permanenti o indotti, la formazione di un legame idrogeno
fino alla formazione di n-complessi o complessi di trasferimento di carica.
Possibile e piuttosto frequente nel lavoro pratico è la manifestazione del
chemisorbimento, che può portare ad un aumento significativo del tempo di
ritenzione, una forte diminuzione dell'efficienza, la comparsa di prodotti di
decomposizione o l'assorbimento irreversibile della sostanza.

Le isoterme di adsorbimento delle sostanze hanno una forma lineare, convessa

o concava. Con un'isoterma di adsorbimento lineare, il picco della sostanza è
simmetrico e il tempo di ritenzione non dipende dalla dimensione del campione.
Molto spesso, le isoterme di adsorbimento delle sostanze non sono lineari e
hanno una forma convessa, che porta a una certa asimmetria del picco con la
formazione di una coda.

Gli adsorbenti in gel di silice con diversi volumi di pori, superfici e diametri dei
pori trovano la massima applicazione nell'HPLC. L'ossido di alluminio è usato
molto meno frequentemente e, estremamente raramente, altri adsorbenti
ampiamente utilizzati nella cromatografia classica su colonna e su strato sottile.
La ragione principale di ciò è l'insufficiente resistenza meccanica della maggior
parte degli altri adsorbenti, che non consente loro di essere confezionati e
utilizzati a pressioni elevate tipiche dei liquidi ad alta pressione.
I gruppi polari responsabili dell'adsorbimento e situati sulla superficie del gel di
silice e dell'ossido di alluminio hanno proprietà simili. Pertanto, solitamente
l'ordine di eluizione delle miscele di sostanze e la serie eluotropica dei solventi
sono per loro gli stessi. Tuttavia, la differenza nella struttura chimica del gel di
silice e dell'ossido di alluminio a volte porta a differenze di selettività, quindi viene
data la preferenza all'uno o all'altro adsorbente più adatto a questo particolare
compito. Ad esempio, l'allumina fornisce una maggiore selettività nella
separazione di alcuni idrocarburi policiclici aromatici.

La preferenza solitamente data al gel di silice rispetto all'allumina è dovuta alla

più ampia scelta di gel di silice in termini di porosità, superficie e diametro dei
pori, nonché all'attività catalitica significativamente più elevata dell'allumina, che
spesso porta a una distorsione dei risultati dell'analisi a causa della
decomposizione dei componenti del campione o del loro irreversibile
chemisorbimento.

2.1.2 Svantaggi della cromatografia ad adsorbimento che ne limitano l'uso

La popolarità della cromatografia ad adsorbimento è gradualmente diminuita con

lo sviluppo del metodo HPLC, è stato sempre più sostituito e continua ad essere
sostituito da altre opzioni, come HPLC in fase inversa e in fase normale su
assorbenti in fase legata. Quali svantaggi della cromatografia ad adsorbimento
hanno portato a questo?

Innanzitutto, sono la lunga durata dei processi di bilanciamento degli adsorbenti

con solventi contenenti acqua in tracce, la difficoltà di preparare tali solventi con
un certo e riproducibile contenuto di umidità. Ciò si traduce in una scarsa
riproducibilità dei parametri di ritenzione, risoluzione e selettività. Per lo stesso
motivo, è impossibile utilizzare l'eluizione del gradiente: il ritorno allo stato iniziale
è così lungo da superare significativamente il guadagno nel tempo dovuto all'uso
di un gradiente.

Sono anche ben noti e sono stati più volte segnalati in letteratura importanti
svantaggi degli adsorbenti, in particolare dell'ossido di alluminio, associati a
frequenti riarrangiamenti di composti sensibili alla catalisi, alla loro
decomposizione, all'assorbimento irreversibile. Le sostanze ad assorbimento
irreversibile, che si accumulano nella sezione iniziale della colonna, cambiano la
natura del sorbente, possono portare ad un aumento della resistenza della
colonna o addirittura al suo completo intasamento. L'ultimo inconveniente può
essere eliminato utilizzando una precolonna, che su- all'aumentare della
resistenza e dell'intasamento, viene sostituito con uno nuovo * o riempito con un
nuovo assorbente. Tuttavia, l'assorbimento irreversibile, che avviene anche in
questo caso, porta ad un cromatogramma in cui le componenti del campione
sensibili all'assorbimento o alla decomposizione catalitica sono completamente o
parzialmente assenti.

2.2. CROMATOGRAFIA PER DISTRIBUZIONE

La cromatografia di partizione è una variante dell'HPLC in cui la separazione di

una miscela in componenti viene effettuata per la differenza dei loro coefficienti
di distribuzione tra due fasi immiscibili: una solvente (fase mobile) e una fase su
un assorbente (fase stazionaria). Storicamente, i primi sono stati assorbenti di
questo tipo, ottenuti applicando fasi liquide (ossidipropionitrile, olio di paraffina,
ecc.) a veicoli porosi, in modo simile a come venivano preparati e vengono
preparati i assorbenti per cromatografia gas-liquido (GLC). Tuttavia, sono state
immediatamente rilevate carenze di tali assorbenti, il principale dei quali era il
lavaggio relativamente rapido della fase dal supporto. A causa di ciò, la quantità
di fase nella colonna è diminuita gradualmente, sono diminuiti anche i tempi di
ritenzione e nella sezione iniziale della colonna sono comparsi centri di
adsorbimento non coperti dalla fase, che hanno causato la formazione di code di
picco. Questo inconveniente è stato superato saturando il solvente con la fase
supportata ancor prima che entrasse nella colonna. Il carryover è diminuito
anche quando sono state utilizzate fasi polimeriche più viscose e meno solubili,
tuttavia, in questo caso, a causa della difficoltà di diffusione da film polimerici
spessi, l'efficienza delle colonne è stata notevolmente ridotta.

Si è rivelato logico innestare la fase liquida al vettore mediante legami chimici in

modo tale che il suo trascinamento diventi fisicamente impossibile, cioè
trasformare il vettore e la fase in un unico insieme - nella cosiddetta fase
innestata assorbente.

In futuro, gli sforzi dei ricercatori sono stati diretti alla ricerca di reagenti, il cui
innesto sarebbe avvenuto abbastanza rapidamente e completamente e i legami
formati erano il più stabili possibile. Questi reagenti erano alchilclorosilani e loro
derivati, che hanno permesso di ottenere assorbenti in fase di innesto di vario
tipo e con diversi gruppi polari e non polari sulla superficie utilizzando una
tecnologia simile.

L'uso di successo di quest'ultimo tipo di assorbenti per HPLC ha contribuito alla

crescita della loro produzione da parte di vari produttori. Ciascuna azienda
produceva tali assorbenti, di norma, sulla base del proprio tipo di gel di silice e
secondo la propria tecnologia, che normalmente costituisce il "saper fare" della
produzione. Di conseguenza, un gran numero di assorbenti chimicamente
chiamati esattamente uguali (ad esempio gel di silice con ottadecilsilano
innestato) hanno caratteristiche cromatografiche molto diverse. Ciò è dovuto al
fatto che il gel di silice può avere pori più larghi o più stretti, superficie diversa,
porosità, la sua superficie prima dell'innesto può essere idrossilata o meno, si
possono innestare mono, di o triclorosilani, le condizioni di innesto possono dare
monomeri, polimeri o strato di fase mista, vengono utilizzati diversi metodi per
rimuovere i reagenti residui, può essere utilizzata o meno una disattivazione
aggiuntiva del silanolo e di altri gruppi attivi.

La complessità della tecnologia per l'innesto dei reagenti e la preparazione di

materie prime e materiali, la sua natura multistadio porta al fatto che anche lotti
di assorbenti ottenuti utilizzando la stessa tecnologia dallo stesso produttore
possono avere caratteristiche cromatografiche leggermente diverse. Ciò è
particolarmente vero quando tali assorbenti vengono utilizzati per l'analisi di
miscele multicomponenti contenenti sostanze che differiscono notevolmente per
numero e posizione dei gruppi funzionali e per tipo di funzionalità.

Alla luce di quanto sopra, si dovrebbe sempre cercare di garantire * che quando
si utilizza il metodo di analisi descritto in letteratura, si utilizzi lo stesso
assorbente e le stesse condizioni operative. In questo caso, la probabilità che
l'opera non possa essere riprodotta è minima. Se ciò non è possibile e viene
prelevato un assorbente di un'altra azienda con una fase legata simile, è
necessario essere preparati al fatto che sarà necessario un lungo lavoro per
rielaborare la tecnica. Allo stesso tempo, c'è la possibilità (e va presa in
considerazione) che la necessaria separazione non possa essere raggiunta su
questo assorbente anche dopo un lungo sviluppo. La presenza in letteratura di
molte procedure di separazione descritte su assorbenti vecchi di lunga
produzione stimola la loro ulteriore produzione e utilizzo per questo motivo.
Tuttavia, nei casi in cui è necessario procedere allo sviluppo di metodi originali,
soprattutto in relazione a sostanze soggette a decomposizione, chemisorbimento
e riarrangiamento, è opportuno iniziare a lavorare su assorbenti di recente
sviluppo e prodotti da nuovi , versioni migliorate della tecnologia. I nuovi
assorbenti hanno una composizione frazionaria più uniforme, una copertura più
uniforme e completa della superficie da parte della fase legata e fasi finali più
avanzate della lavorazione del sorbente.

2.3. CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Nella cromatografia a scambio ionico, la separazione dei componenti della
miscela si ottiene grazie all'interazione reversibile delle sostanze ionizzabili con i
gruppi ionici del sorbente. La conservazione della neutralità elettrica del sorbente
è assicurata dalla presenza di controioni capaci di scambio ionico posti in
prossimità della superficie. Lo ione del campione introdotto, interagendo con la
carica fissa del sorbente, viene scambiato con il controione. Le sostanze aventi
differenti affinità per le cariche fisse sono separate su scambiatori di anioni o su
scambiatori di cationi.Gli scambiatori di anioni hanno gruppi caricati
positivamente sulla superficie e assorbono anioni dalla fase mobile.Gli
scambiatori di cationi, rispettivamente, contengono gruppi con una carica
negativa che interagiscono con i cationi .

Come fase mobile vengono utilizzate soluzioni acquose di sali di acidi, basi e
solventi come l'ammoniaca liquida, ovvero sistemi solventi con un'elevata
costante dielettrica e e un'elevata tendenza a ionizzare i composti.Di solito
funzionano con soluzioni tampone che consentono di regolare la valore del ph.

Durante la separazione cromatografica, gli ioni dell'analita competono con gli ioni
contenuti nell'eluente, cercando di interagire con gruppi di carica opposta del
sorbente. Ne consegue che la cromatografia a scambio ionico può essere
utilizzata per separare tutti i composti che possono essere ionizzati in qualsiasi
modo. È possibile analizzare anche le molecole di zucchero neutre sotto forma
dei loro complessi con lo ione borato:

Zucchero + IN 3 2 - \u003d Zucchero - IN 3 2 -.

La cromatografia a scambio ionico è indispensabile per la separazione di

sostanze altamente polari, che non possono essere analizzate mediante GLC
senza conversione in derivati. Questi composti includono aminoacidi, peptidi,
zuccheri.

La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata in medicina, biologia,

biochimica, per il controllo ambientale, nell'analisi del contenuto di farmaci e dei
loro metaboliti nel sangue e nelle urine, pesticidi nelle materie prime alimentari,
nonché per la separazione di composti inorganici, compresi radioisotopi,
lantanidi, attinidi, ecc. L'analisi dei biopolimeri (proteine, acidi nucleici, ecc.), che
di solito richiedeva ore o giorni, mediante cromatografia a scambio ionico, viene
eseguita in 20-40 minuti con una migliore separazione. L'uso della cromatografia
a scambio ionico in biologia ha permesso di osservare i campioni direttamente
nei mezzi biologici, riducendo la possibilità di riarrangiamento o isomerizzazione,
che può portare a un'errata interpretazione del risultato finale. È interessante
utilizzare questo metodo per controllare i cambiamenti nei fluidi biologici. L'uso di
scambiatori di anioni deboli porosi a base di gel di silice ha permesso di separare
i peptidi. V

Il meccanismo di scambio ionico può essere rappresentato dalle seguenti

equazioni:

per scambio anionico

X-+R+Y- h ->■  Y-+R+X-.

per scambio cationico |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

Nel primo caso, lo ione campione X~ compete con lo ione di fase mobile Y~ per i
centri ionici R+ dello scambiatore ionico, e nel secondo caso i cationi del
campione X+ competono con gli ioni di fase mobile Y+ per lo ionico centri R~.

Naturalmente, gli ioni campione che interagiscono debolmente con lo

scambiatore di ioni saranno trattenuti debolmente sulla colonna durante questa
competizione e sono i primi ad essere lavati via da essa, e, al contrario, gli ioni
trattenuti più fortemente saranno gli ultimi ad eluire dalla colonna. Di solito, le
interazioni BTqpH4Hbie di natura non ionica si verificano a causa
dell'adsorbimento o del legame idrogeno del campione con la parte non ionica
della matrice o per la limitata solubilità del campione nella fase mobile. È difficile
distinguere la cromatografia a scambio ionico "classica" nella sua forma "pura", e
quindi alcuni cromatografi procedono da modelli empirici piuttosto che teorici
nella cromatografia a scambio ionico.

La separazione delle sostanze specifiche dipende principalmente dalla scelta

della fase assorbente e mobile più adatta. Come fasi stazionarie nella
cromatografia a scambio ionico, vengono utilizzate resine a scambio ionico e gel
di silice con gruppi ionogenici innestati.

2.4. CROMATOGRAFIA TAGLIA

La cromatografia di esclusione è un'opzione! cromatografia liquida, in cui avviene
la separazione per distribuzione di molecole tra il solvente all'interno dei pori del
sorbente e il solvente che scorre " tra le sue particelle.

A differenza di altre opzioni HPLC, dove la separazione va a causa della diversa

interazione dei componenti con la superficie del sorbente, il ruolo del riempitivo
solido nella cromatografia ad esclusione dimensionale consiste solo nella
formazione di pori di una certa dimensione e la fase stazionaria è il solvente che
riempie questi pori. Pertanto, l'uso del termine "sorbente" per questi riempitivi è
alquanto condizionato.

La caratteristica principale del metodo è la possibilità di separare le molecole in

base alla loro dimensione in soluzione nell'intervallo di peso molecolare
praticamente qualsiasi - da 102 a 108, che lo rende indispensabile per lo studio
di sintetici e biopolimeri.

Tradizionalmente, il processo eseguito in solventi organici è ancora spesso

indicato come cromatografia a permeazione di gel e, nei sistemi acquosi,
cromatografia a filtrazione su gel. In questo libro, per entrambe le opzioni, viene
adottato un unico termine, che deriva dall'inglese "Size Exclusion" - un'eccezione
per dimensione - e riflette in modo più completo il meccanismo del processo.

Un'analisi dettagliata delle idee esistenti su una teoria molto complessa del
processo di cromatografia ad esclusione dimensionale viene condotta nelle
monografie.

Volume totale di solvente nella colonna Vt (viene spesso indicato come il volume

totale della colonna, poiché Vd non partecipa al processo cromatografico) è la
somma dei volumi delle fasi mobile e stazionaria.

La ritenzione di molecole in una colonna occlusiva è determinata dalla probabilità

della loro diffusione nei pori e dipende dal rapporto tra le dimensioni delle
molecole e dei pori, che è schematicamente mostrato in Fig. 2.15. Coefficiente di
distribuzione Ka, come in altre varianti della cromatografia, è il rapporto tra le
concentrazioni di una sostanza nelle fasi stazionaria e mobile.

Poiché le fasi mobile e stazionaria hanno la stessa composizione, quindi kd una

sostanza per la quale entrambe le fasi sono ugualmente accessibili, uguale a
uno. Questa situazione si realizza per le molecole C di dimensioni più piccole
(comprese le molecole di solvente), che penetrano in tutti i pori (vedi Fig. 2.15) e
quindi si muovono attraverso la colonna più lentamente. Il loro volume trattenuto
è uguale al volume totale del solvente Vt-

Riso. 2.15. Modello di separazione di molecole per misura in cromatografia ad

esclusione dimensionale

Tutte le molecole più grandi della dimensione dei pori del sorbente non possono
penetrarvi (esclusione completa) e passare attraverso i canali tra le particelle.
Eluiscono dalla colonna con lo stesso volume di ritenzione pari al volume della
fase mobile V 0 - Il coefficiente di partizione per queste molecole è zero.

Molecole di dimensione intermedia, in grado di penetrare solo in alcuni dei pori,

vengono trattenute nella colonna in base alla loro dimensione. Il coefficiente di
distribuzione di queste molecole varia da zero a uno e caratterizza la frazione del
volume dei pori disponibile per molecole di una data dimensione, il loro volume
trattenuto è determinato dalla somma di Yo e della parte accessibile del volume
dei pori.

ANALISI QUALITATIVA

Un cromatografo che inizia a lavorare nel campo della cromatografia liquida ad

alte prestazioni dovrebbe avere familiarità con le basi dell'analisi qualitativa.
L'analisi qualitativa viene utilizzata per identificare un prodotto noto ottenuto in un
modo nuovo o miscelato con altri prodotti alcuni medicinali chimici e loro
metaboliti in bioml.terials... L'analisi "familiarità con le basi della qualitativa"
aiuterà ad evitare errori comuni, ad esempio / distinguere le impurità in un
campione dalle impurità in un solvente o controllare la purezza di una sostanza a
più di uno spettrofotometro di lunghezza d'onda, ma su uno diverso, ecc.

Prima di procedere con l'analisi, è necessario stabilire se l'intero campione viene

eluito dalla colonna da questo sistema solvente o meno. Per essere sicuri della
completa eluizione è necessario raccogliere tutto il liquido che scorre dalla
colonna, evaporare il solvente, pesare il residuo e trovare il recupero del
campione.

L'identificazione dei componenti in HPLC può essere effettuata in tre modi: 1)

utilizzare le informazioni di conservazione; 2) indagare le zone ottenute per
separazione in una colonna di cromatografia liquida utilizzando metodi di analisi
spettrale o chimica; 3) collegare direttamente l'analizzatore di spettro alla
colonna.

Il volume di ritenzione viene utilizzato per registrare i picchi in cromatografia V

R o tempo di attesa t R. Entrambi i valori sono una caratteristica di una sostanza
in un dato sistema cromatografico. Poiché il tempo di ritenzione della sostanza
da separare è costituito dal tempo di interazione nella colonna e dal tempo di
passaggio attraverso le sezioni vuote del tubo, varia da strumento a strumento. È
conveniente avere una sostanza che non è trattenuta da questa colonna,
prendendola come standard, il cui tempo e volume di ritenzione T 0 , V o. La
cromatografia della sostanza e dello standard deve essere eseguita nelle stesse
condizioni (pressione e portata). Nell'identificazione mediante dati di ritenzione,
le singole sostanze note che possono essere presenti nei campioni vengono
separate nello stesso sistema cromatografico e per esse si ottengono valori. t
R. Confrontando questi valori t R con il tempo di ritenzione del picco
sconosciuto, si può scoprire che o coincidono, nel qual caso è probabile che i
picchi corrispondano alla stessa sostanza, oppure t R la sostanza nota non
corrisponde t R zona sconosciuta. Quindi è ancora possibile stimare i valori t
R sostanze non disponibili per la misurazione diretta della loro ritenzione.
Consideriamo entrambe le opzioni.

Nel primo caso, ovviamente, è necessario uno studio preliminare del campione
per postulare la presenza in esso di specifiche sostanze. Quando si lavora con
miscele semplici, è facile determinare se il grado di ritenzione delle zone del
campione e delle sostanze note coincide o meno, ovvero i valori t B sono uguali
o differenti. Nel caso di miscele complesse, è possibile eluire più sostanze con
valori simili contemporaneamente. t R, e le zone effettivamente ottenute dalla
separazione cromatografica si sovrappongono. Di conseguenza, ottenere valori
accurati t R per zone diverse diventa impossibile. L'affidabilità dell'identificazione
aumenta con l'aumentare della risoluzione, un controllo più attento delle
condizioni di separazione, la misurazione ripetuta dei valori t R e media dei valori
trovati. In questo caso, la separazione cromatografica di sostanze note e
sconosciute dovrebbe alternarsi. Quando si separano miscele complesse, il
valore t R le sostanze possono cambiare sotto l'influenza della matrice del
campione stesso. Un tale effetto è possibile all'inizio del cromatogramma e
quando i picchi si sovrappongono; è possibile anche il restringimento delle zone,
come già accennato.

In questi casi, lo standard deve essere aggiunto al campione in un rapporto di 1:

1. Se le sostanze sono identiche, il valore t R il materiale di partenza non cambia
e sul cromatogramma si ottiene un solo picco. Se è presente un dispositivo con
un sistema di cromatografia ciclica, per l'affidabilità dell'identificazione è
opportuno far passare più volte la miscela attraverso la colonna.

Informazioni sul grado di conservazione si possono trovare anche in letteratura,

ma il valore di queste informazioni è limitato. Poiché le colonne anche di un lotto
danno scarsa riproducibilità, i valori letterari non sempre corrispondono al vero
valore. t R su questa colonna. Per la cromatografia ad adsorbimento, invece, è
possibile prevedere t R sulla base dei dati della letteratura. Un'altra difficoltà
legata all'uso dei significati letterari t R, - la difficoltà di trovarli nella letteratura
specialistica, sebbene le recensioni bibliografiche pubblicate sul Journal of
Chromatography abbiano un indice aggiornato delle tipologie di sostanze.

Nel secondo caso, quando i tempi di ritenzione dei composti noti e le zone di
campionamento non coincidono, è possibile prevedere il tempo di ritenzione di
un componente sconosciuto. Le previsioni di ritenzione relativa basate sui dati
della struttura nella cromatografia 3D sono abbastanza affidabili. Sono meno
accurati nell'adsorbimento, nella cromatografia di partizione e soprattutto quando
si lavora su una fase chimicamente legata. Per la cromatografia di ioni e coppie
di ioni di sostanze con p Ka sono possibili solo valori approssimativi tR. È
sempre più facile prevedere la conservazione relativa o il valore *x rispetto ai
valori assoluti. K". Valori relativi t R più facile da valutare per composti o derivati
correlati, come acidi alchil carbossilici sostituiti o derivati del benzene.

Con la separazione isocratica di omologhi o oligomeri, a volte si osserva il

seguente schema:

\ gk" = UN + mld,

dove MA e IN- costanti per un numero di campioni selezionati e per un dato

sistema cromatografico (sulla stessa colonna, con le stesse fasi mobile e
stazionaria); Pè il numero di unità strutturali identiche nella molecola campione.

L'introduzione del gruppo funzionale / nella molecola campione comporterà un

cambiamento K" nella prima equazione da un coefficiente costante a/ in un dato
sistema cromatografico. È possibile ottenere costanti di gruppo a/ per vari gruppi
sostituenti/, i cui valori aumenteranno all'aumentare della polarità dei gruppi
funzionali in tutti i tipi di cromatografia, eccetto fase invertita, dove i valori delle
costanti diminuiranno con polarità crescente.
Alcune costanti di gruppo a/ per vari gruppi sostituenti / sono riportate nella
tabella. 9.1.

Nella cromatografia ad adsorbimento la prima equazione non è sempre

applicabile, poiché è valida purché tutti gli isomeri abbiano lo stesso
valore K", che non è sempre seguito. È possibile, tuttavia, tracciare lgfe" degli
stessi composti su una colonna rispetto a lgfe" degli stessi composti su una
colonna diversa, o rispetto alle caratteristiche corrispondenti nella cromatografia
su strato sottile, ad esempio lg[(l- RF) IRf].

Quando si confrontano i dati di conservazione, è possibile utilizzare i valori del

fattore di capacità K", poiché su di esso, a differenza t R non pregiudicano la
velocità della fase mobile e le caratteristiche geometriche della colonna.

La separazione su una fase legata chimicamente è simile alla separazione

mediante cromatografia di partizione con fasi simili e pertanto i dati di estrazione
all'equilibrio possono essere utilizzati per prevedere il tempo di ritenzione.

Nella cromatografia a scambio ionico, la ritenzione è influenzata da tre fattori: il

grado di ionizzazione di acidi e basi, la carica della molecola ionizzata e la
capacità di una sostanza della fase mobile acquosa utilizzata nella cromatografia
a scambio ionico di migrare nella fase organica . Quest'ultimo dipende dal peso
molecolare del composto e dalla sua idrofobicità. Pertanto, gli acidi o le basi più
forti sono trattenuti più fortemente in uno scambio anionico o in una separazione
per scambio cationico. Con una diminuzione RK a di un singolo acido compreso
nel campione, la ritenzione aumenta durante la separazione di un certo numero
di acidi per scambio anionico, e con l'aumento di p/C o, aumenta la ritenzione
delle basi durante la loro separazione per scambio cationico.

Pertanto, la coincidenza dei valori del tempo di ritenzione di una sostanza nota
con quella osservata consente di assumerne l'identità. L'affidabilità
dell'identificazione aumenta se i cromatogrammi di una sostanza nota e di un
componente sconosciuto vengono confrontati in condizioni diverse. Se le
sostanze in adsorbimento e cromatografia a fase inversa o a scambio ionico e ad
esclusione dimensionale si comportano allo stesso modo, l'affidabilità
dell'identificazione aumenta. Se l'affidabilità dell'identificazione con uguale
ritenzione relativa è del 90%, quando si studia il comportamento delle stesse
sostanze in condizioni che differiscono in modo significativo, l'affidabilità
dell'identificazione è già del 99%.
Una caratteristica preziosa di una sostanza utilizzata nell'identificazione è il
rapporto tra i segnali ottenuti per una data sostanza su due diversi rivelatori.
Dopo aver lasciato la colonna, l'analita passa prima attraverso il primo rivelatore,
poi attraverso il secondo, ei segnali provenienti dai rivelatori vengono registrati
contemporaneamente utilizzando un registratore multipenna o su due
registratori. Solitamente viene utilizzata una connessione seriale di un rivelatore
ultravioletto (più sensibile, ma selettivo) con un rifrattometro, o un ultravioletto
con un rivelatore a fluorescenza, o due rivelatori ultravioletti operanti a diverse
lunghezze d'onda. La risposta relativa, ovvero il rapporto tra il segnale del
rifrattometro e il segnale del fotometro, è una caratteristica della sostanza, a
condizione che entrambi i rivelatori operino nel loro intervallo lineare; ciò si
verifica introducendo quantità diverse della stessa sostanza. Le informazioni
qualitative possono essere ottenute lavorando su rivelatori fotometrici dotati di
dispositivo di arresto del flusso e consentendo di registrare lo spettro del picco in
uscita dalla colonna mentre si trova nella cella a flusso, confrontandolo con lo
spettro di un composto noto.

Di notevole interesse nell'identificazione sono gli spettrofotometri moderni, ma

costosi, con un array di diodi.

Una sostanza completamente sconosciuta non può essere identificata dalla sola
cromatografia liquida ad alte prestazioni e sono necessari altri metodi.

ANALISI QUANTITATIVA

La cromatografia liquida quantitativa è un metodo analitico ben sviluppato che

non è inferiore in termini di precisione alla gascromatografia quantitativa e
supera significativamente l'accuratezza della TLC o dell'elettroforesi
Sfortunatamente, non esiste un rivelatore nell'HPLC che avrebbe una sensibilità
simile per composti di varie strutture chimiche ( come un catarometro in Pertanto,
la calibrazione dello strumento è necessaria per ottenere risultati quantitativi.

L'analisi quantitativa consiste nelle seguenti fasi: 1) separazione cromatografica;

2) misurazione delle aree o delle altezze dei picchi; 3) calcolo della composizione
quantitativa della miscela sulla base di dati cromatografici; 4) interpretazione dei
risultati ottenuti, ovvero elaborazione statistica. Consideriamo tutte queste fasi.

4.1. SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

Si possono commettere errori durante il campionamento. È particolarmente
importante evitare errori e prelevare un campione rappresentativo adeguato di
campioni solidi eterogenei, sostanze altamente volatili o instabili, prodotti agricoli
e biomateriali. I campioni disomogenei, come gli alimenti, vengono
accuratamente miscelati e squartati. Effettuando ripetutamente questa
operazione si ottiene l'omogeneità del campione.

Errori e perdite di sostanze possono essere ammessi nella fase di estrazione,

isolamento, purificazione, ecc.

I campioni devono essere completamente disciolti e le loro soluzioni preparate

con una precisione di ±0,1%. È desiderabile sciogliere il campione nella fase
mobile, che escluderà la possibilità della sua precipitazione dopo l'introduzione
nel cromatografo. Se non è possibile la dissoluzione nella fase mobile, è
necessario utilizzare un solvente miscibile con esso e iniettare nel cromatografo
volumi di campione (inferiori a 25 µl).

Errori significativi possono verificarsi durante l'iniezione del campione a causa di

frazionamento, perdite e sbavature di picco. La sbavatura dei picchi provoca la
formazione di code, portando alla parziale sovrapposizione dei picchi e, di
conseguenza, ad errori di rilevazione. I dispositivi con valvola ad anello sono
preferiti rispetto alle siringhe per l'iniezione del campione nella quantificazione a
causa della maggiore precisione e della minore dipendenza dell'operatore.

Nella separazione cromatografica delle sostanze possono insorgere anche

complicazioni che portano alla distorsione dei dati: analisi quantitativa. Possibile
decomposizione o trasformazione del campione durante il processo
cromatografico o adsorbimento irreversibile della sostanza su questa colonna. È
importante assicurarsi che questi fenomeni indesiderati non esistano e, se
necessario, rigenerare la colonna o sostituirla. La sovrapposizione e lo
scodamento dei picchi possono anche essere ridotti modificando le condizioni
cromatografiche.

Picchi di forma falsa o indistinta, o picchi il cui tempo di rilascio è

prossimo a, perché potrebbe non esserci abbastanza segregazione.
Tipicamente, vengono utilizzati picchi con un valore di d" > 0,5. La massima
efficienza della colonna si ottiene con l'introduzione di 10~5 -10~6 g di soluto per
1 g di assorbente. Quando si introducono grandi quantità di campione, la
dipendenza di l'altezza del picco sotto carico può risultare non lineare ed è
necessaria una valutazione quantitativa per area del picco.
Gli errori associati al rilevamento o all'amplificazione portano a una distorsione
significativa dei risultati della separazione cromatografica. Ogni rivelatore è
caratterizzato da specificità, linearità e sensibilità. È particolarmente importante
verificare la selettività nell'analisi delle microimpurezze. La risposta dei rivelatori
UV può cambiare in sostanze con gruppi funzionali simili di un fattore 104. È
necessario calibrare la risposta del rivelatore per ciascun analita. Naturalmente,
le sostanze che non assorbono nella regione UV non daranno un segnale al
registratore quando utilizzate come rilevatore fotometrico. Quando si utilizza un
rifrattometro, possono apparire picchi negativi. Inoltre, questo rivelatore deve
essere termostatato, cosa che non è richiesta per un rivelatore UV.

La linearità del rivelatore determina la dimensione del campione iniettato. Va

ricordato che la portata attraverso la colonna, la temperatura della colonna e del
rivelatore e il suo design influiscono sull'accuratezza dell'analisi quantitativa.
Errori nella trasmissione di un segnale elettrico al dispositivo di uscita
(registratore), integratore o computer possono verificarsi a causa di captazione
del rumore, mancanza di messa a terra, fluttuazioni di tensione nella rete, ecc.

4.2. MISURA DI AREA O ALTEZZE DI PICCO

altezza di picco h (Fig. 10.1) chiama la distanza dalla cima del picco alla linea di
base, viene misurata linearmente o viene contato il numero di divisioni sul
registratore. Alcuni integratori elettronici e computer forniscono informazioni
sull'altezza di picco. La posizione della linea di base dei picchi spostati si trova
interpolando i valori di ordinate corrispondenti all'inizio e alla fine del picco
(picco 1 e 3 vedi fig. 10.1). Per migliorare la precisione, è necessario disporre di
una linea di base piatta e stabile. Nel caso di picchi non separati, la linea di base
viene tracciata tra l'inizio e la fine del picco e non viene sostituita da una linea
zero. Poiché l'altezza del picco dipende meno dall'influenza dei picchi vicini
sovrapposti, la stima dell'altezza del picco è più accurata ed è quasi sempre
utilizzata nell'analisi delle tracce.

L'area del picco può essere determinata in vari modi. Consideriamone alcuni.

1. Il metodo planimetrico consiste nel fatto che il picco viene tracciato con un
planimetro portatile, che è un dispositivo che determina meccanicamente l'area
del picco. Il metodo è accurato, ma laborioso e scarsamente riproducibile.
Questo metodo non è raccomandato.
2. Metodo della sagoma di carta: il picco viene ritagliato e pesato. Il metodo è
ben riproducibile, ma laborioso e il cromatogramma viene distrutto. La sua
applicabilità dipende dall'omogeneità della striscia del grafico. Anche il metodo
non può essere ampiamente raccomandato.

4. Il metodo della triangolazione consiste nel costruire un triangolo disegnando

tangenti ai lati del picco. La parte superiore del triangolo è più alta della parte
superiore del picco. L'aumento dell'area formata da questo picco esteso sarà
coerente in tutto il cromatogramma e non influirà troppo sull'accuratezza. Inoltre,
verrà compensata parte dell'area persa durante il disegno delle tangenti. La base
di un triangolo è determinata dall'intersezione delle tangenti con la linea di base
e l'area è determinata dal prodotto di 7 g della base per l'altezza. Per
determinare le aree dei picchi asimmetrici, questo metodo è il migliore. Tuttavia,
la riproducibilità nella costruzione di tangenti da parte di operatori diversi è
diversa e, quindi; basso.

5. Il metodo dell'integratore del disco si basa su un dispositivo elettromeccanico

collegato al registratore. Una penna attaccata all'integratore si muove lungo la
striscia in fondo al nastro ad una velocità proporzionale al movimento della
penna del registratore.

Come per la misurazione manuale, il picco dovrebbe rimanere sulla scala del
registratore, tuttavia, le regolazioni per compensare lo spostamento della linea di
base e la separazione incompleta dei picchi adiacenti riducono l'affidabilità e
aumentano il tempo di analisi.

Il metodo è più accurato dei metodi di misurazione manuali, specialmente con

picchi asimmetrici, e offre un vantaggio in termini di velocità. Inoltre, fornisce una
registrazione quantitativa permanente dell'analisi.

6. I metodi che utilizzano integratori elettronici che determinano l'area dei picchi e
stampano informazioni su quest'area e tempi di ritenzione, possono includere la
correzione dell'offset della linea di base e determinare l'area dei picchi solo
parzialmente separati. I principali vantaggi sono precisione, velocità,
indipendenza dell'azione dal funzionamento del registratore. Gli integratori hanno
una memoria e possono essere programmati per un'analisi specifica utilizzando
un programma precaricato. I vantaggi dell'integratore includono la sua capacità di
utilizzare fattori di correzione per la risposta del rivelatore durante il ricalcolo dei
dati iniziali sulle aree di picco, compensando la differenza nella sensibilità del
rivelatore a diverse sostanze. Tali sistemi fanno risparmiare tempo, migliorano
l'accuratezza analitica e sono utili per analisi analitiche di routine.

7. I computer che misurano le aree dei picchi sono ampiamente utilizzati nella
cromatografia liquida. Stampano il messaggio completo, compreso il nome delle
sostanze, le aree di picco, i tempi di ritenzione, i fattori di correzione della
risposta del rivelatore e il contenuto (in peso%) per i vari componenti del
campione.

(principalmente intermolecolare) all'interfaccia. Come metodo di analisi, l'HPLC

fa parte di un gruppo di metodi che, a causa della complessità degli oggetti in
studio, include la separazione preliminare della miscela complessa iniziale in
quelli relativamente semplici. Le miscele semplici ottenute vengono poi
analizzate con metodi fisico-chimici convenzionali o con metodi speciali
sviluppati per la cromatografia.

Il metodo HPLC è ampiamente utilizzato in campi quali la chimica, la

petrolchimica, la biologia, la biotecnologia, la medicina, la trasformazione degli
alimenti, la protezione dell'ambiente, la produzione di farmaci e molti altri.

Secondo il meccanismo di separazione delle sostanze analizzate o separate,

l'HPLC è suddiviso in adsorbimento, distribuzione, scambio ionico, esclusione,
scambio di ligandi e altri.

Va tenuto presente che in lavoro pratico la separazione spesso procede non per
uno, ma per più meccanismi simultaneamente. Quindi, la separazione per
esclusione può essere complicata da effetti di adsorbimento, adsorbimento -
distribuzione e viceversa. Allo stesso tempo, maggiore è la differenza di
sostanze nel campione in termini di grado di ionizzazione, basicità o acidità, in
termini di peso molecolare, polarizzabilità e altri parametri, più è probabile che
appaia un diverso meccanismo di separazione per tali sostanze.