Lezione 12

METODI STRUMENTALI IN
CHIMICA ANALITICA
Metodi di Separazione: HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC

Prof. Ilaria Palchetti,
moodle ID: metodi2021 !2
HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC
HPLC/UPLC: colonne, supporti, strumentazione e

metodi
Cromatografia multidimensionale
Cromatografia liquida a nanoflussi: NanoLC
Elettrocromatografia
!3
Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021
HPLC/UPLC
Cromatografia liquida su colonna
“A separation technique in which the mobile phase is a liquid…..Present-day liquid chromatography

generally utilizing very small particles and a relatively high inlet pressure is often characterized by the
term high-performance (or high-pressure) liquid chromatography, and the acronym HPLC”
Introduction – The Chromatographic Process
Constant flow of mobile phase
Analytes Stationary Phase
Column Mobile Phase
IUPAC. Compendium
• Theofstationary
Chemical Terminology, 2nd ed.
phase retains (the "Gold
analytes dueBook"). Compiled
to various by A. D. McNaught and A.
interactions.
Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-) created by S. J. Chalk. ISBN
• When different chemical components pass through the column at
0-9678550-9-8. https://doi.org/10.1351/goldbook
different rates they become separated in single zones. !4
HPLC/UPLC
Nei primi esperimenti in LC erano impiegate colonne
The Nobel Prize in Chemistry
impaccate con particelle relativamente grandi; la
1952 A. J. P. Martin and R. L. M.
separazione avveniva per gravità, con raccolta
Synge "for their invention of
manuale delle frazioni per la misura off-line; una partition chromatography.”
tecnica ancora praticata per alcune applicazioni in
chimica organica sintetica o in biochimica
preparativa. Gravity
(TLC) Paper Gravity Chrom.
Chrom. Flash Chrom. HPLC 1952 UPLC 2004
Negli anni ‘60, Calvin Giddings, John Knox, Josef Tsvett,
Chrom. 1903 1903 1978
Tswett,
Huber ed altri teorizzavano un concetto già espresso https://it.wikipedia.org/wiki/Michail_Semënovič_Cvet#/media/File:Mikhail_Tsvet.jpg
da Martin e Synge negli anni ’40, ossia che

es of Liquid Chromatography
l ’ a u m e n t o d e l l ’ e f fi c i e n z a d i p e n d e
contemporaneamente dall’impiego di particelle ME 330.80: Role of Chromatography & Mass
7
piccole e da un’elevata pressione per superare la Spectrometry in Biological Research
http://www.hopkinsmedicine.org/mams/
resistenza al flusso; ma la tecnologia per la
produzione di particelle con diametro ridotto per
consentire l'alta efficienza e l’alta prestazione doveva
arrivare solo negli anni ’70.
Alla fine degli negli anni’60, Horvath e Lipsky alla
Yale University costruirono il primo cromatografo
liquido ad alta pressione. Oggi il termine HPLC HPLC 1967
c o n n o t a l a " c ro m a t o g r a fi a l i q u i d a a d a l t e
prestazioni”, e non più l'alta pressione. La continua
riduzione delle dimensioni delle particelle, ha
richiesto l'uso di pressioni via via sempre più elevate.
Alcuni sistemi disponibili in commercio sono in grado
di pompare a pressioni di 15.000-19.000 psi e si
differenziano per il termine: cromatografia liquida ad
altissime prestazioni (UPLC). UPLC 2004
!5
Gravity Chrom. Flash Chrom. HPLC 1952 UPLC 2004
svett, 1903 1978
HPLC/UPLC: supporto e colonne
Simple pictorial and

chronological overview of
the evolution of particle
size and technology
during the history of
HPLC.
Historical Developments in HPLC and UHPLC Column Technology: The Past 25 Years
Nov 01, 2015 By Ronald E. Majors LCGC North America Volume 33, Issue 11, pg 818-840
!6
Effetto delle diverse dimensioni delle particelle sulla separazione.

Colonna: 150 mm × 4.6 mm C18; flow rate: 1.8 mL/min; detection:
assorbanza a 254 nm; temperatura: 30°C; volume d’iniezione: 5µL;
analiti: 1= o-xylene (0.04 mg/mL), 2= p-xylene (0.01 mg/mL).
The Early Days of HPLC at DuPont, Feb 01, 2009 By Richard A. Henry LCGC North America Volume 27, Issue 2, pg 146–153
!7
Effetto delle dimensioni delle particelle su efficenza e pressione.

L’efficienza e la pressione aumentano in modo inversamente proporzionale con la
dimensione delle particelle. L’effetto sulla pressione è maggiore.
The Early Days of HPLC at DuPont, Feb 01, 2009 By Richard A. Henry LCGC North America Volume 27, Issue 2, pg 146–153
!8
La forma, le dimensioni, la
porosità, la distribuzione
dimensionale delle particelle del
materiale di supporto
(impaccamento) sono importanti
caratteristiche della fase
stazionaria.
Tradizionalmente il materiale di
supporto è classificato in
• particelle non porose,
• particelle pellicolari
(conosciute anche come
superficially porous particle
(SPP), fused-core, core-shell,
e poroshell particles),
• particelle porose e particelle a

perfusione,
• barre monolitiche
Structures of particles used in HPLC: A)
pellicular particle; B) non porous chemically
bonded phase particle; C) porous particle; D)
perfusion particle; E) monolithic rod
!9
Il vantaggio nell’ impiego di particelle

SPP è dovuto al guadagno in efficienza
dovuto al sottile strato poroso che
limita la diffusione di grandi molecole nei
pori profondi, tipico delle particelle
porose.
Infatti, poiché la diffusione avviene solo

nello strato esterno poroso, e non nel
nucleo interno, l’ efficienza delle SPP è
maggiore rispetto a una particella
totalmente porosa della stessa
dimensione. Per esempio, una SPP da
2,7 μm fornirà un'efficienza paragonabile
a una particella totalmente porosa da 1,8
μm e un SPP da 4 um darà circa il
doppio dell'efficienza di una particella
da 5 um totalmente porosa. Poiché la
pressione è indirettamente proporzionale
alla dimensione delle particelle, le
colonne SPP da 2,7 μm, più grandi, Comparison of totally porous silica particles and
richiedono pressioni più basse rispetto superficially porous silica particles: (a) 5-μm totally
alle colonne con particelle al di sotto dei
porous particle, (b) 5-μm superficially porous particle,
2 μm, consentendo di aumentare la
p o r t a t a e m i g l i o r a re l a v e l o c i t à and (c) 2.7-μm superficially porous particle.
dell’analisi, con una buona risoluzione. Historical Developments in HPLC and UHPLC Column Technology: The Past 25 Years
!10
Sono disponibili in commercio

colonne impaccate con SPP che
possono essere utilizzate con
strumenti UHPLC, ma anche
con sistemi HPLC convenzionali
da 400 bar. Figure 17.
https://www.agilent.com/en/academia
The separation of biomolecules such as proteins and peptides is challenging because they diffuse
flow rates must typically be kept low to prevent peak broadening. Agilent offers a number of colum
As depicted
superficially in particles.
porous Figure, the Agilent Poroshell particle has a solid
core (1.7 μm in diameter) and a porous silica layer (0.5 μm
Poroshell 300:
thickness) 5 µm particles,it.0.25 µm porous layer, 300 Å pore diameter
surrounding
AdvanceBio RP-mAb: 3.5 µm particles, 0.25 µm porous layer, 450 Å pore diameter
AdvanceBio Peptide Mapping: 2.7 µm particles, 0.5 um porous layer, 120 Å pore diameter
AdvanceBio Glycan Mapping: 2.7 µm particles, 0.5 µm porous layer, 120 Å pore diameter
AdvanceBio Oligonucleotide: 2.7 µm particles, 0.5 µm porous layer, 100 Å pore!1diameter

1
Metodi Strumentali in Chimica
This technology Analitica,
reduces AA permitting
the diffusion distance, 2020-2021
rapid HPLC separation of biomolecules
La silice è il materiale generalmente impiegato come
materiale di supporto (impaccamento) in HPLC e
UPLC.
La silice in quanto tale è impiegata nella

cromatografia di adsorbimento, più spesso però
viene modificata chimicamente.
La silice è il materiale per la realizzazione di

numerose fasi stazionarie legate. A tale scopo viene
utilizzata la reattività dei gruppi silanolici superficiali
per la realizzazione di legami covalenti.
Oltre alle popolari fasi alchiliche C8 e C18, sono

diponibili un'ampia varietà di altre fasi stazionarie
basate su gruppi alchili ciclici, arilici, arilalchilici, etc. La silice può venir attivata e modificata con, ad
nonché fasi miste di scambio ionico con gruppi esempio, dimetilottadecilsilano per produrre
arilici o alchilici.
una fase legata con due gruppi metilici ed una
Sono disponibili commercialmente più di 1000 catena C18.
colonne con diverse fase stazionarie. La LC in fase Le catene hanno mobilità elevata e si
inversa è la più impiegata.
comportano come una fase liquida superficiale.
Le interazioni delle catene legate con i soluti e
Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza le fasi mobili, sono prevalentemente dovute a
di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità
forze di Van der Waals, attrazioni dipolo-dipolo,
nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di
legami -H o di tipo dielettrico.
origine sintetica) ha una composizione più
controllata.
!12
amorfa, polare e acida, è generalmente disponibile sotto forma di perle di vetro
HPLC/UPLC: supporto e colonne rivestite con uno strato di silice porosa (particelle pellicolari sferiche) o sotto
forma di particelle totalmente porose (microparticelle porose). La superficie del
gel di silice, in entrambi i tipi di particelle, non è mai omogenea ma sono presenti
diversi tipi di gruppi funzionali, come illustrato in Figura 14.
Le interazioni responsabili dell’adsorbimento sono principalmente i legami a
La silice è la fase stazionaria più utilizzata. La silice, che è una idrogeno e le interazioni dipolo-dipolo, che si instaurano tra gli analiti e i gruppi
silanolici. I “centri reattivi” presentano energie di legame elevate e possono
sostanza amorfa, polare e acida, è generalmente disponibile generare dei legami irreversibili con composti molto polari. Per questo motivo è
opportuno disattivare i centri reattivi, introducendo in colonna dell’acqua o un
sotto forma di particelle non porose (vetro), non porose alcool, nell’analisi di composti polari, quali per esempio alcoli, ammine e acidi. In
rivestite con uno strato di silice porosa (particelle pellicolari questo modo si bloccano i siti più attivi, il cui adsorbimento è quasi irreversibile.
sferiche, SPP etc) o sotto forma di particelle totalmente

a b c
porose. La superficie della silice, in entrambi i tipi di particelle, +
H H
– H
non è mai omogenea ma sono presenti diversi tipi di gruppi O O O O
funzionali. Si Si O Si Si O Si
Le particelle di silice si preparano agglomerando particelle di Figura 14. Gruppi funzionali presenti sulla superficie del gel di silice: a) gruppi
silanolici, b) gruppi silossanici, c) centri reattivi.
silice di dimensioni inferiori al micron in condizioni che
portano a particelle più grandi con diametri uniformi. Le Gruppi funzionali presenti sulla superficie
La dimensione delle particelle di gel di silice è un parametro che va tenuto in
particelle risultanti spesso sono rivestite da sottili pellicole del gel di silice: a) gruppi silanolici, b)
grande considerazione, per diverse ragioni. Se vengono utilizzate delle particelle
organiche, che sono legate chimicamente o fisicamente alla con un diametro ridotto (per esempio, 3 µm), le interazioni soluto-fase stazionaria
gruppi silossanici, c) centri reattivi.
sono più numerose in quanto l’area superficiale è maggiore. Inoltre, diminuendo
superficie, per la realizzazione delle varie fasi stazionarie. la grandezza delle particelle e a parità di lunghezza della colonna, si ottiene un
incremento dell’efficienza della colonna ma anche una maggiore resistenza al
La silice viene attivata mediante, ad
flusso. In Figura 15, vengono illustrate tre analisi NP-HPLC effettuate con
colonne dalla stessa lunghezza ma impaccate con particelle di grandezza
In cromatografia d’adsorbimento le interazioni responsabili esempio, l’utilizzo di HCl e riscaldamento a
differente. Dalle informazioni riportate nella stessa figura si evince che, mediante
dell’adsorbimento sono principalmente i legami a idrogeno e riflusso; in questo modo, vengono idrolizzati
l’utilizzo di particelle più piccole, si ottengono delle separazioni migliori, ma sono
richieste delle pressioni di esercizio maggiori.
le interazioni dipolo-dipolo, che si instaurano tra gli analiti e i i gruppi silossanici.
Per poter essere separati mediante LSC, gli analiti devono essere caratterizzati da
una certa polarità, visto che la fase stazionaria è di natura polare. La fase mobile
gruppi silanolici. I “centri reattivi” presentano energie di dovrà avere caratteristiche tali da poter solubilizzare i soluti e competere con essi
per l’adsorbimento sui siti attivi. Un composto di polarità elevata [per esempio, un
legame elevate e possono generare dei legami irreversibili Un metodo che produce fasi legate molto
acido carbossilico (-COOH)] si lega fortemente con la fase stazionaria, e, quindi,
con composti molto polari. Per disattivare i centri reattivi, si stabili (fasi silossaniche), implica la
sarà necessario usare una fase mobile polare affinché avvengono processi efficaci
può introdurre in colonna dell’acqua o un alcool, nell’analisi di reazione della silice con un reagente 19
composti polari, quali per esempio alcoli, ammine e acidi. In silanizzante (ad esempio un clorosilano
questo modo si bloccano i siti più attivi, il cui adsorbimento è organico).
quasi irreversibile.
!13
Sebbene la silice sia di gran lunga il

materiale LC più usato, sono stati studiati
altri materiali per essere impiegati come
supporto nelle colonne LC, come ad
esempio l’allumina e polimeri sintetici.
In particolare è impiegato il polistirene -

divinilbenzene [PS-DVB], anche
funzionalizzato con acido solfonico o
ammine quaternarie per la cromatografia di
scambio ionico o derivatizzato con catene
alchiliche per cromatografia in fase inversa.
Altri polimeri impiegati sono:

polimetacrilato, la poliacrilammide,
polivinilalcol etc.
Resins based on polystyrene cross-linked with

divinylbenzene (PS-DVB) are some of the best
studied polymeric substrates, and the most widely
used in ion chromatography. Anion and cation
exchange resins can be prepared
https://www.crawfordscientific.com/technical/chromatography-blog/hplc-chromatography-tips/hplc-columns/polymeric-hplc-columns
!14
!15
Le colonne monolitiche non sono

costituite da singole particelle ma da
un supporto continuo di silice o fase
polimerica che contiene due tipi di
pori: macropori di 1-2 μm di
larghezza e mesopori.
Scanning electron micrograph of a

silica-based monolith.
Historical Developments in HPLC and UHPLC Column Technology: The Past 25 Years
!16
250 mm length 10 µm particles
PAST 150 mm length 5 µm particles
400 bar Instruments
3.5 µm particles
Non-Porous Particles
Micro-Bore Superficially Porous Particles – 300A (pore), 5 µm

Narrow-Bore
15 mm length
Capillary Columns
Well plate Overlapped Injections
1.8 μm particles Superficially Porous Particles –

120A, 2.7 µm
1000 bar Instruments
1300 bar Instruments
NOW
!17
now possible to obtain almost 300% greater peak capacity, which is valuable for improving man
separations ranging from drug discovery to food safety and environmental applications, such as
screening.
Colonne
• Le colonne per HPLC/UPLC possono
essere di varie dimensioni e molteplici
sono i fattori e le dimensioni che
portano alla scelta di una tipologia di
colonna. Le dimensioni della colonna HPLC columns (Agilent)
vengono scelte in modo da raggiungere https://www.agilent.com/en/academia
il miglior compromesso in funzione di:

Superficially porous particle columns
capacità di carico, consumo di solventi, Superficially porous particle (SPP) columns have enjoyed a recent resurgence in smaller particle
risoluzione desiderata e velocità the older 'pellicular' particle columns. As depicted in Figure 17, the Agilent Poroshell 120 2.7 µm
solid core (1.7 µm in diameter) and a porous silica layer (0.5 µm thickness) surrounding it.
dell’analisi.
The Poroshell 120 offers significant method development advantages to chromatographers usin
totally porous columns. Because diffusion only occurs in the porous outer shell, not the solid cor
is increased compared to a totally porous particle of the same size. In fact, a 2.7 µm SPP will giv
• Alcune tipiche dimensioni di colonne comparable to a 1.8 µm totally porous particle and a 4 um SPP will give roughly twice the efficie
analitiche standard in acciaio porous 5 um particle. As pressure is indirectly proportional to particle size the larger 2.7 µm SPP
generate much lower pressures than sub-2 µm columns, allowing chromatographers to increase
inossidabile: 10, 15, and 25 cm in improve the speed of their analysis, while enjoying exceptional resolution. It is also important to
lunghezza; i.d. 2.6-4.6 mm.
Poroshell
micro 120 e
columns
nanoLCare packed with a standard
columns 2 µm frit, so they are more forgiving for dirty
(Waters)
do not clog as readily as columns with smaller frits.
https://www.waters.com/waters/fr_FR/Nano--and-Microflow-LC-MS-Columns/nav.htm?locale=fr_FR&cid=134778930
• Alcune colonne per micro e nanoflussi
32
H a m i l t o n ™ P R P - X 4 0 0
• Guard Column
Analytical Guard Column
https://www.fishersci.com/shop/products/guard-analytical-prp-x400/14816410
!18
Description Diameter Typical flow rate
Open-tubular column
≤20 μm i.d. <50 nL/min
Packed capillary
≥ 50 μm < 1.0 mm i.d. 0.2–100 μL/min
Microbore column ≥1.0 mm ≤ 2.1 mm i.d. 100–500 μL/min
Narrow-bore column >2.1 mm < 3.9 mm i.d. 500–1500 μL/min
≥3.9 ≤ 5 mm i.d. 1.5–5 mL/min 

Normal-bore column
Semipreparative
>5 mm i.d. ≥5 mL/min
column
!19
Per alcune applicazioni (ad

esempio in nanoLC) si possono
avere colonne capillari
impaccate, monolitiche o
tubolari aperte (OT-LC).
Come suggerisce il nome, le
c o l o n n e c a p i l l a r i O T- L C
mantengono una loro struttura
capillare aperta e possiedono
uno strato sottile di fase
stazionaria legata alla parete.
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2016.04.024
!20
HPLC/UPLC: considerazione teoriche ed avanzamenti strumentali
Key Chromatographic Parameters Impacted by

La selezione della fase Particle Size
stazionaria, della fase mobile
e della temperatura è un
fattore critico per ottenere Optimum
una buona separazione.
Particle Diameter
Le dimensioni delle particelle

che costituiscono la fase Peak Volume
Peak Eluent
stazionaria giocano un ruolo Efficiency
Volume
critico su molti parametri
Pressure Analysis Time
cromatografici.
Separation Fundamentals
Agilent Restricted
December 11, 2007
!21
In HPLC e in UPLC, gli analiti sono separati
in base alla loro diversa affinità tra la fase
stazionaria e una fase mobile liquida.
La cinetica della distribuzione dei soluti tra

la fase stazionaria e la fase mobile è
What Worked in the Past May Not Be
controllata dalla diffusione.
Si noti che, rispetto ai gas, il coefficiente di a Best Practice Today!
diffusione degli analiti nei liquidi è da 1000 a
10.000 volte più basso (diffusione lenta).
HPLC: Particle size 3 to 10 μm packed tightly with
Efficienza di una colonna cromatografica a pore size of 70 to 300 Å
è misurata come altezza del piatto teorico

(H) o come numero di piatti teorici (N). UPLC: Particle size < 3 μm
Il fattore di selettività (α) di una colonna per

due soluti dipende dalle loro costanti di
distribuzione. Il fattore di selettività dipende
dai fattori di ritenzione dei due soluti. Il
fattore di ritenzione k è un importante
quantità sperimentale usata per confrontare
le velocità di migrazione dei soluti nelle
colonne, ed è espresso dal tempo trascorso
nella fase stazionaria, rispetto al tempo
trascorso nella fase mobile.
!22
Time t
La risoluzione descrive la capacità di

una colonna di separare i picchi di
interesse; due parametri correlati alla Separation tr2-tr1
risoluzione sono il tempo di ritenzione e Peak width Wb1,2
la larghezza del picco.
t r 2 − t r1
La risoluzione può essere descritta in Rs =
funzione di tre parametri: efficienza della 1 / 2 ⋅ (Wb 2 + Wb1 )
colonna o piatti teorici; selettività; fattore
di ritenzione.
h
tr2
tri Retention time
compound i
tr1 W1/2 Peak width at half
height
Wbi Peak width at baseline
W1/2
Wb1 Wb2
t
!23
What happens inside the column?

tr2-tr1 tr2-tr1
Superior separation vs Inferior separation
Wb1 Wb2 Wb1 Wb2
vs Inferior separation
Retention Time (tr) & Peak Width (Wb)
!24
La risoluzione dipende
dall'efficienza (N), dalla selettività (α)
e dalla ritenzione (k).
Resolution – The Fundamental

Si può migliorare la risoluzione
Equation of (U)HPLC
migliorando uno di questi parametri.
La selettività ha la massima ⎛ α −1⎞ ⎛ k ⎞

influenza sulla risoluzione. Piccoli Rs = 1 N • ⎜ ⎟ •⎜ ⎟
cambiamenti nella selettività
portano a grandi cambiamenti nelle
4 ⎝ α ⎠ ⎝1+ k ⎠
risoluzioni.
La ritenzione ha solo un'influenza Efficiency Selectivity Retention

significativa su piccoli valori k.
L'efficienza descrive il potere di €

separazione della colonna.
!25
Fattore di ritenzione
#t − t &
r 0
k =% (
$ t0 '
Il fattore di ritenzione misura il tempo in
cui i componenti del campione
trascorrono nella fase stazionaria rispetto
al tempo in cui risiedono nella fase
mobile. Viene calcolato dal tempo di
ritenzione dell’analita diviso per il tempo https://www.agilent.com/en/academia
di ritenzione di un componente non

trattenuto (t0).
Parametri che influenzano il fattore di The figure explains resolution as a function

of selectivity, column efficiency or retention.
ritenzione:
Composizione della fase stazionaria
Composizione della fase mobile
Gradiente
Temperatura
!26
Fattore di selettività
La selettività è una misura del tempo o

della distanza tra i massimi di due
picchi. Se α = 1, i due picchi hanno lo
stesso tempo di ritenzione e k2 α Selectivity
c o e l u i s c o n o . È d e fi n i t o c o m e i l α= k1 Retention factor of 1st peak
rapporto tra i fattori di ritenzione.
k1 k2i Retention factor of 2nd peak
Parametri che influenzano il fattore di

ritenzione:
Composizione della fase stazionaria
Composizione della fase mobile
Gradiente
!27
Efficenza o Numero di piatti teorici
L'efficienza della colonna viene

utilizzata per confrontare le prestazioni
2 2
di diverse colonne. È espressa come il ⎛ t ⎞ ⎛ t ⎞
numero di piatti teorici, N.
N = 16 ⋅ ⎜⎜ r ⎟⎟ N = 5.54 ⋅ ⎜⎜ r ⎟⎟
Le colonne con un numero elevato di ⎝ Wb ⎠ ⎝ W1/ 2 ⎠
piatti sono più efficienti. Una colonna
con N alto porterà a un picco più
stretto in un dato tempo di eluizione
rispetto a una colonna con un valore di
N inferiore.
Parametri che influenzano l'efficienza

della colonna:
Lunghezza della colonna (aumentando

la lunghezza della colonna aumenta
l'efficienza)
Dimensione delle particelle (la riduzione

delle dimensioni delle particelle
aumenta l'efficienza)
!28
La ritenzione [k] e la selettività [α] sono fattori

chimici che muovono i picchi l'uno rispetto
all'altro e sono una misura dell'interazione degli
analiti con la fase stazionaria e la fase mobile.
Possiamo migliorare la risoluzione aumentando
k. Tuttavia, risultano tempi di ritenzione più
lunghi, sensibilità inferiore e larghezze di picco
maggiori. Un aumento di α può comportare una
maggiore risoluzione, lo stesso ordine di
eluizione di picco in un periodo di tempo simile
e / o una modifica dell'ordine di eluizione.
L'efficienza [N] è una misura fisica della

diffusione della banda in una separazione. www.waters.com/
Supponendo che N sia migliorato riducendo la

dimensione delle particelle del materiale di
imballaggio, la distanza del picco da centro a The impact of individual chemical and
centro non cambia. Inoltre, una riduzione della mechanical factors on resolution.
dimensione delle particelle comporterà picchi
cromatografici più stretti ed efficienti,
migliorando così la risoluzione e la sensibilità.
!29
La selettività influisce maggiormente sulla Selectivity impacts resolution most

risoluzione. Si può agire sulla selettività tramite
•  Change stationary phase
•  Change mobile phase
cambiamenti di fase stazionaria
Plates are easiest to increase
cambiamenti di fase mobile.
I piatti possono essere più facili da aumentare.
Il numero dei piatti è relativo all'altezza dei

piatti.
The figure explains resolution as a function

Il numero dei piatti è inversamente of selectivity, column efficiency or retention.
proporzionale all'altezza dei piatti.
!30
1
Sappiamo che il numero di piatti teorici è
inversamente proporzionale alla dimensione
N∝
delle particelle.
dp
La risoluzione dipende dalla radice quadrata dei
d p = particle size
piatti teorici.
Il numero dei piatti è relativo all'altezza dei

R∝ N
piatti.
1
La risoluzione è quindi inversamente
R∝
proporzionale alla dimensione delle particelle. dp
!31
la diffusione vorticosa o i percorsi di flusso multipli attraverso la colonna; B
HPLC/UPLC: considerazione teoriche
indica la diffusione ed avanzamenti
molecolare strumentali
lungo l'asse (longitudinale) della colonna; C
indica il trasferimento di massa dell'analita tra le fasi mobile e stazionaria. La
separazione è tanto più efficiente quanto più è basso il valore di H. Gli effetti
di ogni singolo termine e dell'equazione combinata sono mostrati nella
Figura 1, pagina 10, dove in grafico viene riportata l'altezza dei piatti rispetto
alla velocità di flusso lineare attraverso la colonna. Questo tipo di rappresen-
tazione grafica è chiamata curva di Van Deemter e viene usata per stabilire la
velocità di flusso ottimale (punto minimo della curva) per ottenere la migliore
efficienza di separazione da una colonna.
L’equazione di van Deemter
esprime l’influenza della
colonna e della velocità di
flusso sull’altezza del piatto:
H= A + B/u + Cu
La curva di Van Deemter

viene usata per stabilire la
velocità di flusso ottimale
(punto minimo della curva)
per ottenere la migliore
efficienza di separazione da
una colonna.
Figura 1 Curva ipotetica di Van Deemter
!32
10 Manuale e guida di riferimento rapido del sistema LC Agilent 1290 Infinity
Why Develop Smaller Particles?

Better Performance!
0.0030
Particelle più
piccole generano
0.0025
curve più piatte,
con una minima
HETP (cm)
0.0020
variazione alle alte
5.0 m
velocità di flusso 0.0015 3.5 m
1.8 m
0.0010
Sviluppare particelle
più piccole e più 0.0005
robuste permette di
a v e re u n a m i g l i o re 0.0000
perfomance. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Volumetric Flow Rate (mL/min)

Smaller particle sizes yield flatter curves, minima shift to higher flow rate
Page 6 https://www.agilent.com/en/academia
Pag
!33
Diminuendo la dimensione delle particelle, la sfida tecnica è la possibilità di utilizzare un’ alta
pressione, e al giorno d’oggi con l'avanzamento tecnologico nella strumentazione è possibile
La pressione aumenta
esponenzialmente al diminuire
delle dimensioni delle particelle.
η× L × v
ΔP =
θ × d p2
Molti parametri influenzano la
pressione lungo la colonna.
ΔP = Pressure Drop
η = Fluid Viscosity
Le dimensioni delle particelle e la L = Column Length
lunghezza della colonna sono tra i
parametri più critici.
v = Flow Velocity
d p = Particle Diameter
Colonne più lunghe con particelle θ = Dimensionless Structural Constant
più piccole significa maggiore
risoluzione e maggiore pressione.
Attualmente è tecnicamente La caduta di pressione necessaria per ottenere la

possibile maneggiare e produrre stessa velocità lineare è direttamente proporzionale
elevate pressioni. alla lunghezza della colonna (L) ed inversamente
proporzionale alla dimensione delle particelle.
!34
Hmin. 2 µm
HPLC/UPLC: considerazione teoriche
0
ed avanzamenti strumentali
0 5 10
Linear Velocity u [mm/s]
700 Separation on 5 µm material
In LC per aumentare l’efficienza (diminuire

H) si deve operare sulla diminuzione del
mAU
diametro delle particelle nelle colonne
impaccate, con diminuzione dei termini A e
C dell’eq. di van Deemter.
0
L’aumento della pressione al diminuire delle 1.7 2.0 Minutes 3.0
dimensioni è uno svantaggio.
700 Separation on 2 µm material

La caduta di pressione necessaria per
ottenere la stessa velocità lineare è
direttamente proporzionale alla lunghezza mAU
della colonna (L) ed inversamente
proporzionale alla dimensione delle
particelle.
0
1.7 2.0 Minutes 3.0
Figure 1. Smaller particles provide more theoretical plates and more resolution,
demonstrated by the improved separation of three peaks (bottom) and smaller
!35
minimum plate heights H in the Van Deemter plot (top). At linear velocities
Metodi Strumentali in Chimica
higher than uopt, H Analitica, AA 2020-2021
increases more slowly when using smaller particles, allowing
UPLC vs. UHPLC vs. HPLC

La cromatografia liquida a prestazioni
superiori (UPLC) è il risultato dello sviluppo www.waters.com
tecnologico ed ingegneristico della tecnica in
HPLC. Ciò che fa la differenza con l’HPLC è
la granulometria inferiore (2 um) delle colonne
impaccate utilizzate e la possibilità tecnica di
applicare valori di pressione molto elevati.
• La differenza tra HPLC e UPLC dipende
essenzialmente dai sistemi di pompaggio

utilizzati, che possono arrivare ad una UltraPerformance Liquid Chromatography
pressione massima di 400 bar in HPLC e (UPLC ) Technology
1600 bar in UHPLC.
E' comunque possibile usare colonne  

impaccate con particelle SPP da 2.7µm • Columns with smaller par1cles[<1.7um] 
anche con metodi HPLC ottimizzati.
• Mobile phase delivery is done at >15,000psi (1000
atm)
Il rilevatore comunemente associato all’UPLC
è il triplo quadrupolo (MS/MS).
!36
The use of a UPLC/

UHPLC column instead
of a regular HPLC
column enables a
reduction in analysis
time by a factor of 8 with
equivalent kinetic
performance.
Journal of Chromatography A,
1119 (2006) 140–146
!37
!38
La strumentazione usata in
HPLC/UPLC è interamente
automatizzata.
!39
HPLC/UPLC: Metodi
Separation Techniques
Hydro -
Amino acids Inorganic ions
philic
Volatile Synthetic Sugars
Carboxylic Glyphosate food dyes Sugars
acids alcohols
Aldehydes
Ketones Enzymes
PG, OG, DG
Sulfonamides Glycols phenols Aflatoxins
Fatty acids Antibiotics

Nitriles BHT, BHA, THBQ
antioxidents
Nitrosamine Flavonoids
Polarity
Organo- Alcohol
PAHs Anabolica Natural food dyes
phosphorus
pesticides Aromatic amines
TMS Fat soluble vitamins
derivatives PCBs
of sugar
Essential Oils Polymer monomers Triglycerides Phospholipids
Epoxides
C2-C6 hydrocarbons Fatty acid Aromatic esters

methylesters
Hydro-
phobic
Volatile – Gas Phase Nonvolatile - Liquid Phase
Volatile Volatility Nonvolatile
Separation Fundamentals
Agilent Restricted
December 11, 2007
!40
HPLC/UPLC: Metodi
Selezione di metodi per la

cromatografia liquida. I metodi
possono essere scelti in base alla
solubilità e alla massa molecolare.
Nella maggior parte dei casi, per le
piccole molecole (M<2000) non
ioniche, sono adatti i metodi a fase
inversa. Le tecniche che si trovano
nella parte bassa del diagramma
sono invece più adatte alle specie
con elevata massa molecolare
(M>2000)
!41
HPLC/UPLC: Metodi
Technique Main Separation mechanism

Adsorption cromatography
Adsorption
(Liquid-solid chromatography)
Normal-phase chromatography, NPLC
Distribution
(liquid-liquid chromatography)
Reverse-phase chromatography, RPLC
Distribution
(liquid-liquid chromatography)
Chiral Chromatography Distribution, Chiral stationary phases
Hydrophilic Interaction Chromatography

Distribution, Hydrophilic Interaction
(HILIC)
Hydrophobic Interaction
Distribution, Hydrophobic Interaction
Chromatography (HIC)
Ion-exchange chromatography, IEC Ionic
Size-exclusion chromatography, SEC Size exclusion
Affinity chromatography Affinity

!42
HPLC/UPLC: Metodi
Cromatografia liquida di ripartizione a fase inversa

Principio: Ripartizione dell’analita tra la fase mobile
e la fase stazionaria.
Interazioni non polari (non specifiche) dell’analita

con la superficie non polare legata.
(colonne C18, C8, fenil, C3 etc..)
La differente affinità fra gli analiti permette la loro

separazione:
- gli analiti più polari sono meno trattenuti
- gli analiti con una componente idrofobica più

ampia sono trattenuti più a lungo
La fase mobile: acqua (tampone) + acqua-solvente

organico miscibile (MeOH, ACN)
- eluizione isocratica
- eluizione a gradiente
Spesso si usa un’ eluizione a gradiente
Può essere impiegata per molecole non polari,

ionizzabili e molecole ioniche.
In alcuni casi è conveniente convertire in derivati gli

analiti di interesse (prima o dopo l’eluzione).
!43
HPLC/UPLC: Metodi
!44
HPLC/UPLC: Metodi
Cromatografia liquida chirale
InfinityLab Poroshell
Why 120Separations
Do Chiral Chiral Chemistries
Le fasi stazionarie chirali sono fasi legate Why Do Chiral Separations
con selettori chirali ossia composti che

interagiscono selettivamente con gli +/-
• Most small molecule drugs on the market today are
either racemates or enantiomerically pure. •
• Enantiomers: Same chemical and physical •
enantiomeri. Esistono diverse tipologie di either
properties, but can have
properties.
very racemates or enantiomerically pure.
different behavorial
fasi chiari disponibili in commercio.

• Enantiomers: Same chemical and physical
• It is important to characterize each enantiomer.
properties, but can have very different behavorial •
properties. •
Le fasi stazionari chirali hanno diverse
affinità ed interazioni specifiche per • It is important to characterize each enantiomer.
ciascun enantiomero.
InfinityLab Poroshell 120 Chiral Chemistries
13 December 12, 2019 There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted
•
Tiipiche interazioni per la separazione •
chirale:
•
Legame a idrogeno
Interazioni π-π
Dipolo stacking
Interazioni steriche
Interazioni ioniche
Sono necessari almeno tre diverse

Examples of Cavity phases as stationary
interazioni perchè avvenga la separazione
15 December 12, 2019
phases for chiral LC
There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444
Agilent Restricted
!45
HPLC/UPLC: Metodi
Fasi stazionarie chirali:
Cromatografia liquida chirale (1)
fasi monomeriche brush-type: basate su piccole
molecole organiche
fasi a complessi di inclusione: ciclodestrine, eteri a

corona, composti antibiotici macrociclici glicopeptidici
(vancomicina).
fasi a interazioni attrattive ed inclusione (polimeri

sintetici e naturali, ad esempio la cellulosa)
fasi a interazioni idrofobiche e polari (proteine)
fasi a scambio di legante
Esempi di Fasi mobili impiegate:
Polare ioni:
metanolo + acidi o basi o sali volatili <0.2 % wt. (MeOH +
HOAc + TEA )  
Fase mobile non acquosa. Interazioni dominanti:
interazioni ioniche e legami a idrogeno
Adatta per molecole ionizzabili, acidi o basi
(Example: MeOH with 0.2 wt% ammonium formate)
Polare organici: 
Acetonitrile/Methanol/Ethanol/Isopropanol+ HOAc + TEA
Interazioni Dipolo-dipolo e legami a idrogeno
A fase inversa:
Metanolo/Acqua/Tampone
Ideale per la separazione di biomolecole
A Fase Normale
Esano/Metanolo/Etanolo…. !46
HILIC phases. Each of these materials display different compatibility with MS, but ammonium bicarbonate, triethyl-
retention characteristics and separation selectivities and amine phosphate (TEAP), sodium perchlorate and sodium
HPLC/UPLC: Metodi
require distinct buffer constitutions for optimal results [10].
A HILIC buffer typically contains more than 70%
methylphosphonate (Na-MePO4) have also been found to be
applicable [2, 23]. Additionally, the same salt-based disrup-
acetonitrile [17]. Other eluents have been tested, for tion can decrease the retention of analytes and can be useful
Cromatografia liquida per interazione idrofilica
instance methanol or isopropanol, but they resulted in poor
chromatography or no analyte retention [2]. It is believed
during elution [17]. However, in some instances an increase
in retention was seen upon increasing the salt concentration
Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)
that the hydrophilic stationary phase enriches water from [10]. This was rationalized by the suggestion of a mecha-
the buffer and thus generates an aqueous layer [17]. This nism in which salt is enriched in the aqueous layer, which in
La cromatografia per interazione idrofilica (HILIC),
(Linden e Lawhead, 1975 J. Chromatogr A
Fig. 1 Chemical structures
105:125–133) è una tecnica di separazione per
of the functional groups
analiti polari e idrofili.
in common HILIC
stationary phases
HILIC è caratterizzata dall'uso di una fase

stazionaria polare e di una fase mobile di uno o più
solventi organici contenente acqua.
La fase mobile impiegata in HILIC è idonea

all’analisi per MS (LC–MS). Infatti il contenuto in
sali è molto basso. La fase mobile è realizzata con
solventi miscibili con acqua.
L'acronimo HILIC è stato suggerito per distinguerlo

dalla cromatografia a fase normale (NP), poiché NP
è tipicamente eseguita con solventi non acquosi,
non miscibili con acqua, mentre HILIC è eseguita
con solventi miscibili con acqua e l'eluizione è
ottenuta con un gradiente d’acqua.
Chemical structures of the functional groups
Spesso è importante controllare il pH della fase in common HILIC stationary phases
mobile.
E’ utile per la separazione di peptidi ed è molto

Anal Bioanal Chem (2008) 391:151–159
impiegata in proteomica.
!47
HPLC/UPLC: Metodi
Hydrophobic Interaction Chromatography
HIC idrofobica (HIC)
Cromatografia liquida per interazione
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) chromatography separates protein molecul
Hydrophobic interaction
their hydrophobicity. There is an interaction between the protein sam
surface of the HIC packing
Why Do Chiral Separations
La cromatografia per interazione HIC is most commonly used for separating proteins because, unlike
chromatography which denatures
• Most smallproteins,
molecule drugsHIC
on theconditions
market today aremaintain
idrofobica è molto utile in either racemates or enantiomerically pure.
native (and therefore active) state.
proteomica dove è comunemente • Enantiomers: Same chemical and physical
properties, but can have very different behavorial
HIC is used for:
impiegata per separare le proteine properties.
perchè, al contrario della • Separating proteins • It is important to characterize each enantiomer.
cromatografia a fase inversa che • Separating variants (impurities) from individual proteins
denatura le proteine, le condizioni • Separating antibody drug conjugate species
impiegate in HIC mantengono le
proteine nel loro stato nativo intatto
( e quindi attivo). 13 December 12, 2019 There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted
!48
HPLC/UPLC: Metodi
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC): How Does HIC Work?
How Does HIC Work?
Protein adsorption on HIC stationary phase
Protein adsorption on HIC stationary phase Protein Adsorption on HIC Stationary Phase
Salt
Salt
Start at higher levels of salt to promote

At the start of the gradient with a HIGH
hydrophobic interaction with ligands in
salt concentration, the protein is absorbed
the stationary phase.
onto the column. Its concentration is
almost certainly increased.
2 December 12, 2019

Protein Elution on HIC Stationary Phase
There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted
23 December 12, 2019

Why Do Chiral Separations
There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted
Salt
either racemates or enantiomerically pure.
Reduce salt concentration to allow proteins • Enantiomers: Same chemical and physical
to elute in order of hydrophobicity (least properties, but can have very different behavorial
hydrophobic elutes first). properties.
• It is important to characterize each enantiomer.

Protein elution on HIC stationary phase
24 December 12, 2019 There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted 13 December 12, 2019 There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444 Agilent Restricted
!49
SAX/WAX – Strong anion exchange and weak anion exchange
HPLC/UPLC: Metodi
SCX/WCX – Strong cation exchange and weak cation exchange
Resin Type Cation Anion

Exchange Exchange
Cromatografia liquida a scambio ionico in proteomica
Net charge
Nella cromatografia a scambio of molecule ionico +per _
of interest
a p p l i c a z i o n i i n p ro t e o m i c a , l e p ro t e i n e
Charge of _
interagiscono con la fase stazionaria resin
a causa
+
della loro carica. La tecnica richiede un’eluizione
a gradiente.
La separazione si basa sulle differenze nel grado

di carica.
IEX Mechanism Example

Il campione è iniettato in una fase mobile Basic
Basic proteinprotein
on strongon strong
cation cation
exchange packingexchange packing
costituita da un tampone con una bassa
concentrazione di sali per legare le proteine alla Low salt to bind High salt to elute
colonna.
Le proteine sono tipicamente eluite ad un pH

costante ed aumentando il gradiente di sali (ossia
aumentando la forza ionica della fase mobile).
Proteine molto cariche si legano più fortemente Elution order will correlate with number of
positive charges
ed è quindi necessario aumentare la forza ionica
per eluirle.
Una tipica fase mobile conterrà NaCl o KCl.
Non è una tecnica denaturante https://www.agilent.com/en/academia
!50
HPLC/UPLC: Metodi
Cromatografia liquida di affinità
Nella cromatografia di affinità si separano miscele

biochimiche basate una interazione altamente
specifica fra un antigene ed un anticorpo, un
Analytical Bio-Monolith Protein A and G Colum
enzima ed un substrato, un recettore ed un
legando, o proteine e acidi nucleici.
Used for Features
La cromatografia d’affinità è una tecnica molto • Fast screening of harvest cell culture • Bio-Monol
samples for IgG – process (immunoaf
importante che sfrutta l’elevata selettività delle optimization • Monolith ty
interazioni biomolecolari.
• Accurate analysis of mAb quantities independe

to determine protein harvest • Monolith m
Colonne di affinità con Proteina A sono
• Capture and purification of protein for cell debris
generalmente utilizzate per la separazione further characterization
analitica di tutte le IgG, con poche eccezioni.
• Attaches e
fittings
Le colonne di affinità con la Proteina G offrono
una selettività alternativa per quelle molecole di
IgG che non si legano alla proteina A
!51
PC/SEC Separation Mechanism
HPLC/UPLC: Metodi
•
An SEC column is packed with
Cromatografia
porous ad esclusione
beads of controlled porosity dimensionale in proteomica
and particle size
• Sample is prepared as a dilute
solution in the eluent and injected
into the system
• Large molecules are not able to
permeate all of the pores and have
Nella cromatografia ad esclusione
a shorter residence time in the
dimensionale i composti vengono
column
separati in base alle loro dimensioni
• Small molecules permeate deep

In ambitointo the porous la
bioanalitico matrix
SECandè have
una a
long residence time in the column
tecnica cromatografia impiegata per
• qualitativa
l’analisi Sample molecules are separated
e quantitativa di
aggregatiaccording
proteici, tocome molecular
mAbs size,
e
eluting largest first,
coniugati anticorpo-farmaci
smallest last
Terminology of SEC
E’ importante perchè gli aggregati sono
attributi critici di qualità poiché possono SEC – Size exclusion chromatography
alterare efficacia bioterapeutica o Primarily water and buffer
l’immugenicità.There is more to HPLC than Reverse Phase DE.3031944444

December 12, 2019 Agilent Restricted
GFC – Gel filtration chromatography 

Water and buffer, common term for industrial
purification step in the life sciences industry
!52

Lezione 12

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METODI STRUMENTALI IN

Metodi di Separazione: HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC

HPLC/UPLC: colonne, supporti, strumentazione e

Cromatografia liquida su colonna

“A separation technique in which the mobile phase is a liquid…..Present-day liquid chromatography

Constant flow of mobile phase

Analytes Stationary Phase

Column Mobile Phase

da Martin e Synge negli anni ’40, ossia che

Simple pictorial and

Effetto delle diverse dimensioni delle particelle sulla separazione.

Effetto delle dimensioni delle particelle su efficenza e pressione.

• particelle non porose,

• particelle porose e particelle a

Il vantaggio nell’ impiego di particelle

Infatti, poiché la diffusione avviene solo

Sono disponibili in commercio

AdvanceBio Oligonucleotide: 2.7 µm particles, 0.5 µm porous layer, 100 Å pore!1diameter

La silice in quanto tale è impiegata nella

La silice è il materiale per la realizzazione di

Oltre alle popolari fasi alchiliche C8 e C18, sono

sferiche, SPP etc) o sotto forma di particelle totalmente

Sebbene la silice sia di gran lunga il

In particolare è impiegato il polistirene -

Altri polimeri impiegati sono:

Resins based on polystyrene cross-linked with

Le colonne monolitiche non sono

Scanning electron micrograph of a

Micro-Bore Superficially Porous Particles – 300A (pore), 5 µm

1.8 μm particles Superficially Porous Particles –

il miglior compromesso in funzione di:

• Alcune colonne per micro e nanoflussi

Description Diameter Typical flow rate

Microbore column ≥1.0 mm ≤ 2.1 mm i.d. 100–500 μL/min

Narrow-bore column >2.1 mm < 3.9 mm i.d. 500–1500 μL/min

≥3.9 ≤ 5 mm i.d. 1.5–5 mL/min

Per alcune applicazioni (ad

Key Chromatographic Parameters Impacted by

Le dimensioni delle particelle

La cinetica della distribuzione dei soluti tra

è misurata come altezza del piatto teorico

Il fattore di selettività (α) di una colonna per

La risoluzione descrive la capacità di

What happens inside the column?

Superior separation vs Inferior separation

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Retention Time (tr) & Peak Width (Wb)

Resolution – The Fundamental

La selettività ha la massima ⎛ α −1⎞ ⎛ k ⎞

La ritenzione ha solo un'influenza Efficiency Selectivity Retention

L'eﬃcienza descrive il potere di €

di ritenzione di un componente non

Parametri che influenzano il fattore di The figure explains resolution as a function

Composizione della fase stazionaria

Composizione della fase mobile

La selettività è una misura del tempo o

k1 k2i Retention factor of 2nd peak

Parametri che influenzano il fattore di

Composizione della fase stazionaria

Composizione della fase mobile

Eﬃcenza o Numero di piatti teorici

L'eﬃcienza della colonna viene

Parametri che influenzano l'eﬃcienza

Lunghezza della colonna (aumentando

≥3.9 ≤ 5 mm i.d. 1.5–5 mL/min 

E' comunque possibile usare colonne  