Contaglobuli e Citofluorimetria

1 CONTAGLOBULI ................................................................................................................................................... 1
1.1 Storia ................................................................................................................................................................. 2
1.2 Principio di funzionamento ............................................................................................................................... 3
1.2.1 Autocampionatore ..................................................................................................................................... 4
1.2.2 Circuito fluidico ........................................................................................................................................ 4
1.2.3 Unità di elaborazione e controllo .............................................................................................................. 6
Correzione delle coincidenze .................................................................................................................................... 7
2 CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO ........................................................................................................................ 7
2.1 Evoluzione storica ............................................................................................................................................. 8
2.2 Principi generali ................................................................................................................................................ 8
2.3 Principi di funzionamento ................................................................................................................................. 9

La Medicina di Laboratorio, componente fondamentale dei processi diagnosticoterapeutici, è un’area clinica

pluridisciplinare, articolata in settori:
 Chimica Clinica  Biologia molecolare  Allergologia ed Autoimmunità
 Immunochimica  Microbiologia/Parassitologia  Medicina trasfusionale
 Ematologia  Emostasi
 Citofluorimetria  Elettroforesi Immunofissazione
Per ogni settore si individuano diverse linee analitiche, caratterizzate ciascuna da una vasta gamma di esami, che con
una sempre maggiore sensibilità e specificità supporta l’erogazione di servizi essenziali per la diagnosi e la cura.

1 CONTAGLOBULI
L’ematologia è una branca della medicina e, in particolare, della medicina interna che ha ad oggetto lo studio del
sangue, sia sotto il profilo della sua composizione fisiologica, che sotto il profilo della diagnosi e della cura di tutte le
malattie che possono colpire l’apparato circolatorio.
L’immagine mette in evidenza la differenziazione degli elementi del sangue che si può avere durante la fase di studio
ematologico. Quella che interssa a noi in particolare sono le famiglie di granulociti, monociti e linfociti, quindi la
componente leucocitaria
Riportiamo di seguito delle definizioni prese dal CIVAB (rivedere):
 Definizione più ampia di contaglobuli: Esegue automaticamente il conteggio delle cellule del sangue e
determina la concentrazione dell’emoglobina e la distribuzione volumetrica delle cellule.
 Contaglobuli semiautomatico: La diluizione del campione di sangue è effettuata dall’operatore manualmente o
mediante l’utilizzo di un diluitore separato.
 Contaglobuli automatico: La diluizione del campione è eseguita automaticamente dallo strumento.
 Contaglobuli automatico differenziale: Sono capaci di discriminare i leucociti nelle popolazioni costituenti, in
modo parziale (3 popolazioni – granulociti, monociti e linfociti) o completo (5 popolazioni – ulteriore
disciminazione dei granulociti).

La cosa ci interessa perché ad un aumento o ad una diminuzione del conteggio cellulare di questa o quella popolazione
può corrispondere una specifica patologia. È evidente l'importanza di avere a disposizione una strumentazione
adeguata in grado di soddisfare questa esigenza di discriminazione e conteggio rapido ed accurato delle cellule
ematiche.
Le tecniche al momento più usate nella gran parte dei contaglobuli per il conteggio dei leucociti, eritrociti e piastrine,
sono 3:
1. rivelazione della luce diffusa (optical light scattering)
2. variazione di conducibilità o impedenza elettrica (tecnica impedenziometrica)
3. radiofrequenza (meno usata)

Nella maggior parte dei contaglobuli viene utilizzata una combinazione delle prime due tecniche di misura. La
misurazione dell'emoglobina viene effettuata, invece, per via fotometrica in seguito alla lisi dei globuli rossi effettuata
con lisanti specifici.

1.1 STORIA
Fino alla fine degli anni '50

Il conteggio degli elementi figurati del sangue era effettuato manualmente con
metodo diretto al microscopio ottico mediante camere di conteggio
opportunamente tarate (ad es. camera di Bürker 1 ). Tale metodica presentava
tempi d’esecuzione particolarmente lunghi ed i risultati prodotti erano affetti da
errori d’imprecisione dovuti alla notevole diluizione del campione (soprattutto
nel caso dei globuli rossi), alla sua preparazione ed infine al conteggio.
Successivamente fu proposto come metodo indiretto la misurazione dell'assorbanza2 di
sospensioni di globuli rossi, ma poiché questo metodo non teneva conto delle
dimensioni delle cellule, del colore del siero o dell'eventuale agglutinamento degli
eritrociti fu rapidamente abbandonato.

1
Camera di Burker: Nella parte centrale di questo grosso vetrino è disegnato un reticolo all'interno del quale si conteranno i
leucociti. Alcune camere presentano 2 reticoli separati da un incavo che, impedendo la commistione di sangue da una zona
all'altra del vetrino, permettono l'esecuzione di due conte sullo stesso strumento. E' necessario applicare un vetrino coprioggetto
sopra la camera, assicurandolo con le apposite alette metalliche. Il sottilissimo spazio che si viene a creare fra i 2 vetrini sarà
riempito per capillarità con una goccia del liquido in esame.
2
L'assorbanza: (in passato densità ottica, indicata con D) in spettroscopia è definita come il logaritmo decimale dell'inverso della
trasmittanza: dove I0 e I1 sono le intensità della luce incidente e della luce che emerge dal campione attraversato ad una data
lunghezza d'onda. L'assorbanza è in relazione lineare con la concentrazione di un campione per concentrazioni sufficientemente
basse secondo la legge di LambertBeer. Attraverso tale relazione, le misure di assorbanza sono alla base dell'analisi chimica
quantitativa per spettrofotometria.
Per diminuire l’intervento umano, volendo ridurre quindi soggettività e errori, si è cercato di inserire sempre di più
automazione nel processo.
Anni '70

Furono progettate delle strumentazioni capaci di automatizzare le procedure di preparazione del campione e di
conteggio.
Erano costituite da:
 un dispositivo per l'applicazione di una pellicola del campione di sangue sulla lastrina di supporto
 una stazione di lettura, dotata di microscopio e telecamera per l'acquisizione delle immagini
 un'unità d’elaborazione dati per l'interpretazione delle immagini acquisite mediante tecniche informatiche di
riconoscimento di configurazione (tecniche pattern recognition).
Il loro utilizzo risulta limitato per gli elevati costi d’acquisizione, la scarsa produttività e, in particolare, per
l'inaffidabilità statistica dei risultati prodotti, derivante dall'esiguo numero (100 -200) di cellule esaminate.
Nella tecnica di conta a flusso continuo gli elementi corpuscolati del sangue sono trasportati alla camera di misura da
una corrente fluidica continua (tecnica della citometria a flusso) dove sono esaminati singolarmente.
Una caratteristica importante, dal punto di vista statistico, di questa tecnica è l'elevato numero di cellule (dell'ordine
delle decine di migliaia) conteggiate nel corso dell'analisi, tale da determinare una diminuzione dell'errore
d’imprecisione per i parametri analitici misurati o derivati.
Anni’70 fino ad oggi

Lo sviluppo di sistemi di conteggio a flusso continuo a conducibilità elettrica ed a lightscattering (diffusione

luminosa) rappresentò una tappa decisiva nel processo d’automazione del laboratorio di ematologia clinica.
Dapprima, furono introdotti i contaglobuli che sfruttavano il principio della variazione di conducibilità elettrica che
ancora oggi è largamente utilizzato.
In seguito, sul finire degli anni '80, fecero la loro comparsa i contaglobuli utilizzanti rivelatori a radiofrequenza.
Allo scopo di prevenire le possibili contaminazioni con i campioni di sangue per il personale addetto ai contaglobuli,
sono stati introdotti dei sistemi di miscelazione automatica ed inoltre degli autocampionatori in grado di prelevare
direttamente la quantità necessaria di sangue per il conteggio.
In commercio, al momento, esistono numerosi modelli di contaglobuli che si distinguono per principio di
funzionamento o per numero e tipo di parametri misurati e per la possibilità, o meno, di discriminare le diverse
popolazioni leucocitarie.

1.2 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO

Quello che andiamo a misurare è
Emocromo:
 RBC (conteggio eritrociti)
 WBC (conteggio leucociti)
 Hgb (emoglobina – via fotometrica)
 HCT (ematocrito)
 MCV (volume corpuscolare medio)
 MCH (concentrazione emoglobinica media)
 MCHC (concentrazione corpuscolare emoglobinica media)
 RDW (coefficiente di distribuzione degli eritrociti)
Piastrine:
 Plt (conteggio piastrine)
 PCT (piastrinocrito)
 MPV (volume piastrinico medio)
Conta differenziale leucocitaria di:
 Linfociti
 Monociti
 Neutrofili
 Eosinofili
 Basofili

La cosa importante è la discriminazione che si riesce a fare della componente leucocitaria.

L’architettura comune a tutti questi strumenti, al di là delle fasce tecnologiche-prestazionali è quella descritta di
seguito. Si possono distinguere delle sezioni funzionali comuni a tutti gli strumenti:
 Autocampionatore
 Circuito fluidico
 Unità di conteggio e misura ed unità di elaborazione e controllo

1.2.1 Autocampionatore
(Questa parte del contaglobuli è generalmente opzionale e quindi di solito non è integrata nello strumento).

L'autocampionatore svolge una fase preliminare dell’analisi vera e propria riducendo la parte di preparazione del
campione dovuta all’operatore: consente l'automazione delle fasi di miscelazione, preparazione ed aspirazione del
campione (anche direttamente da provetta con tappo). Questo ha consentito:

 un miglioramento della riproducibilità del responso analitico finale

 la riduzione dei rischi di contaminazione per il personale addetto
 un aumento della produttività analitica del laboratorio

1.2.2 Circuito fluidico

Le stesse cose di cui vi parlo adesso, sono simmetriche, speculari nella citofluorimetria che non ha fatto altro che
stressare questi concetti portarli ad un livello di analisi superiore dal punto di vista della specifici e della quantità,
soprattutto di conteggio che è in grado di eseguire.

È la parte che assolve ai compiti di preparazione del campione per la fase di

conteggio (aspirazione, diluizione, miscelazione con i reagenti e
movimentazione), lavaggio del sistema ed eliminazione dei liquidi di scarico
prodotti.
Il campione, aspirato mediante una pompa a vuoto o peristaltica, è
convogliato ad una valvola che lo suddivide in aliquote. Ciascuna frazione,
miscelata con i rispettivi diluenti e reagenti, è avviata al relativo canale
analitico di misura.
La diluizione riporta la concentrazione cellulare nei limiti di rivelazione delle
unità di conteggio e misura; è effettuata con liquidi che garantiscono il
mantenimento della morfologia delle cellule che devono essere misurate,
provvedendo eventualmente alla lisi differenziata di altre cellule che potrebbero interferire nel conteggio. La
diluizione si rende necessaria poiché È noto che i globuli rossi sono normalmente 600/700 volte più numerosi degli
stessi globuli bianchi. Quindi, i globuli bianchi sono contati dopo aver operato una lisi selettiva dei globuli rossi per
far in modo che non interferiscano con la conta.
L'avvinamento delle tuberie e la movimentazione del campione ematico è assicurata da pompe, tipicamente a
membrana, che producono un flusso costante nelle camere di conteggio.
Tali pompe mantengono, inoltre, costante il flusso di soluzione isotonica in modo da costituire una guaina fluidica
(sheath) di focalizzazione, coassiale all’apertura cilindrica attraverso cui il campione fluisce. Mediante
quest’accorgimento si ottiene la collimazione del fascio cellulare durante la fase di conteggio e si evita il ricircolo, per
turbolenza, delle cellule nella camera di lettura.
Le dispensazioni dei reattivi e dei liquidi di diluizione sono affidate a pompe a siringa in grado di erogare volumi in
modo preciso e accurato. Sono utilizzate, ad esempio, nel canale di dosaggio dell'emoglobina oppure in canali di
tipizzazione leucocitaria.
Lo scarico dei reflui derivanti dalle operazioni di conteggio e misura è convogliato in appositi contenitori mediante
un sistema di aspirazione a vuoto.
Unità di conteggio e misura
Il conteggio può avvenire secondo 4 metodiche, 2 fondamentali e 2 più particolari:

1.2.2.1 Conducibilità elettrica

La camera di conteggio è costituita da una piccola apertura cilindrica (orifizio) e da due elettrodi, uno interno e
l'altro esterno alla camera, mantenuti ad una certa differenza di potenziale.

Il liquido di diluizione assicura la conducibilità elettrica nel tratto compreso tra i due elettrodi e, quindi, pure
attraverso l'orifizio.

https://www.youtube.com/watch?v=R_-nf0J3i1w
Nel momento in cui l'apertura è impegnata da una cellula si verifica una brusca diminuzione di conducibilità elettrica
tra i due elettrodi dovuta all’elevata resistività specifica cellulare. Come conseguenza di ciò si ha la generazione di un
impulso di tensione ai capi degli elettrodi. L'intensità e la frequenza degli impulsi registrati sono direttamente
proporzionali rispettivamente alle dimensioni ed al numero delle cellule presenti nel campione in esame.
Il liquido di diluizione assicura la conducibilità elettrica nel tratto compreso tra i due elettrodi e, quindi, pure
attraverso l'orifizio. Le aperture presentano diametro variabile (da 50 a 120 μm) a seconda della popolazione cellulare
considerata.
Questo è il metodo più radicato che viene ancora molto utilizzato
Per limitare gli errori di conteggio dovuti a formazione di agglomerati cellulari (quando il fascio non è ben collimato),
presenza di bolle d'aria in fase d'aspirazione, passaggio contemporaneo di più cellule attraverso l'apertura (coincidenza
spaziale) è prevista la presenza su ciascun canale di due o più camere di conteggio operanti in parallelo i cui
rispettivi conteggi sono mediati tra loro per ottenere il risultato finale.
Per la differenziazione dei leucociti si collassano le membrane citoplasmatiche dei globuli bianchi utilizzando un
lisante specifico e, quindi, dall'analisi della distribuzione dei segnali raccolti, sono valutate le dimensioni dei nuclei,
elemento sufficiente ad effettuare una prima discriminazione delle varie popolazioni leucocitarie (per esempio
linfociti, monociti e granulociti).

1.2.2.2 Diffusione luminosa

La camera è costruita in quarzo per consentire la rivelazione del campione mediante diffusione luminosa. Il passaggio
delle cellule attraverso l'orifizio provoca la diffusione di un fascio luminoso prodotto da una sorgente di luce
continua (lampada al tungsteno) o, nel caso più frequente, discreta (laser). Per la tipizzazione di ciascuna cellula è
prevista la registrazione della luce diffusa a diverse angolazioni, mediante un sistema di lenti, di fenditure e di
fotorivelatori:
1. luce di scatter diretta a 0° e quella ortogonale a 90° per identificare granulociti, linfociti e monociti
2. luce di scatter ad angoli piccoli a 10° e depolarizzata a 90° per individuare rispettivamente i granulociti basofili
ed eosinofili.

Il primo tipo di luce rilevata ci permette di distinguere granulociti, linfociti e monociti, la seconda ci permette di
discriminare ulteriormente i granulociti in basofili e eosinofili.
In alcune strumentazioni i leucociti sono differenziati mediante colorazione citochimica indotta dall'enzima
perossidasi contenuto nella cellula.

1.2.2.3 Radiofrequenza
È una tecnica recente, anche se meno usata, che sfrutta l'interazione di un fascio di onde elettromagnetiche a
radiofrequenza con le cellule che attraversano l'apertura di conteggio. Dall'intensità degli impulsi prodotti, trasmessi
ad un rivelatore, si ricavano informazioni sulla densità citoplasmatica e sulle dimensioni dei nuclei. In questo caso la
differenziazione leucocitaria avviene in modo non invasivo senza alterare la morfologia ed il contenuto della cellula
con l’aggiunta di lisanti o di reattivi cromogeni usati dai metodi esaminati in precedenza. Tale metodo è utilizzato in
accoppiata al metodo resistivo. Le cellule analizzate sono distribuite in uno scattergram bidimensionale che riporta in
ascissa la rivelazione resistiva per il dimensionamento cellulare, mentre in ordinata la rilevazione in radiofrequenza
per la struttura cellulare interna.

1.2.2.4 Fotometria
La metodica fotometrica è impiegata nel canale dedicato alla determinazione dell'emoglobina presente nel campione
di sangue. La camera di reazione e misura è costituita da una celletta nella quale è trasformata e dosata l'emoglobina.

Il procedimento seguito prevede la trasformazione dell'emoglobina in cianmetaemoglobina mediante lisi

eritrocitaria, reazione con cianuro di potassio dell'emoglobina liberata, e lettura fotometrica dell'assorbanza della
cianmetaemoglobina prodotta.

In alcune strumentazioni è disponibile anche un reattivo lisante alternativo al cianuro.

1.2.3 Unità di elaborazione e controllo

Ha il compito di produrre i risultati di conta e differenziazione degli elementi figurati del sangue mediante analisi
della sequenza di impulsi prodotti durante la fase di conteggio.
Provvede, inoltre, al controllo operativo delle unità funzionali dello strumento (ad esempio circuito idraulico, camere
di conteggio e misura). Il processo di elaborazione si articola nelle fasi di:
1. selezione degli impulsi e conteggio
2. correzione delle coincidenze
3. refertazione

Selezione impulsi e conteggio

Gli impulsi relativi ad una particolare classe di cellule sono contati dopo esser stati discriminati, in base alla loro
ampiezza, dal rumore di fondo e da quelli derivati da altre popolazioni cellulari. La selezione è realizzata
mediante un circuito di comparazione (ad es. a soglia) che conta gli impulsi di potenziale corrispondenti solo a
particelle di un determinato volume (selezione "a priori"), oppure per analisi dell'istogramma delle ampiezze di tutti i
segnali raccolti in fase di conta (selezione "a posteriori"). In quest'ultimo caso l'individuazione ed il conteggio di una
particolare popolazione avviene per integrazione della regione di istogramma che a lei compete, isolata e definita da
soglie inferiori d'ampiezza del segnale opportunamente regolabili. Il risultato dell'integrale è pertanto proporzionale al
numero di particelle transitate attraverso l'apertura nell'unità di tempo.
Correzione delle coincidenze
L'errore da coincidenze, derivante da due o più cellule che impegnano contemporaneamente l'apertura di conteggio, è
ridotto mediante camere di rivelazione multiple operanti in parallelo.
Da ciascuna apertura è verificata in tempo reale, mediante analisi statistica, la presenza contemporanea di segnali spuri
la cui ampiezza si differenzia significativamente dalla media. La reiezione di tali segnali limita notevolmente
l'incertezza da coincidenze.
Refertazione
I risultati delle misure possono essere presentati, su video e/o stampante, sotto forma numerica, in termini di
concentrazione cellulare assoluta o relativa (caso della tipizzazione leucocitaria) del campione di sangue esaminato,
oppure mediante rappresentazioni grafiche bidimensionali del tipo istogrammi e citogrammi.

Mediante istogramma sono differenziate le popolazioni cellulari riportando in grafico le frequenze e le ampiezze dei
segnali registrati.
La rappresentazione con citogramma è invece di tipo puntuale ed è presente in contaglobuli provvisti di almeno due
sistemi di rivelazione.
In tali laboratori, per esigenze specifiche, i contaglobuli possono essere affiancati da citofluorimetri che consentono
una migliore tipizzazione delle diverse popolazioni cellulari in termini di morfologia e di diverso grado di maturità
degli elementi figurati del sangue.

2 CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO
È l’evoluzione della tecnica del contaglobuli. La citofluorimetria a flusso è una tecnica di misurazione
multiparametrica di caratteristiche fisiche e/o chimiche condotta su cellule in sospensione all’interno di un fluido di
trasporto. Le cellule/particelle passano allineate attraverso un sistema di rilevazione ottico/elettronico.

https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio
Rende possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cellule ad una velocità molto rapida, permettendo una
dettagliata analisi qualitativa e quantitativa. Il tipo di parametri attualmente rilevabili in citofluorimetria a flusso è
molto ampio: volume e complessità morfologica delle cellule, contenuto di pigmenti, DNA, RNA, proteine, antigeni
di superficie ed intracellulari, pH, flussi di Ca++, etc.
Aspetto peculiare della citofluorimetria a flusso, soprattutto se paragonata alla tecnologia precedente – strettamente
connesso alla possibilità di analizzare contemporaneamente più fluorescenze – è quello di raccogliere e memorizzare
molti parametri per ogni singola cellula analizzata, parametri che correlati tra loro permettono di individuare e studiare
sottopopolazioni (anche rare) di cellule.
Alcuni citofluorimetri sono inoltre in grado di separare fisicamente, secondo criteri stabiliti dall’utilizzatore,
popolazioni cellulari raccogliendole sia in provette che su micropiastre.

2.1 EVOLUZIONE STORICA

La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni ‘70, determinando un veloce ed intenso
sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le
misure fisiche e l’altro per la fluorescenza.
La CFM portò grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali
marcati con fluoresceina isotiocianato (FITC). La grande complessità del sistema immunitario e la presenza di diverse
subpopolazioni che reagivano con lo stesso anticorpo stimolarono:
 lo sviluppo di MoAb sempre più specifici;
 la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi;
 la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici

Gli anticorpi monoclonali (MoAb) costituiscono un insieme di anticorpi identici fra di essi in quanto sono prodotti
da linee cellulari provenienti da un solo tipo di cellula immunitaria (quindi un clone cellulare). Dato un qualsiasi
antigene, è possibile creare uno o più anticorpi monoclonali in grado di legare specificamente un suo determinante
antigenico; questo implica la possibilità di individuare, neutralizzare o purificare la sostanza in oggetto. Questa
importante caratteristica degli anticorpi monoclonali li rende uno strumento estremamente efficace in biochimica,
biologia molecolare, diagnostica e medicina. Quando tali anticorpi vengono utilizzati in campo terapeutico, il nome
dell'anticorpo termina con il suffisso -mab.
I primi problemi furono:
 trovare coloranti che potevano essere coniugati agli Ab senza modificare la loro capacità di legame
all’antigene;
 selezionare fluorocromi con spettri distinti di emissione.

Negli ultimi anni la CFM ha raggiunto una notevole diffusione, sia in laboratori clinici che in laboratori di ricerca.
Fattori che hanno contribuito a questo notevole sviluppo:
 la possibilità di utilizzare più laser di emissione, che permette di effettuare analisi multiparametriche a 4 e
più colori;
 la disponibilità di MoAb marcati con un’ampia gamma di fluorocromi e diretti contro una larghissima
varietà di Ag di membrana e/o intracellulari;
 la riduzione dei costi e della complessità nell’utilizzo dello strumento.

2.2 PRINCIPI GENERALI

Le sostanze fluorescenti, o marcatori, hanno la capacità di assorbire certe lunghezze d’onda quando vengo eccitate e di
emettere un’altra lunghezza d’onda diversa da quella di assorbimento. Tra le sostanze più diffuse in citometria
abbiamo i fluorocromi, con i quali vengono coniugati gli anticorpi monoclonali in modo da poter identificare una
determinata popolazione.
La fluoresceina è un fluoroforo comunemente usato in miscroscopia, in alcuni tipi di laser a coloranti o pigmenti, in
campo forense per la rilevazione di tracce ematiche, e come mezzo tracciante. Ha un massimo di assorbimento a 494
nm e un massimo di emissione di 521 nm (in acqua).
Esistono diversi derivati della fluoresceina: il più importante è la fluoresceina isotiocianato (FITC).
Originariamente si lavorava prevalentemente con due fluorocromi, FITC (isotiocianato di fluoresceina) e PE
(ficoeritrina) ai quali si sono aggiunti in tempi recenti i fluorocromi Tandem ECD (energy coupled dye) e PC5
(ficoeritrina cianina).
Tutti questi fluorocromi vengono eccitati con un laser ad Argon con una lunghezza d’onda di 488nm. Le rispettive
emissioni sono:
FITC = 525 nm PE = 575nm ECD = 620nm PC5 = 675nm
Permette di analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo (50.000 cellule in pochi secondi), quantificando
numerosi parametri per ogni singola cellula.
Permette ad es. di determinare il contenuto di DNA, di RNA, i diversi sottotipi cellulari, gli organelli
intracellulari, l’attività di alcuni enzimi.
 Studio della ploidia (=il numero delle serie (omologhe) di cromosomi presenti in una cellula) e della
proliferazione cellulare;
 Analisi del ciclo cellulare;
 Analisi immunofenotipica multiparametrica;
 Risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (cellule antigene specifiche,
produzione di citochine, ecc);
 Livelli di apoptosi, ossia forma di morte cellulare programmata, in patologie associate a deplezione
cellulare (es. AIDS) o accumulo cellulare (tumori);
Vantaggi
 possibilità di analisi multiparametrica
 elevato numero di cellule esaminate
 rapidità dei tempi di analisi (oltre 1000 cellule/s)
 obiettività, riproducibilità e affidabilità statistica delle letture
 campioni possono essere processati senza perdere la vitalità cellulare
Limiti
 analisi di cellule molto rare, che a causa del loro ridotto numero in confronto agli eventi analizzati
potrebbero essere difficilmente separabili dal “rumore di fondo”
 necessità di dover lavorare con campioni in fase monodispersa
 Impossibilità di localizzare la sede di provenienza del segnale in caso di contemporanea presenza di
marcatori nei diversi compartimenti cellulari

2.3 PRINCIPI DI FUNZIONAMENTO

Una sospensione cellulare monodispersa (cellule da sangue periferico, aspirato midollare, ecc) viene iniettata in un
sistema fluidico il quale tende, in opportune condizioni idrodinamiche, a trasportare le cellule in maniera separata e
ordinata fino al punto di misura, dove incontra il fascio di luce focalizzata proveniente dal laser. L’incontro tra il
raggio di luce e ogni singola cellula presente nel flusso cellulare genera dei segnali.
Questi segnali sono legati alle caratteristiche fisiche della cellula e alla presenza di molecole fluorescenti. I segnali
sono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici, e inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori)
che ne misurano l’intensità.
I segnali elettrici provenienti da ogni sensore, opportunamente amplificati e digitalizzati, sono inviati ad un
analizzatore di dati che provvede alla loro visualizzazione su monitor, rappresentazione grafica, e definizione
statistica.
Circuito fluidico: simile a quello visto nel contaglobuli. Le cellule in sospensione sono iniettate in una guaina fluidica
costituita da soluzione isotonica mantenuta a pressione opportuna da pompe peristaltiche od a membrana.
Unità di conteggio e misura: in questo caso il tipo di conteggio è light-scattering. L’unità di conteggio e misura è
costituita da sorgenti di radiazioni tipo laser ad elio neon o ad argon oppure da una lampada a vapori di mercurio
Separatore cellulare (sorter o “catcher tube”): un ulteriore elemento non presente nel contaglobuli, atraverso delle
piastre di deflessione, decide se la cellula che passa il raggio risponde ai parametri impostati, quindi la cattura e la
deposita in tubi di raccolta.
Unità di controllo ed elaborazione dati: provvede a visualizzare i dati d’analisi ottenuti sotto forma di istogrammi o
logaritmici; esistono anche dei software che calcolano, analizzano, immagazzinano ed esportano direttamente un gran
numero di dati.

Il sistema fluidico: il sistema di dispensazione del campione

liquido fornisce un efficiente mezzo in grado di presentare
individualmente le cellule del campione alla stazione di misura, dove
intersecano il raggio di luce emesso dal laser. E’ importante evitare
la formazione di aggregati cellulari. La velocità di efflusso delle
cellule viene valutata come numero di eventi al secondo: numero di
particelle che hanno incontrato il raggio di luce nell’unità di tempo
Le cellule monodisperse (da sangue periferico, da aspirato midollare,
agoaspirato da tessuti solidi…) vengono aspirate in una camera a
flusso, dove vengono diluite e allineate tramite un sistema fluidico a
flusso laminare.
Nel flusso coesistono una corrente interna ed una esterna, la quale
confina la sospensione cellulare al centro del flusso. La pressione di
spinta e la diluizione del campione consentono di contare fino a
qualche migliaia di cellule al secondo.
La differenza di pressione tra il campione ed il liquido di
scorrimento influenza il volume e la velocità di flusso del
campione. Più grande è tale differenza e più largo è il
volume del campione. Se la differenza è troppo alta, le
cellule non si allineano più correttamente e più cellule
passano contemporaneamente sotto il laser.
Sorgenti luminose: Nella grande maggioranza dei citofluorimetri si utilizza una sorgente luminosa ad ioni Argon
centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). Tale luce consente una efficace misura dei parametri fisici, inoltre
permette la contemporanea eccitazione di diversi fluorocromi. Se è necessario utilizzare altre lunghezze d’onda
bisogna utilizzare altri tipi di laser (es. Kripton, HeNe, ecc) Un’alternativa più economica è costituita dall’uso dei
citometri a lampada, che hanno come fonte di eccitazione una lampada a vapori di Mercurio o Xenon che non richiede
particolari sistemi di raffreddamento. Sono utili per le applicazioni che riguardano particolari fluorocromi (es quelli
utilizzati per la marcatura del DNA). I limiti sono bassa potenza erogata, scarsa stabilità della luce di emissione,
rapido decadimento motivo per cui si prediligono le fonti discrete.
Il laser a elio-neon, detto anche laser HeNe, è un piccolo tipo di laser a gas. Questi laser hanno molti usi industriali e
scientifici e sono spesso impiegati in dimostrazioni di ottica in laboratorio. Nel loro funzionamento normale operano
ad una lunghezza d'onda di 632.8 nm, nella parte rossa dello spettro
visibile.
Parametri fisici: quando viene colpita dal fascio di luce emesso dal
laser, la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie
caratteristiche fisiche e morfologiche, per fenomeni di rifrazione,
riflessione, e diffrazione.
In particolare:
 la luce dispersa in avanti (forward scatter, FSC) è legata alle
dimensioni delle cellule
 la luce riflessa a 90° (side scatter, SSC) è da attribuire a parametri
della morfologia cellulare come la granulosità del citoplasma, il
rapporto nucleo/citoplasma, la rugosità di superficie.
La misura combinata di FSC e SSC permette di distinguere diversi tipi
cellulari in una popolazione eterogenea di cellule.

L’analisi multiparametrica, uno dei più potenti aspetti della citofluorimetria a flusso, permette di affrontare i problemi
biologici della eterogeneità cellulare. Sfrutta due operazioni fondamentali della CFM: il gating e il sorting.
Gating: è un analisi a posteriore, utilizzando una finestra elettronica, permette di isolare una determinata popolazione
da tutte le altre cellule, e di analizzare i parametri successivi solo all’interno della popolazione.
Sorting: è un gating reale, che consente di raccogliere fisicamente le popolazioni che sono state separate dal resto
della miscela. Si stabiliscono delle finestre di selezione per identificare le popolazioni di interesse che verranno
separate e raccolte in provette distinte.
Le cellule mantengono la vitalità dopo il sorting!
Citofluorimetri a circuito chiuso: il campione analizzato viene perso
Citofluorimetri a circuito aperto: il campione incontra il fascio di luce laser in aria, per poi essere recuperato
selettivamente dopo il sorting.
Il campione fluido viene frammentato in minuscole goccioline, ognuna delle quali contiene una singola cellula.
Le goccioline vengono caricate elettricamente e deviate mediante piastre di deflessione negli appositi raccoglitori.

Quanto visto finora non rappresenta nulla di molto dissimile da quello che avviene nel contaglobuli, un fattore che
invece rappresenta un’unicità di questa metodica è legato alla fluorescenza (immagine sopra a destra). La fluorescenza
permette di dare una serie ulteriore di informazioni relative al nostro campione. In citofluorimetria vengono rilevati
segnali fluorescenti generati:
1. dall’utilizzo di MoAb marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc) specifici per antigeni presenti
sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo;
2. da fluorocromi che si legano in maniera stechiometrica a determinate sostanze come il DNA e l’RNA.
Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d’onda per l’eccitazione e l’emissione. Limiti alla scelta di
fluorocromi da utilizzare in combinazione:
 La lunghezza d’onda di eccitazione
 Le bande di emissione devono essere sufficientemente separate da permettere la loro appropriata misurazione.
Detto in maniera semplicistica
 Un laser a 488 nm è capace di eccitare il fluorocromo
 il fluorocromo eccitato sale nel livello successivo della nuvola
elettronica
 il fluorocromo ritorna al livello originale e rilascia l’energia in
eccesso come fotone che viene rilevato dal sistema
Quindi fluorocromi diversi hanno lunghezze d’onda diverse. L’eccitazione proviene dal laser. Ci sono 4 diverse
opzioni: 488nm Blue, 633nm Red, 405nm violet, 350nm UV. La lunghezza d’onda di emissione è più alta di quella
di eccitazione e attraverso un sistema di filtri e specchi è possibile separare le diverse lunghezze d’onda ed inviarle a
diversi detettori.
Ci sono 4 tipi di filtri:
 Long Pass: passano le lunghezze d’onda superiori al filter number
 Short Pass: passano le lunghezze d’onda inferiori al filter number
 Band Pass: passano le lunghezze d’onda comprese fra 2 filter
number
 Dichroics: riflettono le lunghezze d’onda superiori e inferiori al
filter number
Nonostante il complesso sistema di lenti, specchi e filtri, e l’attenzione
posta nella selezione di fluorocromi con spettri di emissione separati,
succede che una radiazione di una certa intensità di un fluorocromo si
sovrappone alla lunghezza d’onda del fluorocromo successivo. È
necessaria dunque un’opera di compensazione, processo che ha lo scopo, dal punto di vista dell’elaborazione finale
dei grafici in uscita, di sottrarre da un certo canale una quota fissa di segnale relativo all’emissione di un altro
fluorocromo.

Dal punto di vista rappresentativo, vale quanto detto prima. Esistono

diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. La
rappresentazione più semplice è costituita dall’istogramma dove l’ascissa
riporta l’intensità di fluorescenza (FI) e l’ordinata il numero di cellule
che esprimono o meno l’antigene (diagramma di distribuzione).
L’analisi statistica si basa sull’impostazione di cursori che delimitano le
aree di interesse, e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano
in tali aree.
Per ogni picco è possibile calcolare dati statistici (valore medio, deviazione
standard, coefficiente di variazione, ecc.)
Oltre all’istogramma, è possibile utilizzare una serie di rappresentazioni bidimensionali, che permettono di mettere
in correlazione due parametri tra di loro (Citogramma)
 Dot plot a 2 colori: FI del parametro 1 vs. FI del parametro 2
 Contour Plot a 2 colori: FI di P1 vs Fi di p2. Si formano cerchi concentrici attorno alle popolazioni cellulari.
Più è densa la popolazione più i cerchi sono ravvicinati uno all’altro
 Density plot a 2 color: FI di 1 vs FI di P2; aree a densità più alta hanno colori diversi dalle altre