Lezione 13

METODI STRUMENTALI IN
CHIMICA ANALITICA
Metodi di Separazione: HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC

Prof. Ilaria Palchetti,
moodle ID: metodi2021 2
HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC
HPLC/UPLC: colonne, supporti, strumentazione e

metodi
Cromatografia multidimensionale
Cromatografia liquida a nanoflussi: NanoLC
Elettrocromatografia
3
2D LC
We will delve into why and how this happens in Chapter 2 “Principles of
2D-LC”. Thus, under ideal circumstances (no remixing and uncorrelated
selectivity) the resolving power of a 2D separation is much greater than of
a 1D separation.
Column
Pump Autosampler Detector
1D Chromatogram
Schema a blocchi di una tipica

strumentazione 1D-LC
https://www.agilent.com/en/academia
Pump
Column
Detector Valve
Pump Autosampler
(optional) (Sampler)
4
Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021

1D Chromatogram
2D LC
Pump
Column
Detector Valve
Pump Autosampler
(optional) (Sampler)
Column
Detector
Schema a blocchi di una tipica
strumentazione 2D-LC.
Nella prima colonna l’eluizione è isocratica
nella seconda è a gradiente (rapido).
I dati sono riportati come diagramma
bidimensionale.
2D Chromatogram
Figure 4. 5

2D LC Agilent 1290 Infinity
2D-LC Solution
Cromatografia liquida bidimensionale
La colonna di separazione 2D e il
relativo rivelatore possono essere
considerati come un sistema di analisi
selettivo che agisce sull'eluato in
uscita dalla colonna della prima
dimensione (del primo cromatografo).
Per cui se non si ha un remix (o
comunque se il rimescolamento è
minimo) dei composti separati dalla
colonna 1D passando dalla prima alla
seconda colonna a causa del
processo di campionamento, il potere
risolutivo della seconda dimensione
moltiplica quello della prima
dimensione.
6
1
2D LC
[mAU] First dimension

3000
2500
2000
1500
In figura, si può osservare l’aumento 1000
500
di risoluzione ottenibile accoppiando
0
la seconda separazione alla prima 0 5 10 15 20 25 30
Time [min]
dimensione.
[mAU] Second dimension

60
La separazione 2D è completata in 50
pochi secondi. Si possono raccogliere 40
un centinaio di cromatogrammi in 30
poco più di 30 minuti.

20
10
0
0 5 10 15 20
Retention time [s]
Figure 1.3 The peak in the blue stripe taken from the 1D of an online LCxLC chromatogram
is injected into the 2D column. What appears to be a single peak is actually a set of at least
The peak in the blue stripe taken from the 1D of
nine components. The sample was a maize seed extract separated with the following
an online LCxLC chromatogram is injected into
1
D conditions: 2.1 x 50 mm Discovery HS-F5, 5 µm; A: 20 mM phosphate, 20 mM sodium
perchlorate, pH 5.7; B: Acetonitrile; Gradient program 5 %B to 70 %B over 23 min.; 40
the 2D column. What appears to be a single
°C; 0.1 mL/min; 10 µL injection.; 220 nm detector wavelength. 2D conditions: 2.1 x 50 mm
ZirChrom-CARB, 3 µm; A: 20 mM perchloric acid in water; B: Acetonitrile; Gradient,
peak is actually a set of at least nine
0 to 74 %B in 17.4 s; 110 °C, 34 µL injection, 220 nm detector. Adapted from Reference 2.
components. https://www.agilent.com/en/academia

2D LC
The tremendous power of LCxLC is well illustrated by the chromatogram
shown in Figure 1.2. Here we see that a complex biological sample has
been separated into several hundred components in only 30 minutes.
It is currently well beyond the ability of any conventional 1D-LC method
to produce such high resolving power in such a short period of time
regardless of how small the particles used in the column are or how high
is the operating pressure of the instrument.
[mAU]
150
L a c r o m a t o g r a fi a l i q u i d a 100
bidimensionale può essere realizzata 50
20
in due metodiche principali, fra loro 0
15
significativamente diverse. La prima
1 st d
è la 1) comprehensive (indicata come imen5 10
sion 10
[s]
[min
LCXLC); mentre la seconda è 2) la ] 15
ion
5
20
s
en
h e a r t - c u t t i n g c h ro m a t o g r a p h y 25
dim
2 nd
(indicata come LC-LC)
Figure 1.2 A typical comprehensive 2D-LC chromatogram showing the
separation of a complex biological sample.
A typical comprehensive 2D-LC chromatogram
showing the separation of a complex biological
The real power of 2D-LC is that it is a mechanism for greatly increasing
sample.
the resolving power without greatly increasing analysis time.
Two analytically important examples of this enhancement in the power
of 2D-LC relative to 1D-LC are shown in Figure 1.3 and Figure 1.4.

2D LC
Comprehensive
2D-LC 2D-LC (LCxLC):
- Difference between comprehensive 2D-LC
and heart-cuttingTutto
2D-LCl’eluente della prima colonna (LC1) viene iniettato nella
seconda colonna
Comprehensive 2D-LC (LCxLC): (LC2):effluent
The complete un picco
of thedella prima dimensione
first column will be injected to
sarà campionato piùcolumn
the secnd volte (almeno
and will 3
beoanalyized
4 volte). with very fast
gradients, a peak of the first dimension should be sampled
at least 3 to 4 times. The run time of the 2nd dimension
method matches the collection time of the 1st dimension
LC1 efluent. Finally, the peaks will be re-constructed.
LC2
LC2
LC1
1st peak from 2nd peak from 3rd peak from

1st dimension 1st dimension 1st dimension

2D-LC - Difference between comprehensive 2D-LC
and heart-cutting 2D-LC2D LC
and heart-cutting 2D-LC
Heart-cutting
Heart-cutting 2D-LC
2D-LC (LC-LC):
(LC-LC): Only parts of of
the effluent of ofthe first column –
Heart-cutting 2D-LC (LC-LC): Only
Nella parts
modalità the effluent
Heart-cutting the
2D-LC, first
solocolumn
peaks
peaks
alcune eluted
partifrom
eluted from thethe1st1dimension
dell'eluente st dimension
della prima column
column -
becolonna
injected
be injected to to
thethe
- alcuni second
picchisecond column.
eluiti column.
dalla colonna
Typically
della a peak
prima
Typically from
a dimensione
peak fromthethefirst
(LC1) -dimension
first verranno
dimension will
wilb
iniettati
sampled
sampled nella
asasa seconda
whole
a whole colonna
andand (LC2).
with
a gradient
a gradient aa
with lonlo
un gradiente con be
Nella
run time
run 2D
time si utilizza
than
thanthethecollection
collection time
time willunbe
will used.
used
LCLC tempo di esecuzione più lungo rispetto al
1 1 longer
longercolumns
columns with
with higher
higher seperation
seperation efficien
efficie
tempo di campionamento nd nd e le colonne
being used in as 2
sono più lunghe 2rispetto
being used in as dimension
dimensionalla column.
column.
tecnica
comprehensive.
Care
Care
Se must
un mustbebe
picco taken
taken
eluisceif dalla
peaks
if peaks are
are
colonnaeluting
della from
eluting from
first dimension
prima
first column
dimensione
dimension quando
column when
whenè aancora
gradientin onon
a gradient the
t
LCLC esecuzione
second
second un gradiente
dimension
dimension is is
still inrunning
still 2D, il–picco
running this
– thispeak
peak w
2 2
andrà
lost. perso.
lost.
10

2D LC
1D chromatogram
(at first column outlet)
2
2. Transformation
3 Second-dimension chromatograms
stacked side by side
1
Rappresentazione dei dati: il picco 1D

comprende tre componenti chimici
scarsamente risolti, eluiti nell'ordine 1 1. Modulation
(verde), 2 (giallo) e 3 (rosa). I campioni
vengono prelevati a intervalli di tempo
1
st
uguali attraverso il picco 1D non
dim
nsion
en
risolto (processo di modulazione o ime
s
d
io
Raw 2D chromatogram nd
n
2
campionamento). Successivamente, il (at second column outlet)
singolo cromatogramma 1D viene
trasformato in una serie di
cromatogrammi 2D rapidi, ciascuno 3. Visualization
dei quali presenta diversi picchi. 2D colour plot 3D plot
Infine, la serie di cromatogrammi 2D
viene visualizzata riorganizzando la
matrice di dati in contorni, colori e
tipo di trama 3D come mostrato in
Figura.
1
st
dim
en
ion
sio
ns
n
nd d ime
2
11
Metodi Strumentali in Chimica Analitica,

Figure 1.8 Assembly of the collection ofAA
2
2020-2021
D chromatograms into a composite 2D-LC
2D LC
In tabella sono riportate le combinazioni pù comuni First Dimension Second Dimension

delle modalità LC, in cromatografia liquida Reversed Reversed phase
bidimensionale. phase*
La stragrande maggioranza delle applicazioni della
cromatografia bidimensionale consiste nel trattare Ion exchange Reversed phase
campioni reali molto complessi (cellule, sangue, Size exclusion Reversed phase
urine, campioni ambientali…) e nell’analisi di miscele
complesse sintetiche come ad esempio miscele di Normal Phase Reversed phase
polimeri sintetici, in particolare copolimeri. Una HILIC Reversed phase
seconda area di notevole interesse è la ricerca di
biomarcatori. Più specificamente, la cromatografia Ion exchange SEC
bidimensionale (2D-LC) viene utilizzata in
proteomica e metabolomica. Common combinations of LC modes (*
with different separation selectivity).
12

NanoLC
Nano-LC
• NanoLC (nLC) is named after the low
flow rate (200-300 nL/min).
• In Nano LC very low sample volumes

(1μL) are used and very high selectivity
and sensitivity are possible.
• nLC-ESI-MS/MS is mostly used for the

identification of proteins from very
complex mixtures.
13

NanoLC
C0 εT πr 2 (1+ k) 2πLH
D= =
Cmax Vinj
In nano LC si opera con colonne dal
diametro ridotto. dove C0 è la concentrazione del composto iniziale nel
campione (prima dell'iniezione nel sistema LC); Cmax
Una riduzione del diametro interno della è la concentrazione del composto corrispondente al
colonna cromatografica determina una massimo del picco cromatografico; ε è la porosità
minore diluizione cromatografica e, di della colonna; r è il raggio della colonna; k è il fattore
conseguenza, una maggiore di ritenzione; L è la lunghezza della colonna; H è
concentrazione del campione iniettato e l'altezza del piatto teorico; e Vinj è il volume del
campione iniettato.
potenzialmente maggiore sensibilità. Questa equazione vale per eluizioni isocratiche ma si
può estrapolare anche per eluizioni a gradiente.
Journal of Chromatography A, 856 (1999) 117–143
J. Sep. Sci. 2002, 25, 557–568
14

NanoLC: colonne
Description Diameter Typical flow rate UHPLC Capabilities
Nano column
LC ≤20 -100 μm i.d. <50-500 nL/min High efficiency and sensitivity
Good compromise of
Capillary column ≥ 50 μm < 1.0 mm
0.2–100 μL/min efficiency and throughput with
LC i.d.
attention to sensitivity
Good compromise of
Microbore column ≥1.0 mm ≤ 2.1 mm
100–500 μL/min efficiency and throughput with
LC i.d.
attention to loadability
Standard column
≥2.1mm ≤ 5 mm i.d. 1-5 mL/min High-throughput analysis
LC
15

NanoLC: supporto e colonne
In nanoLC sono
commercialmente disponibili
colonne capillari impaccate,
monolitiche. Anche se non
commercialmente disponibili si
possono usare anche colonne
tubolari aperte (OT-LC).
Come suggerisce il nome, le
c o l o n n e c a p i l l a r i O T- L C
mantengono una loro struttura
capillare aperta e possiedono
uno strato sottile di fase
stazionaria legata alla parete.
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2016.04.024
16
NanoLC
Perche’ utilizzare separazioni LC-MS a nanoflussi in colonne dal

diametro ridotto?
Perche’ utilizzare separazioni lcms a nanoflussi?
Nano LC Capillary LC Micro LC HPLC Prep LC
Flusso (µL/min) 0.1 1 10 100 1,000 10,000 100,000
Diam. colonna (mm) 0.05 0.2 1 2 4 50
Guadagno sensibilita’ 6400 400 16 4 1

NanoLC
Le colonne capillari impaccate hanno

diverse lunghezze, e ci sono in
commercio colonne fino a 50 cm per
separare i campioni complessi tipici della
proteomica.
In generale, la maneggevolezza delle

nanocolonne è garantita da un
alloggiamento in poliammide protettivo
per proteggere la silice fusa, che è fragile,
e dall’impiego di connettori integrati per
facilitare le connessioni. Attualmente, le
prestazioni, la robustezza e la facilità
d’uso delle colonne per nanoLC sono
simile a quelle impiegate nelle colonne
standard.
18
NanoLC
Effetti extracolonna e miniaturizzazione
La miniaturizzazione di un sistema
LC, come accade in nanoLC, implica
che tutti i componenti del sistema 8 J. Šesták et al. / J. Chromatogr. A 1421 (2015) 2–17
debbano essere ridimensionati. Oltre

alle colonne e alle connessioni, anche
il sistema di iniezione e i relativi
collegamenti nonchè l’interfaccia al
rivelatore (UV o MS) devono essere
ottimizzati. I flussi in nanoLC sono
generalmente inferiori o uguali a 500
nL/min. Per ottenere un flusso
riproducibile e per la formazione del
gradiente sono necessari approcci Fig. 5. Nano LC sample injection approaches; direct injection with an internal (a), and with an external loop (b); on-line preconcentration on vented column (c), and by
column switching (d).
dedicati.
standard deviation lower than 1% for the peak area can be realized separation as well, but the column is the part where the separa-
with this valve [63]. tion takes place. As it was mentioned before, columns prepared in
Anche per l’introduzione del Nano LC sample injection approaches; direct injection with
3.2. On-line sample preconcentration
the fused silica capillaries having i.d. in a range of 10–100 !m are
referred as nanocolumns.
campione si possono prevedere an internal (a), and with an external loop (b); on-line
Injection of samples in the nanoliter range is intended for
Nanocolumns are mostly laboratory prepared by researchers
according to the actual requirements of the stationary phase chem-
approcci dedicati che hanno la preconcentration on vented column (c), and by column
analytes which have sufficient concentration enabling their easy
detection. Thus, it is not suitable for highly diluted samples. Here,
istry, the particle size, and column diameters. Nano column packing
could be spherical particle- or monolith-based. The first particle
switching (d)
funzione di proteggere la colonna ed the sample preconcentration step is necessary to increase the
detectability of compounds and it can be advantageously per-
packed columns with inner diameters in a range of 20–70 !m
were reported by McGuffin et al. [68], Karlsson et al. [69], and
aumentare la sensibilità. formed on-line by the so-called on-column focusing in nano LC.
An accurate determination of the low abundant analyte of inter-
Kennedy et al. in the 80s of the last century [70,71]. High pres-
sure slurry packing [72] is frequently used for the preparation o
est is required particularly in proteomics, metabolomics or food particle packed columns. Other packing techniques include dry
analysis. On-line preconcentration of analytes from a larger sam- packing [73], packing using supercritical carbon dioxide [74], elec-
ple volume is feasible if the analytes are well retained on the LC 19
trokinetic packing [75], or packing with centripetal forces [76]
column under the initial separation conditions. Fortunately, the Currently, enormous amount of high quality column packing mate-
introduction of a larger volume into the nano LC system is far easier
than the injection of nanoliters of sample because the broaden-
rial is available on the market including various particle size, pore
size, and stationary phase chemistries. Generally, good experience
NanoLC
Dispensare fluidi a flussi molto bassi non è semplice. Attualmente sono utilizzate pompe a pistone
reciprocanti per la stabilità del flusso di queste pompe, oppure pompe a siringa ad razionamento pneumatico.
Le attuali piattaforme di erogazione diretta dei solventi a nanoflussi sono costruite come sistemi a
miscelazione ad alta pressione, dove due solventi vengono continuamente miscelati alla pressione di
esercizio.
Splitless nanoflow gradient pump arrangement; (a) solvent refill system; (b) continuous flow system.

20

slightly supported by a gentle backing pressure on the capillary. Meanwhile, nu-
NanoLC
merous specialized nanoelectrospray emitters – as these capillaries are often
termed – have been developed to deliver optimum performance under various
conditions of operation including nanoLC-MS coupling [86].
nanoESI
Il livello di informazioni strutturali fornite
dalla spettrometria di massa rendono
questa tecnica, il sistema di rilevazione
preferenziale e praticamente obbligatorio
negli studi di proteomica in cui la nano LC
è impiegata come tecnica di separazione.
Sviluppata come tecnica off-line da Wilm

e Mann nel 1994 (Int. J. Mass Spectrom.
Ion Processes, 1994, 136, 167) la Fig.Nanoelectrospray;
12.12. Nanoelectrospray;(a)
(a) SEM
SEM micrograph
micrograph of the of
open endopen
the of a glass
endnanoESI
of acap-
i o n i z z a z i o n e p e r n a n o e l e t t ro s p r a y illary having a 2-µm aperture, (b) microscopic view of the spray from a nanoESI capillary
glass nanoESI capllary having a 2-μm aperture, (b) microscopic
as provided by observations optics. By courtesy of New Objective, Woburn, MA.
(nanoESI) fornisce un'interfaccia ideale view of the spray from a nanoESI capillary as provided by
per accoppiare la separazione nano LC observations optics.
Note: Besides its low sample consumption, nanoESI is free of memory effects
alla rivelazione in MS.
because each sample is supplied in a fresh capillary by means of disposable
micropipettes. Furthermore, the narrow exits of nanoESI capillaries prevent air-
The nanoelectrospray
sensitive samples from rapidlyion source (nanoESI) is different from
decomposing.
Le dimensioni delle goccioline ottenute conventional electrospray sources and from other miniaturized
con la nanoESI è inferiore ai 200 nm. La electrospray sources by (i) its 1-2 μm spraying orifice achieved
nanoESI permette l’impiego di solventi ad by pulling the spraying capillary to a fine tip, (ii) its very low flow
12.3.2 Spray Modes of NanoESI
alta polarità, come l’acqua pura, sia in ioni rate of ∼20 nL/min and the small size of droplets it generates,
positivi che in ioni negativi, con poco Theand
onset(iii) the absence
of electrospray as wellofas solvent
the spatialpumps andcharacteristics
and temporal inlet valves.of the
Solutions
spray withdepend
plume largely up toon0.1 M salt contents
the experimental could
parameters. be effects
Strong sprayedare ex-
consumo di campione ed è in grado di erted by surface tension
without sheath flowand polarity of the
or pneumatic solvent, sample concentration, and
assist.
tollerare quantità più elevate di tamponi electric field strength at the tip of the spray capillary. The latter parameter can eas-
rispetto alla ESI convenzionale ily be adjusted, and as demonstrated
Anal. Chem. 68, 1 (1996) in Fig. 12.13, demands for careful control as
Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 136, 167 (1994
21
to avoid disadvantageous spray conditions. At low electric field strength some
spray will occur, but mostly by multiple discontinuous jets (dripping mode, D) not
accompanied by useful aerosol formation [87]. Increasing the spray voltage initi-
Introducing The ESI Chip and TriVersa nanoMate:
NanoLCArray
A off 400 iindependent
d d t nanoelectrospray
l t nozzles
l
nanoESI su chip
Una recente innovazione è la

possibilità di ottenere sistemi
di nanoESI su chip.
La produttività in analisi di
campioni della nanoESI è
l i m i t a t a a l l a p ro c e d u r a
dispendiosa in termini di
tempo del caricamento Sistema nanoESI Advion basato su chip. Le figure
rappresentano ingrandimenti successivi dall’unità di
manuale del capillare.
pipettamento al capillare di nebulizzazione sul chip di

The
silicio.
ESI Chip TM – A Stand Alone Source
In figura è riportata una
soluzione commerciale di In the ESI Chip, the electric 220 x 106 V/m
nanoESI su chip.
field around the nozzle tip is
formed from the potential
p
V
difference between the
microfabricated silicon
substrate as an integrated
counter electrode and the
voltage applied to the fluid
via
i the
th conductive
d ti pipette
i tt tip.
ti
• Incorporation of the ESI counter electrode into the spray nozzle.

nozzle
22
This is very different from conventional electrospray devices, which define the electric field by the potential difference between the
Metodi Strumentali in • Chimica

spray device (fluid potential) and the mass spectrometer inlet or atmospheric pressure ionization (API) interface.
Analitica,
As the distance between theAA 2020-2021
electrodes is only a few microns and
NanoLC
nanoESI e nanoESI su chip
NanoLC coupling
I sistemi nano ESI e nano ESI
su chip trovano varie altre
0.2 - 0.8 nanoLC or
applicazioni cromatografiche µL/min Nanoaquity butt
e non solo, però sono ideali connected via
teflon sheath
per l’accoppiamento con
NanoLC.
Move to next nozzle in 3 seconds s

sample loss if sprayer plugs mid
Use your own nanoLC column
23

NanoLC
RF Tag
nanoLC-Chip-MS
Attualmente esistono sistemi completi Electric

nanoLC-MS integrati su chip.
contact
Sui chip le connessioni, colonne e ago per

l’elettronspray sono integrati
Phosphochip in un 1200
for Agilent unico
Series HPLC-Chip/MS
dispositivo. In questo modo i volumi
One-step phosphopeptide analysis
extracolonna sono notevolmente ridotti.
Inert Integrated Integrated Integrated Built-in
polyimide Sprayer-tip Nano LC Enrichment Microfilter
Column Column
L'integrazione di tutti i componenti limiterà
Moving beyond protein identification, more and more 2
la flessibilità del setup, per
researchers are cuion ithechip
focusing sono
protein phosphorylation Reversed phase column 2
adatti per l'analisimechanism,di an routine, ma non
important post-translational modifications Reversed phase column 1
(PTMs) process, to understand signal transduction in the cell.
necessariamente Toper l'analisi
investigate dei campioni
the phosphoproteome in more detail, phospho-
di proteomica più ryprior
lated proteins and peptides of interest need to be enriched
complessi.
to LC/MS/MS analysis due to the low abundance of
phosphorylated proteins in complex mixtures.
Phosphochip – simplifies your workflow TiO2 column

Analytical column
• Multilayer microfluidic HPLC-Chip features a sandwiched
The HPLC-Chip seamlessly integrates the sample enrichment and analytical
RP-TiO2-RP trapping column (shown pink-black-pink in columns with the intricate connections and spray tip directly on the
the figure) for phosphopeptide enrichment polymer chip.
• Dual modes of analysis of both phosphorylated and non-
phosphorylated peptides from complex protein digest 24
(see workflow) Unique Phosphopeptides
Metodi Strumentali in Chimica Analitica,
Spectrum Mill Score > 9AA 2020-2021
NanoLC
HPLC-Chip-MS
MSD Ion Trap TOF QTOF QQQ
- Reusable LC-Chips seamlessly integrate the sample enrichment and separation nanocolumns,
tubing, connections, and spray needle of a traditional nanoelectrospray LC/MS system into a
biocompatible polymer chip
- Narrower, better-defined peaks due to elimination of post-column dead volumes
- Concentration-dependent technique: HPLC-Chip can dramatically improve sensitivity.
- Sealed, robotic interface for fully automated handling
25

NanoLC
Schematic overview of the HPLC phosphochip Q-

TOF configuration
Analytical Chemistry, Vol. 82, No. 3, February 1, 2010
In the phosphochip the two reversed-phase C18 trapping columns are indicated in
black, the TiO2 phosphopeptide trapping column is in red, and the analytical C18
column is in blue. The main components of the Q-TOF ion optics (octopoles, mirror,
pulser) as well as the quadrupole mass filter, the argon (Ar) collision cell, and the
detector are indicated.
26

iKey Separation Device (microflussi)
- Fittingless 150 µm I.D. separation device

- All liquid, gas, and electronic connections for LC-MS
separations are made with the turn of a key
- Integrated heater and emitter
27

NanoLC
Perche’ la miniaturizzazione in HPLC/MS?
•Riduzione quantita’ di campione necessaria

•Riduce l’utilizzo di reagenti e fasi mobili
•Aumento di sensibilita’
•Aumento efficienza e potere risolutivo
•Velocita’ di analisi
Ed anche: facilita’ d’uso ed automazione
28

http://www.agilent.com/en-us/video/hplc-chip-technology
L’elettrocromatografia è un ibrido tra

HPLC e Elettroforesi Capillare.
Analogamente alle due tecniche da cui

deriva, essa è applicabile alla
separazione di specie neutre o di specie
cariche.
L’elettrocromatografia su colonne
impaccate è meno sviluppata
dell’elettroforesi.
In questa tecnica, di solito un solvente

p o l a re v i e n e g u i d a t o d a l fl u s s o
elettroosmotico attraverso un capillare
impaccato con un impaccamento per
HPLC a fase inversa.
Schematic illustration of an instrumentation used

Le separazioni dipendono dalla for capillary electrochromatography.
distribuzione delle specie analitiche tra
la fase mobile e la fase stazionaria
liquida sostenuta dall’impaccamento.
Liquid Chromatography (Second Edition) Fundamentals and Instrumentation 2017, Pages 697-718
30

In particolare per la separazione in

eletrocromatografia di composti
neutri, il meccanismo di
separazione si basa
esclusivamente sulle interazioni con
la fase stazionaria e la parte
elettroforetica del meccanismo di
separazione è collegata solo alla
creazione del flusso elettrosmotico.
Per i composti carichi, invece, la
mobilità elettroforetica del
composto, il flusso elettrosmotico e
le interazioni cromatografiche con
la fase stazionaria influenzeranno la Talanta,122, 2014, 180-186
separazione.
Example of the separation of eleven PAHs by means of CEC approach. Mobile
phase: Hydroxylamine/acetic acid buffer (10 mM; pH 6.8)/MeCN=30/70 (v/v),
T=30 °C; injection: 1 s, 10 kV; individual conc=approx. 50 ppm. Separation was
conducted with the fixed voltage on the level of 30 kV. 1 – NAP, 2 – FLU, 3 –
ACA, 4 – PHE, 5 – ANT, 6 – FLA, 7 – PYR, 8 – HHP, 9 – BBF, 10 – BKF, 11 – BAP.
Detection at 220 nm.
31

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METODI STRUMENTALI IN

Metodi di Separazione: HPLC, UPLC, 2D-LC e nanoLC

HPLC/UPLC: colonne, supporti, strumentazione e

Schema a blocchi di una tipica

Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021

Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021

[mAU] First dimension

In figura, si può osservare l’aumento 1000

[mAU] Second dimension

pochi secondi. Si possono raccogliere 40

poco più di 30 minuti.

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1st peak from 2nd peak from 3rd peak from

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Rappresentazione dei dati: il picco 1D

Metodi Strumentali in Chimica Analitica,

In tabella sono riportate le combinazioni pù comuni First Dimension Second Dimension

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• In Nano LC very low sample volumes

• nLC-ESI-MS/MS is mostly used for the

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Journal of Chromatography A, 856 (1999) 117–143

J. Sep. Sci. 2002, 25, 557–568

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Description Diameter Typical flow rate UHPLC Capabilities

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Perche’ utilizzare separazioni LC-MS a nanoflussi in colonne dal

Flusso (µL/min) 0.1 1 10 100 1,000 10,000 100,000

Diam. colonna (mm) 0.05 0.2 1 2 4 50

Guadagno sensibilita’ 6400 400 16 4 1

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Le colonne capillari impaccate hanno

In generale, la maneggevolezza delle

Eﬀetti extracolonna e miniaturizzazione

debbano essere ridimensionati. Oltre

Journal of Chromatography A, 1421 (2015) 2–17

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Sviluppata come tecnica oﬀ-line da Wilm

Una recente innovazione è la

pipettamento al capillare di nebulizzazione sul chip di

• Incorporation of the ESI counter electrode into the spray nozzle.

Metodi Strumentali in • Chimica

nanoESI e nanoESI su chip

Move to next nozzle in 3 seconds s

Use your own nanoLC column

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Attualmente esistono sistemi completi Electric

Sui chip le connessioni, colonne e ago per

Phosphochip – simplifies your workflow TiO2 column

MSD Ion Trap TOF QTOF QQQ

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Schematic overview of the HPLC phosphochip Q-

Analytical Chemistry, Vol. 82, No. 3, February 1, 2010

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- Fittingless 150 µm I.D. separation device

Metodi Strumentali in Chimica Analitica, AA 2020-2021

Perche’ la miniaturizzazione in HPLC/MS?

•Riduzione quantita’ di campione necessaria

Ed anche: facilita’ d’uso ed automazione

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L’elettrocromatografia è un ibrido tra

Analogamente alle due tecniche da cui