METODI STRUMENTALI IN

CHIMICA ANALITICA

Metodi di separazione eterogenei: Elettroforesi Capillare, Frazionamento in

campo flusso, Estrazione e Cromatografia in fase supercritica
Prof. Ilaria Palchetti,
moodle ID: metodi2021 !1
 - Metodi di separazione
Frazionamento in flusso in
presenza di campo (FFF)

Introduzione
Principi teorici
Metodi di separazione in Frazionamento in Flusso in presenza di campo
(Field-flow fractionation)

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 Frazionamento in Flusso in presenza di campo (Field-flow fractionation)

Il principio fondamentale della separazione FFF è l’applicazione di una forza normale (campo) alla
direzione del flusso degli analiti che si intende separare, a sua volta confinato all’interno di un canale
capillare a sezione rettangolare, in cui non è presente una fase stazionaria

J. Calvin Giddings

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 FFF

La strumentazione FFF è simile a

quella HPLC.

Una tipica pompa cromatografica,

infatti, spinge la fase mobile
all’interno del canale FFF, all’uscita Alloggiamento
del quale è posto un rivelatore.
del canale

Il campione viene introdotto di

solito nel canale mediante un
iniettore posto fra la pompa e il
canale.
https://www.alfatest.it/keyportal/uploads/2017-postnova_af2000.pdf

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 Rr
FFF

Sign
R 6 coth 1 / 2 2 B A
I risultati della separazione sono evidenziati con un diagramma dellaA risposta del
R 6 B
rivelatore rispetto al tempo, cioè un frattogramma, simile al cromatogramma in
cromatografia o all’elettroferogramma in elettroforesi capillare.

Frattogramma
Frattogramma sperimentale trB trA Time (min)

900
u.a.
800

t0 t0 e tr sono determinati dal

700
baricentro del picco
600

500

tR
Da R s
par
400

300

200
– un parame
100

0
Time/ min
0 10 20 30 40 50 60 70

L’asse dei tempi può essere calibrato in termini di proprietà specifiche

reprinted from dr. C. Contado, Univ. Ferrara
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 FFF

La tecnica Field-Flow
Fractionation (FFF)-
Frazionamento in flusso in
presenza di campo è una
tecnica di separazione che
differisce dalla
cromatografia perché non
vi è una fase stazionaria.

Il frazionamento in campo-
flusso è, in linea di
principio, una tecnica a
calibrazione assoluta, in https://www.alfatest.it/keyportal/uploads/2017-postnova_af2000.pdf

quanto tale relazione è

esattamente prevedibile
dallo studio del
meccanismo di eluizione.

Si è in condizioni di analisi
quantitativa assoluta “The theory of separation in FFF is well defined and it is
quando tutte le grandezze
necessarie a ricavare il possible to predict the retention of a given compound.”
dato analitico sono
prevedibili a partire dalle
caratteristiche chimico-
fisiche dell’analita, senza
preventive calibrazioni.
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 FFF

Il canale FFF

Il canale FFF è lungo, generalmente, 30-100 cm, largo 1-3 cm e spesso 0.05-0.5 mm

Generalmente il canale è ritagliato in un sottile spaziatore e interposto tra due pareti.

Perpendicolarmente alla direzione del flusso si applica un campo elettrico, termico o centrifugo oppure
(caso più generale) si può usare un flusso trasversale perpendicolare alla direzione del flusso principale.
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 FFF

Il canale FFF

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 FFF

Il campo applicato
comprime i diversi analiti
in strati di diverso
spessore (λ). Questo
spessore dipende da
quanto fortemente essi
interagiscono con il
campo applicato. Più
sottile è lo strato, più
lento è il suo moto lungo
Parete di accumulo
il canale a causa delle
condizioni di “basso
flusso” vicino alla parete
del canale. La diversa All’interno del canale si instaura un flusso laminare (con un
velocità degli analiti caratteristico profilo parabolico) della fase mobile. Il flusso
produce il frazionamento. trasportatore principale ha la sua massima velocità al centro
del canale e la sua velocità minima vicino alle pareti. Ad esso
si sovrappone l’azione del campo esterno applicato in
direzione normale.
 FFF

Modo FFF normale

La quota o elevazione trasporto indotto

(l) è la distanza dal campo
percorsa da ciascun
trasporto indotto
analita ed è relativa
dalla diffusione
alla forza applicata su l
ciascun analita
parete di accumulazione
D = coefficiente di
diffusione;
F = fv
v= modulo della velocità
D kT
l= =
indotta dal campo applicato
dall’esterno kT
k = costante di Boltzmann, v F D=
F = modulo della forza 6πηr
esercitata dal campo
esterno.

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 FFF

Fasi di una separa

Un tipico esperimento FFF consiste in tre fasi.

Iniezione del campione: la miscela delle

particelle da separare viene introdotta
nel canale.

Rilassamento: viene applicato il campo

trasversale e si attende, in assenza di
flusso longitudinale, lo stabilirsi
dell’equilibrio fra la spinta verso il basso
e la diffusione.

Separazione: viene innescato il flusso

lungo il canale, quindi le particelle si
separano, in eluizione normale o inversa
a seconda delle dimensioni.

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Separazione:
Metodi Strumentali in Chimica Analitica,viene innescato il flusso lungo
AA 2020-2021
 FFF

La posizione di una popolazione

di particelle all’interno del canale
dipenderà dal bilanciamento fra la
spinta verso il basso dovuta al
campo esterno e la tendenza a
diffondere in tutte le direzioni
(quindi anche verso l’alto). Ne
deriva una distribuzione di
concentrazioni C(y) esponenziale,
con il massimo sulla parete di
accumulazione, ossia per y=0, e
un progressivo decremento
all’aumentare della distanza da
essa: C(y) = C0 e-y/l

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 FFF

L a d i s t a n z a d a l l a p a r e t e d i La distanza dalla parete di accumulazione alla quale la concentrazione

delle particelle tende a 0 è di solito dell’ordine di qualche m:
accumulazione alla quale la
concentrazione delle particelle tende a
0 è di solito dell’ordine di qualche μm.

Come mostrato in figura, le particelle

sono soggette anche alla diffusione
longitudinale, che determina il profilo di
concentrazione nella direzione del
flusso principale, ossia la formazione di
bande come in cromatografia. Come in
cromatografia, all’aumento del tempo di
residenza nel canale corrisponderà un
Come mostrato in figura, le particelle sono soggette anche alla diffusione
maggiore allargamento delle bande. longitudinale, che determina il profilo di concentrazione nella direzione
del flusso principale, ossia la formazione di bande come in cromatografia.
Come in cromatografia, all’aumento del tempo di residenza nel canale
corrisponderà un maggiore allargamento delle bande.

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 FFF

Detto w lo spessore del canale:

li kT La separazione è ottenuta quando i

λ= = parametri lambda sono diversi per i
w w Fi diversi analiti
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 FFF

Detto w lo spessore del canale e ipotizzando che l << w è possibile valutare il rapporto fra
il tempo di eluizione dal canale di una specie rallentata (tr) e quello di una specie non
rallentata affatto (t0):

tr w Fw In generale F (forza esercitata dal campo

= = esterno), e quindi tr, aumenta con le dimensioni
t0 6l 6kT delle particelle.
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 FFF

Analiti tipicamente separabili

in FFF
In generale gli analiti separabili Bioanalitica/ • Proteine, peptidi, cromosomi, DNA, particelle
subcellulari, lipoproteine, cellule, virus, lieviti,
in FFF devono avere dimensioni Biotecnologie batteri, pollini…
tali da risentire del campo
trasversale in modo
Farmaceutica • Liposomi, emulsioni farmaceutiche…
significativo, quantomeno in
entità paragonabile all’effetto
dei moti diffusivi, che • Nanomateriali, dispersioni colloidali, polimeri,
Materiali pigmenti….
tenderebbero a renderne la
concentrazione omogenea
lungo la sezione del canale. • Amido, emulsioni alimentari, lieviti proteine,
Alimenti studio fermentazioni..
Analiti tipici per separazioni FFF
sono quindi:

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 FFF

Modo normale:

macromolecole e particelle inferiori a Modo di Forza opposta al Distribuzione

1μm
operazione campo della banda
Modo sterico:

macromolecole e particelle superiori Normale Diffusione Esponenziale

a 1μm
Sterico Contatto con la Strato alla parete
Modo iperstrato:
parete
macromolecole e particelle superiori Sterico/ Forze di elevazione Strato a distanza
a 1μm quando la velocità media della Iperstrato idrodinamica dalla parete
fase mobile (carrier) viene aumentata.

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 FFF

Normal FFF

Poiché il canale è molto più largo che alto, applicando una pressione,
il flusso è laminare ed ha un profilo parabolico. Le particelle più
piccole arrivano al rivelatore prima di quelle più grandi, perché hanno l
più grandi. Questo fino ad un determinato limite dimensionale.

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 FFF

Steric FFF

When the particle size exceeds a certain limit, the

separation mode is the steric one. Large particles extend
closer to the center of the channel, and thus to the faster
flowing carrier path, and are transferred to the detection
first.
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 FFF

Tipi di campo e tecniche FFF

Tipo di campo Tipo di tecnica FFF

Flusso idrodinamico (Fl) Flow FFF (FlFFF)

Sedimentation (Centrifugal) FFF (SdFFF) or

Sedimentazione (Sd)
Gravitational (GrFFF)

Termico (Th) Thermal FFF (ThFFF)

Elettrico (El) Electrical FFF (ElFFF)

Magnetico (Mg Magnetic FFF (MgFFF)

Dielectrico (Dl) Dielectric FFF (DlFFF)

Acustico (Ac) Acoustic FFF (AcFFF)

 FFF di flusso

Flow-FFF simmetrico
E’ la variante più versatile delle tecniche FFF,
in virtù del grande intervallo di dimensioni
delle particelle che possono essere separate
con essa (da 1 nm a 100 µm).

In questa variante il campo esterno

(crossflow) è rappresentato da un altro flusso
di liquido, perpendicolare a quello principale
(channel flow):

Le pareti del canale FFF in questo caso sono

rappresentate da un setto poroso attraverso
il quale scorre il liquido spinto dal flusso
incrociato.

Una membrana semipermeabile è posta sulla

parete inferiore del canale e la sua porosità
(di solito maggiore di 1 nm) determina le
dimensioni minime degli analiti che possono
essere separati (gli analiti con dimensioni
inferiori vengono infatti trascinati fuori dal
crossflow).
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 FFF di flusso

Frazionamento di globuli rossi di specie diverse

Frazionamento di globuli rossi di
specie diverse in modalità inversa.

Un’idea approssimativa delle

Un’idea approssimativa
dimensioni delle cellule può esseredelle
dimensioni
otten uta delle
tar ancellule può essere
d o il sistema
ottenuta
mediante tarando
il frazionamento il sistema
di
mediante
sferette di ilpolistirene
frazionamento
(PS beads) di
di dimensioni
sferette note.
di polistirene (PS beads)
Time (min) di dimensioni note.
 FFF di flusso
Flow-FFF asimmetrico
Un apparato per Flow-FFF asimmetrico si differenzia dal corrispondente simmetrico
per il fatto che soltanto la parete inferiore è caratterizzata dalla presenza di un setto
poroso, posto sotto la membrana destinata a trattenere il campione:

In questo caso il flusso esterno

viene generato soltanto sulla
parete inferiore del canale, di
solito creando un’aspirazione dal
basso del solvente.
Il campione viene introdotto
attraverso un ulteriore tubicino,
posto perpendicolarmente al
canale.
Il principio della separazione è
simile a quello visto per il Flow-
FFF simmetrico.
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 FFF per sedimentazione
FFF per sedimentazione

La tecnica di Sedimentation-FFF
(Sd- FFF) è un’evoluzione della
tecnica basata sul campo
gravitazionale, nella quale il campo
esterno applicato è rappresentato
da una forza centrifuga. Il canale, è
avvolto a spirale ed è fatto per
essere inserito all’interno di un
cesto di centrifuga

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 FFF di flusso

Metodi di rivelazione in FFF


I metodi di rivelazione tipicamente riportati per la FFF sono:

üassorbimento UV-VIS o fluorescenza, con rivelazione a singola

lunghezza d’onda o mediante Diode Array Detector (DAD), in celle
analoghe a quelle tipicamente impiegate in HPLC
ürifrattometria, che sfrutta la considerevole variazione di indice di
rifrazione indotta nella fase mobile FFF dalla presenza di analiti di
grandi dimensioni
üdiffusione (scattering) della radiazione UV-VIS, che può essere
opportunamente sfruttata per la rivelazione di analiti di grande peso
molecolare/dimensioni
üspettrometria di massa e ICP-MS, accoppiata alla separazione FFF
mediante interfaccia ICP, o molecolare, basata su ionizzazione MALDI
(accoppiamento off-line) o ESI (accoppiamento on-line).
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Cromatografia in fase
supercritica
Principi e metodi

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 SFC
Fundamentals
La cromatografia su fluido
supercritico (SFC) è una forma P
d i c r o m a t o g r a fi a i n f a s e NO phase transition
normale utilizzata per l'analisi
di molecole di peso molecolare SUPER-
da basso a moderato. I principi
CRITICAL
SOLID LIQUID FLUID
sono simili a quelli dell’HPLC.

73.8 bar

SFC utilizza in genere CO2

supercritica come fase mobile.
GAS

31.1°C
Richiede la pressurizzazione T
Courtesy of Dr. Christopher Rayner, University of Leeds
dell'intero percorso del flusso Agilent presentation: The SFC system as


cromatografico.

a routine instrument, October 12, 2015

L'SFC può essere eseguito a

una velocità 3 volte superiore
rispetto a LC senza perdere
l'efficienza di separazione. La
viscosità del solvente è
inferiore e la diffusività
maggiore rispetto a LC
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 SFC

•  Sostituisce la cromatografia a fase normale

Selettività •  Complementare alla RP-LC o HILIC

Perchè la cromatografia in
fase super critica Fase mobile CO2, solventi •  Analisi molto veloci
organici impiegati in •  Costi operativi più bassi rispetto a LC e green
basse quantità technology

Ampia compatibilità con •  UV, MS, ….

vari detector

•  Tecnica interessante per analisi di composti chirali

•  Molte applicazioni per composti achirali
Composti chirali e non •  Composti polari e non-polari separati in una singola
solo corsa

Molteplici applicazioni

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 SFC
La strumentazione è simile a quella per
HPLC con due importanti differenze;
primo, per garantire un esatto controllo
della temperatura è necessario un forno
per termostatare la colonna, simile a
quello usato in GC.

Secondo, per mantenere la pressione

desiderata nella colonna e convertire
l’eluente da un fluido supercritico in un
gas per il trasferimento al rivelatore, si
usa un restrittore o un dispositivo a
contropressione.

Si utilizzano sia le colonne impaccate

che le colonne tubolari aperte.
Le colonne impaccate possono
garantire più piatti teorici e trattare
volumi di campione maggiori rispetto
alle colonne tubolari aperte. A causa
della bassa viscosità dei fluidi super
critici, le colonne sono più lunghe di
quelle usate in LC e nelle tubolari aperte
sono comuni lunghezze di 10-20 m e
diametri interni di 50-100 µm. Molte
della fasi stazionarie usate in LC sono
usate in SFC.
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 SFC

Perché usare CO2?

Oggi, quasi tutte le applicazioni in SFC
utilizzano CO2, modificata con un solvente
organico, e talvolta un additivo altamente
polare. La CO2 è il fluido preferito perché è:
• Già disponibile
• Economico
• Ha un punto critico accessibile
• Relativamente sicuro
• Considerato verde perchè riciclabile, e
• Miscibile con una vasta gamma di
modificatori altamente polari

Il metanolo è di gran lunga il modificatore più

utilizzato e tra i modificatori più polari
completamente miscibile con CO2.
I vantaggi del metanolo includono:
• Disponibilità
• Economico
• Completa miscibilità con CO2
•Tossicità relativamente bassa

2019 DE.3031944444 Agilent Restricted

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 SFC

Effetto della pressione

La variazione di pressione in SFC

ha un notevole effetto sul fattore di
ritenzione k e, quindi, sul tempo di
ritenzione tR. La densità di un
fluido super critico aumenta
rapidamente e in modo non lineare
all’aumentare della pressione. Tale
aumento di densità provoca un
miglioramento nella forza solvente
della fase mobile che, a sua volta,
abbrevia il tempo di eluizione.

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 SFC

La tecnica SFC è stata applicata all analisi di molteplici

composti. Una delle più importanti applicazioni è quella delle
separazioni chirali, specie nell’industria farmaceutica. In figura
è mostrata la separazione degli enantiomeri di un farmaco con
SFC e HPLC. Con entrambi i metodi si ottiene la completa
risoluzione degli nantiomeri, la separazione è più rapida in
SFC.

La SFC è anche molto utile per separazioni achirali.

Chiral Analysis



Agilent
AchiralSFC –
 Wide Application Range in Many Industries
Analysis
Demand by Industry

Chiral Analysis
• Chiral purity analysis (qualitative) of API !33
Analyte Type Distribution
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• Chiral method development for Prep SFC
• Quantitation of enantiomeric purity of starting