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Principali tecniche di
cromatografia per la separazione
delle proteine
Gel filtrazione
Interazioni idrofobiche
Scambio ionico
Affinit
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Biochimica e biochimica applicata Biochimica applicata 1 Farmacia
Iniettore
Fase Stazionaria
Pompa
RIVELATORE
Scarico
Fase mobile
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adsorbimento
Esclusione molecolare
o Gel filtrazione
Linterazione avviene tra la
proteina e la matrice polimerica.
La matrice polimerica fatta di
microsfere con porosit
controllata.
Le proteine interagiscono con i
pori delle microsfere e vengono
trattenute in base alla loro
dimensione.
Se una proteina, molto grande,
non interagisce con la matrice
esce con un volume di eluente
pari al Void Volume (volume
vuoto).
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Una
proteina
sconosciuta
eluisce a
170 mL:
40,000 Da (40KDa)
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Biochimica e biochimica applicata Biochimica applicata 1 Farmacia
Molecole d'acqua
Molecole d'acqua liberate in seguito alla
legate in modo ordinato interazione idrofobica
alla superficie idrofobica alla superficie idrofobica
LIGANDO
Porzione Proteina
idrofobica O
O CH3
OH Butil Sefaroso
O CH3
O
OH Octil Sefaroso
Fenil Sefaroso
O
O
OH
Alchil Sefaroso
O CH3
O
CH3
OH CH3
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-
+
-
+
- -
Controioni
-+ -
Particella -
funzionalizzata con - +
gruppi ionizzabili
(FASE STAZIONARIA) +
-
- Proteina
SCAMBIATORE -+
anionico
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-
-
+
+ -
+ -
FS - FS -
+
+ - +
+
-
ESEMPIO
Cromatografia a scambio anionico SAX
Tre proteine: A: pI = 5, B: pI = 6, C: pI = 7
Punto isolelettrico di una proteina: pH al quale la carica netta di una proteina uguale a 0
Pi bassoTre proteine:
il punto isoelettrico di una proteina maggiore la proporzione tra i suoi gruppi acidici
e quelli basici e viceversa.
pH = 8 pH = 6,5
+ +
+ + A
+ Interazione +
A
+ forte +
+ 3 ad eluire
+
+ 3 ad eluire +
+ + B
+ Interazione +
SAX + B SAX + 2 ad eluire
media +
+
+ +
2 ad eluire + C
+
+ +
+ Interazione + 1 ad eluire
C + ma non si lega alla FS poich al di
+ debole sotto del pI presenta carica netta
+ + positiva! Eluita con il volume morto,
+ 1 ad eluire + non sottoposta al processo
cromatografico - ESCLUSA
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CROMATOGRAFIA di AFFINITA
Principio:
Separa le biomolecole sfruttando interazioni
biospecifiche tra un ligando immobilizzato
(fase stazionaria) e le biomolecole stesse
Cromatografia di affinit
affinit
M + L ML
macromolecola ligando complesso
attaccato alla matrice
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Cromatografia
di affinit
Un ligando ad alta affinit
per la proteina legato alla
matrice
La proteina di interesse si
lega al ligando e viene
immobilizzata sulla colonna
Le altre proteine vengono
lavate via.
La proteina di interesse
viene eluita mediante diversi
metodi. Spesso si utilizza
una soluzione di ligando.
Cromatografia di affinit
Resina
O OH
HO
O O
HO OH
OH
OH
OH
Braccio spaziatore
Ligando
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COSE LA PROTEOMICA?
Proteoma
Linsieme completo di proteine codificate dal genoma ed espresse in
una cellula
Mentre il genoma costante per una data cellula ed identico per tutte le
cellule di un organismo, e non cambia molto allinterno della specie, il
proteoma molto dinamico nel tempo, risponde a fattori esterni, e
differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari.
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PUPA
FARFALLA
Stesso GENOMA
diverso PROTEOMA
Invecchiamento
Perch la Proteomica?
La Proteomica ha come obiettivo lo studio dell'espressione delle proteine in
diversi tessuti, liquidi biologici ed anche organi vitali
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Modificazioni post-traduzionali
Acetilazione, metilazione
Fosforilazione
Glicosilazione (enzimatica)
Nitrazione/denitrazione
Cleavage
Protein splicing
Tagging
Frazionamento
APPROCCIO CLASSICO
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE E
BIDIMENSIONALE
VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI
SPETTROMETRIA DI MASSA
BIOINFORMATICA
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PREPARAZIONE DEL
CAMPIONE
Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle
idrofobiche
Prevenzione dellaggregazione proteica e mantenimento della solubilit
Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di
estrazione
Rimozione di macromolecole che possono dare interferenze
Resa proteica adeguata per lanalisi, che potrebbe implicare la rimozione di
specie proteiche molto abbondanti
ELETTROFORESI
Il termine elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche sotto
linfluenza di un campo elettrico.
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PAGE
(polyacrylamide gel electrophoresis)
La matrice di supporto della migrazione costituita, nella maggior parte dei casi da
un gel che pu essere di poliacrilammide o in altri casi di agarosio.
Per quanto riguarda lanalisi di proteine, il supporto pi diffuso il gel di
poliacrilammide che chimicamente inerte e viene preparato facendo
copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantit di N,N-
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14%
V Z
= =
E f
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ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE
VISUALIZZAZIONE DEI
RISULTATI
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WESTERN BLOTTING
(PROTEIN BLOTTING)
Una volta avvenuto il trasferimento si procede alla rivelazione del blot; spesso
si utilizzano anticorpi specifici in grado di riconoscere una particolare proteina
(anticorpi monoclonali).
Il blot viene preventivamente incubato in una soluzione proteica, ad esempio
albumina di siero bovina o latte in polvere, in modo da saturare tutti i siti
idrofobici rimasti liberi sulla membrana; in questo modo si riducono
notevolmente le interazioni aspecifiche con gli anticorpi. Il blot viene quindi
incubato con una soluzione diluita di antisiero, chiamato anticorpo primario,
diretta contro la proteina di interesse. Le IgG contenute nellantisiero si legano
al proprio antigene, rimanendo legate al blot. Per poter visualizzare questa
interazione la membrana viene incubata ulteriormente con una soluzione
contenente anticorpi secondari, in grado di riconoscere la porzione costante
della molecola di IgG usata come anticorpo primario.
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Gli anticorpi secondari sono marcati in modo da poter essere individuati una
volta legati allanticorpo primario. Uno dei metodi pi comuni di rivelazione
utilizza anticorpi secondari coniugati ad un enzima. In questo caso, dopo essere
stato trattato con anticorpo secondario, il blot viene incubato in una soluzione
contenente il substrato dellenzima, che viene convertito in un prodotto colorato
insolubile che precipita sulla nitrocellulosa.
Come enzima coniugato agli anticorpi secondari viene spesso usata la perossidasi
di rafano, che viene rilevata con il metodo della chemiluminescenza
intensificata.
In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi ossida il luminolo, un substrato
chemiluminescente, con la concomitante produzione di luce, la cui intensit
aumenta fino a mille volte in presenza di un intensificatore chimico. La luce
emessa pu essere rilevata esponendo il blot ad una lastra fotografica.
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La presenza di bande colorate indica, quindi, la posizione della proteina o delle proteine
di interesse.
Std
204 KDa
131 KDa
89 KDa
Serum Albumin
42 KDa
31 KDa
17 KDa
7 KDa
Isoelettrofocalizzazione (IEF)
Questa tecnica permette di separare molecole in funzione del loro
diverso punto isoelettrico.
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Biochimica e biochimica applicata Biochimica applicata 1 Farmacia
pI = 7.4 0
pI = 8.4 0
- -
+ +
0 0 -
+
pH3 pH10
pH = 7.4
pH = 8.4
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
(2D-PAGE)
Questa tecnica combina le caratteristiche della IEF, nella quale le proteine sono
separate in base alla loro carica (pI), con le caratteristiche della SDS-PAGE, nella
quale la separazione avviene in base al loro peso molecolare.
E uno dei metodi analitici pi sofisticati per la separazione di una miscela
complessa di proteine, con alto grado di risoluzione
PM
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Esempio di 2D-PAGE
NL 3 pI 10 Std KDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
pH 3-11
pH 7-11
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