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Biochimica e biochimica applicata Biochimica applicata 1 Farmacia

Principali tecniche di
cromatografia per la separazione
delle proteine

Gel filtrazione
Interazioni idrofobiche
Scambio ionico
Affinit

La cromatografia un metodo di separazione che si basa sulla differente


ripartizione dei composti di una miscela tra una fase mobile ed una fase
stazionaria fissa.
I composti da separare sono introdotti nella fase mobile e si ripartiscono lungo la
colonna cromatografica in funzione della loro affinit relativa per la fase mobile e
per la fase stazionaria.

La separazione dei componenti di una miscela si ottiene in seguito alle interazioni


chimiche che avvengono tra le molecole disciolte nella fase mobile e la superficie
della fase stazionaria: queste interazioni possono avvenire con la superficie stessa
del supporto solido, con un liquido che ricopre il supporto in modo omogeneo o
ancora con molecole ad esso legate in maniera covalente.

Dal momento che i diversi componenti della miscela da separare interagiscono in


maniera differente con la fase stazionaria, si muovono lungo la colonna
cromatografica con velocit diverse: i composti che sono pi affini alla fase
stazionaria si muovono in media pi lentamente di quelli che sono pi affini alla
fase mobile.

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Schema a Blocchi di un Sistema


Cromatografico

Iniettore
Fase Stazionaria

Pompa
RIVELATORE

Scarico
Fase mobile

Colonne per HPLC

Rivelatori per HPLC

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adsorbimento

Esclusione molecolare
o Gel filtrazione
Linterazione avviene tra la
proteina e la matrice polimerica.
La matrice polimerica fatta di
microsfere con porosit
controllata.
Le proteine interagiscono con i
pori delle microsfere e vengono
trattenute in base alla loro
dimensione.
Se una proteina, molto grande,
non interagisce con la matrice
esce con un volume di eluente
pari al Void Volume (volume
vuoto).

Le molecole piu grandi si distribuiscono solo nel volume


Vo (volume escluso), quelle piu piccole nel volume totale
Vt
quelle intermedie nel volume Ve.
Il coefficiente di partizione Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
Kav puo andare tra 1 (Ve=Vt: mol. piccole) e 0 (Ve=Vo:
mol grandi)
Per molecole di forma simile, ceproporzionalita tra il
coefficiente di partizione (Kav) e il logaritmo del Peso
Molecolare. La cromatografia per gelfiltrazione e usata
anche analiticamente.

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Esclusione molecolare o Gel


filtrazione

Applicazioni della cromatografia ad esclusione molecolare

Purificazioni Determinazione Mr Dissalazione Concentrazione Analisi proteina-ligando

Dal momento che


le proteine e altre Questa tecnica e
Esempi di Soluzioni di comune mente usata
macromolecole
sostanze A differenza sostanze ad per studiare il legame
biologiche hanno
purificate con dell alto peso reversibile tra
dimensioni molto
questa tecnica: elettroforesi, molecolare macromolecole e loro
piu grandi rispetto
virus, proteine, con questa ai sali e ad altre possono essere ligandi a basso peso
enzimi, ormoni, tecnica e piccole molecole, concentrate molecolare.
anticorpi, acidi possibile la questa tecnica e Puo essere anche
nucleici, stima della particolarmente usata per la
polisaccaridi. massa efficiente per determinazione di
molecolare costanti di equilibrio.
Molto usata anche in rimozione di sali
anche per condizioni cambio di buffer
separare le native, se si
forme confrontano
monomeriche proteine di
da quelle forma simile.
polimeriche.

Determinazione peso molecolare

Una
proteina
sconosciuta
eluisce a
170 mL:

40,000 Da (40KDa)

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Cromatografia per interazione


idrofobica
PRINCIPIO: sfrutta lidrofobicit superficiale delle
proteine (residui Amminoacidici non polari)
FASE STAZIONARIA: matrice inerte a cui sono
legati gruppi idrofobici (gruppi ottilici, fenilici,
butilici ecc)
FASE MOBILE tampone polare
A concentrazione salina decrescente (riduzione degli
effetti idrofobici)
A concentrazione di detergente crescente
Con variazione di pH

Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)


un tipo di cromatografia sviluppato per la
purificazione di proteine, le separa sulla base della
loro idrofobicit di superficie.
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le
regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d acqua
ordinate
le proteine tendono cos ad interagire fra loro (salting
out). Nella HIC queste regioni cos esposte tendono
ad interagire con una fase stazionaria costituita da
gruppi idrofobici.
una cromatografia che vantaggioso applicare ad
esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato.
Leluizione pu essere fatta con forza ionica
decrescente oppure per spiazzamento con
detergenti non ionici (Tween 20, Triton X-100).

LIGANDO Porzione Proteina


idrofobica

Molecole d'acqua
Molecole d'acqua liberate in seguito alla
legate in modo ordinato interazione idrofobica
alla superficie idrofobica alla superficie idrofobica

LIGANDO

Porzione Proteina
idrofobica O
O CH3
OH Butil Sefaroso

O CH3
O
OH Octil Sefaroso

Fenil Sefaroso
O
O
OH

Alchil Sefaroso
O CH3
O
CH3
OH CH3

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Le fasi stazionarie idrofobiche sono: Octyl-agarose, Phenyl-


agarose che contengono gruppi funzionali non-polari come alcani
o gruppi aromatici.
La miscela proteica viene disciolta in un tampone di alta forza
ionica [1M(NH4)2SO4]
Si user
o un gradiente di forza ionica che deve essere discendente
oppure si usa un gradiente di pH crescente per aumentare
l'idrofilicit della proteina
oppure lo spiazzamento selettivo mediante molecole che
hanno una affinit per la fase stazionaria maggiore di quella
della proteina.
Grazie alla natura delle interazioni idrofobiche e alla forza ionica,
la cromatografia idrofobica e la cromatografia di scambio ionico
possono convenientemente essere usate sequenzialmente. Ad
esempio, dopo uno scambio ionico la proteina si trova in
condizioni di alta concentrazione salina, in questo modo pu
essere caricata direttamente su una colonna idrofobica. Al
contrario, una colonna idrofobica viene eluita in condizioni di
bassa concentrazione salina che un requisito per far legare le
proteine su una resina a scambio ionico.
l'HIC viene svolta con un solvente acquoso e con variazioni di
forza ionica per eluire la colonna. Le proteine tipicamente si
legano nella forma nativa attraverso gruppi idrofobici presenti
sulla loro superficie. Lo stato nativo viene mantenuto durante le
condizioni di eluizione.

Cromatografia a scambio ionico

PRINCIPIO: attrazione fra particelle cariche di segno


opposto.
Proteine - - > carica dipende dal loro pI e dal pH soluzione

Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne


impaccate con una resina scambiatrice di ioni. Esistono due tipi
di resine: gli scambiatori anionici e gli scambiatori cationici.

A seconda del pH di ionizzazione della proteina si possono


usare scambiatori forti o deboli; scambiatore forte quella
resina che ionizzata a pH elevato, al contrario quella debole.
Un proteina ionizzata a pH 10 richiede l'uso di uno scambiatore
forte, mentre se una proteina ionizzata a pH 6 basta uno
scambiatore debole.

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Cromatografia a Scambio Ionico


La cromatografia a scambio ionico si basa su interazioni di tipo elettrostatico.
Il pH del sistema gioca un ruolo fondamentale in questo tipo di cromatografia
dato che tramite sue variazioni si pu far variare le cariche sia della fase
stazionaria che delle molecole analizzate.

-
+
-
+
- -
Controioni
-+ -
Particella -
funzionalizzata con - +
gruppi ionizzabili
(FASE STAZIONARIA) +
-
- Proteina
SCAMBIATORE -+

anionico

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CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO


Metodi di eluizione

Gradiente di forza ionica Gradiente di pH

Variazione della carica delle


Competizione per lo scambiatore
molecole comporta il distacco dallo
tra ioni e molecole analizzate
scambiatore

-
-
+
+ -
+ -
FS - FS -
+
+ - +
+
-

ESEMPIO
Cromatografia a scambio anionico SAX

Tre proteine: A: pI = 5, B: pI = 6, C: pI = 7
Punto isolelettrico di una proteina: pH al quale la carica netta di una proteina uguale a 0
Pi bassoTre proteine:
il punto isoelettrico di una proteina maggiore la proporzione tra i suoi gruppi acidici
e quelli basici e viceversa.

pH = 8 pH = 6,5
+ +
+ + A
+ Interazione +
A
+ forte +
+ 3 ad eluire
+
+ 3 ad eluire +
+ + B
+ Interazione +
SAX + B SAX + 2 ad eluire
media +
+
+ +
2 ad eluire + C
+
+ +
+ Interazione + 1 ad eluire
C + ma non si lega alla FS poich al di
+ debole sotto del pI presenta carica netta
+ + positiva! Eluita con il volume morto,
+ 1 ad eluire + non sottoposta al processo
cromatografico - ESCLUSA

Nella cromatografia a scambio ionico si possono distinguere cinque fasi:

1) Diffusione della molecola alla superficie dello scambiatore.

2) Diffusione della molecola attraverso la struttura della matrice sino al


sito di scambio. Questa fase dipende dal numero di legami crociati
presenti e dalla concentrazione della soluzione.

3) Scambio di ioni al sito di scambio. Questo passaggio si realizza


instantaneamente ed un processo che va all'equilibrio. Quanto
maggiore la carica della molecola da scambiare, tanto pi forte il
legame, e meno facilmente pu essere sostituita da altri ioni.

4) Diffusione dello ione scambiato attraverso lo scambiatore fino alla


superficie.

5) Distacco selettivo dello ione attraverso lo scambiatore grazie


all'eluente e diffusione della molecola nel volume esterno. Il distacco
selettivo si ottiene modificando pH o forza ionica.

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- in genere i campioni vengono caricati in condizioni di bassa forza


ionica e le sostanze che si legano alla colonna vengono
eluite usando o un eluizione a gradiente o a step di un tampone che
ha una forza ionica pi alta.
- una proteina si legher a una resina a scambio cationico se il pH
del tampone pi basso del suo punto isoelettrico (pI) e si legher
ad una resina a scambio anionico se il pH del tampone pi alto del
suo pI.

Separazione di tre Proteine

CROMATOGRAFIA di AFFINITA

Principio:
Separa le biomolecole sfruttando interazioni
biospecifiche tra un ligando immobilizzato
(fase stazionaria) e le biomolecole stesse

Cromatografia di affinit
affinit

Sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche.

M + L ML
macromolecola ligando complesso
attaccato alla matrice

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Cromatografia
di affinit
Un ligando ad alta affinit
per la proteina legato alla
matrice
La proteina di interesse si
lega al ligando e viene
immobilizzata sulla colonna
Le altre proteine vengono
lavate via.
La proteina di interesse
viene eluita mediante diversi
metodi. Spesso si utilizza
una soluzione di ligando.

Questo metodo necessita di accurate conoscenze sulla struttura e


sulla reattivit della molecola da separare.
Il ligando utilizzato, che di solito legato ad un braccio spaziatore per
rendere pi accessibile il legame con la proteina, deve avere le
seguenti caratteristiche:

il gruppo chimico da legare alla matrice o al braccio spaziatore non


deve essere coinvolto nel legame con la macromolecola da purificare.
Questi gruppi sono generalmente amminici, carbossilici, tiolici, alcolici
o fenolici;

deve essere attaccato alla matrice in modo da non interferire con la


capacit di legare la macromolecola;

il braccio spaziatore tra ligando e matrice deve avere una lunghezza di


6-10 atomi di C. Alcuni bracci sono di natura idrofobica e altri di natura
idrofila.

Cromatografia di affinit

Resina
O OH
HO
O O
HO OH
OH
OH
OH
Braccio spaziatore
Ligando

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La matrice ideale da utilizzare nella cromatografia di affinit deve


possedere le seguenti caratteristiche:

deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare


covalentemente il ligando e deve risultare stabile nelle condizioni in cui
avviene tale attacco;

deve essere stabile nelle condizioni di interazione della


macromolecola e nella successiva eluizione;

non deve interagire, se non debolmente, con altre macromolecole, per


evitare un adsorbimento aspecifico;

In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente


costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio
(Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e
cellulosa.

Metodi di eluizione nella cromatografia di


affinit

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Cromatografia di affinit con anticorpi

COSE LA PROTEOMICA?

The total PROTEIN complement of a GENOME


(M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995,16 1090-95)

La Proteomica lo studio del PROTEOMA

Proteoma
Linsieme completo di proteine codificate dal genoma ed espresse in
una cellula

Linsieme di tutte le isoforme, delle modificazioni post-traduzionali e


delle interazioni delle proteine

Studio delle alterazioni delle proteine in particolari condizioni: malattia,


trattamento, tempo, ecc.

Mentre il genoma costante per una data cellula ed identico per tutte le
cellule di un organismo, e non cambia molto allinterno della specie, il
proteoma molto dinamico nel tempo, risponde a fattori esterni, e
differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari.

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PUPA
FARFALLA
Stesso GENOMA

diverso PROTEOMA

Invecchiamento

Perch la Proteomica?
La Proteomica ha come obiettivo lo studio dell'espressione delle proteine in
diversi tessuti, liquidi biologici ed anche organi vitali

Fegato, reni, Plasma, Latte,


cuore, ecc. liquor, ecc. carne, ecc.

Lo studio dellespressione e funzione delle Proteine e dei


meccanismi fisio-patologici in cui sono coinvolte aiuta a:
Comprendere quali sono i meccanismi alla base
dellinsorgenza di malattie
Identificare le alterazioni proteiche

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Modificazioni post-traduzionali
Acetilazione, metilazione

Fosforilazione

Glicosilazione (enzimatica)

Glicazione (non enzimatica)

Nitrazione/denitrazione

Cleavage

Protein splicing

Tagging

Purificazione delle proteine


Estrazione delle proteine

Determinazione delle proteine totali

Frazionamento

Tecniche di separazione cromatografica ed elettroforetica

Monitoraggio del processo di purificazione

APPROCCIO CLASSICO
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE E
BIDIMENSIONALE
VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI
SPETTROMETRIA DI MASSA
BIOINFORMATICA

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PREPARAZIONE DEL
CAMPIONE
Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle
idrofobiche
Prevenzione dellaggregazione proteica e mantenimento della solubilit
Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di
estrazione
Rimozione di macromolecole che possono dare interferenze
Resa proteica adeguata per lanalisi, che potrebbe implicare la rimozione di
specie proteiche molto abbondanti

Le proteine devono essere denaturate e solubili

Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con:

Urea (il pi utilizzato agente denaturante,caotropico, capace di


rompere i ponti idrogeno intra e inter molecolari)

Tiourea ( denaturante usato in associazione con urea per


aumentare la solubilit del campione)

Agenti riducenti (capaci di rompere i ponti disolfuro)

Detergenti (non ionici, utilizzati perch capaci di rompere legami


idrofobici ed aumentare la solubilit proteica al relativo punto
isoelettrico)

Inibitori di proteasi (per quegli enzimi che riescono a rimanere


attivi)

ELETTROFORESI
Il termine elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche sotto
linfluenza di un campo elettrico.

Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le


proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionozzabili e,
quindi, ad ogni valore di pH sono presenti in soluzione come specie
elettricamente cariche, sia come cationi (+) che come anioni (-).

Sotto linfluenza di un campo elettrico, queste molecole cariche migrano verso


il catodo o lanodo, a seconda che possiedano una carica negativa o positiva.

Lelettroforesi permette di valutare alcune propriet delle proteine come il punto


isoelettrico (pI) e la massa molecolare relativa (Mr).

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PAGE
(polyacrylamide gel electrophoresis)

La matrice di supporto della migrazione costituita, nella maggior parte dei casi da
un gel che pu essere di poliacrilammide o in altri casi di agarosio.
Per quanto riguarda lanalisi di proteine, il supporto pi diffuso il gel di
poliacrilammide che chimicamente inerte e viene preparato facendo
copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantit di N,N-

metilenbisacrilammide (o bis-acrilammide) che viene utilizzata come agente in


grado di formare legami trasversali.

Il processo di polimerizzazione dei monomeri di acrilammide e bis-acrilammide


un tipico esempio di catalisi radicalica e inizia con laggiunta di un catalizzatore
come il persolfato di ammonio e un iniziatore come la N,N,N,N-
tetrametilendiammina (TEMED).
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del
corrispondente radicale libero (R):

S2O8 2 - + 1e- SO42 - + SO4 -

Possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente:


R + M RM
RM + M RMM
RMM + M RMMM ...
dove M il monomero di acrilammide.

Formazione di un gel di poliacrilammide a partire da acrilammide e bis-acrilammide

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I gel di acrilammide vengono definiti in base alla percentuale totale di


acrilammide presente e le dimensioni dei pori del gel sono determinati dalle
concentrazioni di acrilammide e bisacrilammide impiegate, agendo, quindi, da
setacci molecolari rallentando la migrazione delle proteine proporzionalmente
alla loro massa molecolare:

- Gel al 10% di acrilammide ha setacci pi ampi, quindi adatto alla separazione di


molecole pi grandi, rispetto ad un gel al 12%, a sua volta con setacci pi ampi di
un gel al 14% di acrilammide, e cos via.

- Gel a gradiente es. 9-14% di acrilammide 9%

14%

Nellelettroforesi la forza che muove le macromolecole il potenziale elettrico E.


La mobilit elettroforetica della molecola (), che il rapporto tra la velocit V
della particella ed il potenziale elettrico E, anche uguale al rapporto tra la carica
netta della molecola Z ed il coefficiente frizionale f

V Z
= =
E f

Elettroforesi su gel di poliacrilammide


con Sodio Dodecilsolfato (SDS-PAGE)

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ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE

VISUALIZZAZIONE DEI
RISULTATI

Dopo la corsa elettroforetica, le proteine


possono essere evidenziate mediante impiego di
particolari coloranti come il Blue di Coomassie,
il Nitrato dArgento o coloranti fluorescenti,
capaci di legarsi alle proteine, ma non al gel,
con una differente sensibilit.

Ogni banda sul gel rappresenta una o pi


proteine con un determinato peso moledolare.

La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina pu essere determinata


confrontando la sua mobilit con quella di una serie di proteine standard, delle
quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel.

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WESTERN BLOTTING
(PROTEIN BLOTTING)

Consiste nel trasferire inizialmente le proteine separate nel gel di


poliacrilammide su una membrana di nitrocellulosa. I metodi per trasferire le
proteine dal gel alla nitrocellulosa sono diversi: per capillarit (capillary
blotting), per diffusione, blotting sotto vuoto ed elettroblotting. Tra questi il
metodo pi utilizzato per la sua velocit ed efficienza lelettroblotting, in cui il
processo di trasferimento delle proteine avviene per elettroforesi.

Schema di allestimento del Sandwich per il trasferimento delle proteine.

Una volta avvenuto il trasferimento si procede alla rivelazione del blot; spesso
si utilizzano anticorpi specifici in grado di riconoscere una particolare proteina
(anticorpi monoclonali).
Il blot viene preventivamente incubato in una soluzione proteica, ad esempio
albumina di siero bovina o latte in polvere, in modo da saturare tutti i siti
idrofobici rimasti liberi sulla membrana; in questo modo si riducono
notevolmente le interazioni aspecifiche con gli anticorpi. Il blot viene quindi
incubato con una soluzione diluita di antisiero, chiamato anticorpo primario,
diretta contro la proteina di interesse. Le IgG contenute nellantisiero si legano
al proprio antigene, rimanendo legate al blot. Per poter visualizzare questa
interazione la membrana viene incubata ulteriormente con una soluzione
contenente anticorpi secondari, in grado di riconoscere la porzione costante
della molecola di IgG usata come anticorpo primario.

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Gli anticorpi secondari sono marcati in modo da poter essere individuati una
volta legati allanticorpo primario. Uno dei metodi pi comuni di rivelazione
utilizza anticorpi secondari coniugati ad un enzima. In questo caso, dopo essere
stato trattato con anticorpo secondario, il blot viene incubato in una soluzione
contenente il substrato dellenzima, che viene convertito in un prodotto colorato
insolubile che precipita sulla nitrocellulosa.
Come enzima coniugato agli anticorpi secondari viene spesso usata la perossidasi
di rafano, che viene rilevata con il metodo della chemiluminescenza
intensificata.
In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi ossida il luminolo, un substrato
chemiluminescente, con la concomitante produzione di luce, la cui intensit
aumenta fino a mille volte in presenza di un intensificatore chimico. La luce
emessa pu essere rilevata esponendo il blot ad una lastra fotografica.

Reazione di ossidazione del luminolo

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La presenza di bande colorate indica, quindi, la posizione della proteina o delle proteine
di interesse.

Esempio di SDS-PAGE e relativo Western Blot

Std

204 KDa

131 KDa

89 KDa
Serum Albumin

42 KDa

31 KDa

17 KDa

7 KDa

Silver Nitrate Immunoblot


staining

Isoelettrofocalizzazione (IEF)
Questa tecnica permette di separare molecole in funzione del loro
diverso punto isoelettrico.

Ideale per la separazione di molecole anfotere come le proteine.

Il sistema IEF pi utilizzato costituito da gel orizzontali montati su


piastre di vetro o foglietti di materiale plastico.

Allinterno del gel viene formato un gradiente di pH introducendo


delle molecole chiamate anfoliti, le quali sono costituite da miscele
complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici.
In commercio sono disponibili anfoliti che coprono diversi intervalli di
pH, sia ampi (ad esempio pH 3-10), che pi ristretti (ad esempio pH 7-
8).

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Formula generica di anfoliti usati nellisoelettrofocalizzazione

Una proteina in soluzione pu possedere numerose cariche che le derivano dalla


ionizzazione di gruppi delle catene laterali di determinati amminoacidi. Il fatto che
i gruppi ionizzabili siano in forma ionica dipende dal pH del mezzo in rapporto al
pK dei gruppi stessi: ad un pH superiore al pK si ha dissociazione di protoni, ad
un pH inferiore al pK si ha associazione di protoni.
La carica netta di una proteina ad un dato pH la somma algebrica delle sue
cariche positive e negative.
Il punto isoelettrico di una proteina il valore di pH cui la sua carica netta 0.
A questo valore di pH anche la mobilit elettroforetica zero. Se si utilizza un gel
con un gradiente stabile di pH, ciascuna proteina si muover fino alla posizione in
cui il pH corrisponde al suo pI: in tal modo possibile separare proteine che
hanno una differenza anche di solo 0,01 nel loro pI.

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Il campo elettrico applicato fa s che le proteine si muovano fino a


raggiungere i propri punti isoelettrici, nel quale, le molecole sono sotto forma
di zwitterione, dunque non avendo carica non si muovono pi.

pI = 7.4 0
pI = 8.4 0

- -
+ +
0 0 -
+
pH3 pH10
pH = 7.4
pH = 8.4

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
(2D-PAGE)
Questa tecnica combina le caratteristiche della IEF, nella quale le proteine sono
separate in base alla loro carica (pI), con le caratteristiche della SDS-PAGE, nella
quale la separazione avviene in base al loro peso molecolare.
E uno dei metodi analitici pi sofisticati per la separazione di una miscela
complessa di proteine, con alto grado di risoluzione

PRIMA DIMENSIONE (IEF)


Gradiente di pH

SECONDA DIMENSIONE (SDS-PAGE)

PM

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Esempio di 2D-PAGE
NL 3 pI 10 Std KDa

250

150
100
75

50

37

25

20

15

10

pH 3-11

pH 7-11

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Biochimica e biochimica applicata Biochimica applicata 1 Farmacia

Universit "G. d'Annunzio" AA 2009-2010 Facolt di Farmacia

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