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Tossine batteriche

Da oggi parliamo di tossine batteriche. E un argomento molto vasto, credo che mi ci vorranno vari post per esaurirlo, ma credo che sia uno degli argomenti pi affascinanti. I batteri infatti possono essere dannosi in molti modi, a volte basta la colonizzazione di un qualche tessuto, a volte invadono le cellule, a volte scatenano reazioni immunitarie molto forti, tali da danneggiare lospite, ma esistono alcune molecole che vengono prodotte dai batteri che sono dei veri e propri veleni, che di per s, senza la presenza del patogeno, sono in grado di fare danni e che spesso sono il solo o il principale bersaglio delle terapie messe in atto per la cura di una qualche malattia. Esistono due tipi di tossine: lendotossina e le esotossine. La distinzione tra la prima e le altre che lendotossina una componente dei batteri, precisamente una parte della parete dei Gram negativi: lLPS o lipopolisaccaride; le esotossine sono invece prodotti proteici e svolgono la loro azione tossica quando vengono eliminati allesterno della cellula, spesso coinvolgendo vari enzimi cellulari.

Endotossina
Come abbiamo gi visto parlando di colorazione di Gram, lLPS formato da una parte chiamata antigene O, un core polisaccaridico e un lipide A. E proprio questultimo ad essere la vera e propria tossina, anche se probabilmente la regione polisaccaridica ha un ruolo importante sia per la sua solubilit, sia per la struttura stessa della tossina. La sua natura chimica, inoltre, le dona propriet termostatiche e difficilmente immunogena. Lazione di questa tossina molto complessa. Per cominciare possiamo dire che viene riconosciuta dal CD14 dei macrofagi e successivamente dal Toll like receptor o TLR: LPS lega particolari proteine chiamate LPS binding proteins o LBP, il complesso formato si lega al CD14, a questo punto lintero complesso lega il TLR che si occupa della trasduzione del segnale allinterno del macrofago. Il segnale inviato alla cellula quello di produrre Tumor Necrosis Factor (TNF) e Interleuchina 1 (IL1). Queste due citochine sono in grado di stimolare laumento della febbre, diminuire il metabolismo

del ferro, agire sulle cellule endoteliali per aumentare la permeabilit vasale e vasodilatazione , causando quindi una diminuzione della pressione con conseguente shock emodinamico. Allo stesso tempo lLPS in grado di aumentare leffetto sulla circolazione in molti modi: amplificando lazione del TNF e di IL-1 andando ad agire sui linfociti T (che produrranno interferon che stimoler ulteriormente i macrofagi); attivando il complemento, che in grado di danneggiare i vasi, aumentando lo shock; pu stimolare la coagulazione tramite le piastrine, causando coaguli nei vasi (una condizione chiamata CID, o coagulazione intravasale disseminata). Infine agendo sul fegato stimola ancor di pi linfiammazione e causa ipoglicemia. Perch questa reazione violenta nei confronti di questa tossina? Il caso descritto quello pi grave, in cui ci si trova al cospetto di una setticemia da G-, in molti casi questo sitema funziona come un finissimo allarme per linvasione di patogeni e molto spesso riesce a spegnere i focolai dinfezione molto prima che possa far danni. Alcuni studi infatti hanno fatto notare come cavie prive di TLR (quindi incapaci di rispondere allLPS) fossero estremamente sensibili alle infezioni da G-, addirittura in dosi di uno o due batteri per inoculo, che normalmente un organismo sano riesce a gestire senza problemi.

Esotossine batteriche
Esistono molteplici tipi di esotossine, tutte di natura proteica. In generale hanno ottime propriet antigeniche, sono termolabili (ad eccezione dellenterotossine staffilococciche) e vengono distrutte dai succhi gastrici (tranne per le enterotossine staffilococciche e per la tossina botulinica). Le azioni di queste proteine sono varie, esistono infatti principalmente due tipi di interazioni con le cellule ospiti: a livello di membrana e a livello di citosol. Le prime possono, ad esempio, alterare i legami intercellulari, danneggiare la membrana o interferire con il signaling cellulare, le altre invece interferiscono con meccanismi di regolazione enzimatica andando a modificare il metabolismo cellulare.

Bersaglio: membrana cellulare


Le esotossine che hanno come bersaglio la struttura superficiale delle cellule sono di due tipi: tossina esfoliativa e le tossine emolitiche

La tossina esfoliativa prodotta dallo Staphylococcus aureus (in alto un modello), monomerica e ne esistono due tipi, chiamati A e B. E la causa della cosiddetta sindrome della cute (pseudo)ustionata da stafilococco (staphylococcal scalded skin syndrome o SSSS), conosciuta anche come malattia di Ritter o malattia di Lyell. E una patologia tipica degli infanti ed dovuta alla diffusione tramite il sangue della tossina (indipendente, quindi, dalla reale posizione dei batteri nellorganismo). Lazione dannosa, risultante esattamente come ampie ustioni sulla pelle, data dallinterazione con le proteine della matrice intercellulare a livello dello strato granuloso dellepidermide: la stabilit dello strato compromessa e la pelle si danneggia al minimo insulto meccanico.

Le tossine emolitiche, dette anche emolisine o citolisine sono proteine capaci di uccidere le cellule bersaglio agendo sulla membrana plasmatica. Esistono diversi tipi di emolisine: alcune, comuni a molti G+ e rappresentata come esempio dalla emolisina dello S. aureus, polimerizzano formando eptameri e, a livello di membrana, formano dei pori, causando quindi uno scompenso della regolazione degli scambi della cellula con lesterno e mandando la cellula in apoptosi. Un sottogruppo abbastanza importante di queste tossine quello caratterizzato dalla presenza di un gruppo SH, rapidamente inattivate dalla presenza di ossigeno e per questo denominate emolisine O (o ossigeno-labili). Un secondo gruppo di tossine emolitiche quello chiamato RTX (repeats in toxin), il cui nome deriva da una sequenza ricca in glicina ripetuta al C-terminale, che risulta importante per legare il calcio. Gli esempi principali sono dati dalla tossina di Escherichia coli, da quella di Proteus vulgaris e dalla leucocidina di Pasteurella haemolytica. Poi c la tossina di S. aureus che ha un comportamento particolare: sembra funzioni da detergente. Ha infatti una struttura comprendente zone idrofobiche e idrofiliche, andando cos ad interferire con la struttura fosfolipidica della membrana, oltre a formare dei canali che alternano lo scambio ionico. Mentre tutte queste proteine possono avere un ventaglio pur ampio ma definito di bersagli, esistono tossine batteriche con funzione di fosfolipasi molto meno specifiche. Probabilmente il motivo dellesistenza di queste tossine quello di facilitare linsediamento dei batteri nei tessuti dellospite o anche per scopi nutrizionali. Esempi di questo tipo di emolisine sono la tossina di Clostridium perfringens e lemolisina del solito S. aureus

Vediamo infine lemolisina e la leucocidina di Panton-Valentine di S. aureus. Queste due tossine sono prodotte da geni diversi che si combinano, la tossina finale formata da almeno due subunit diverse per entrambe. La prima prodotta da tutti i ceppi di S. aureus, mentre la seconda solo dal 23%, anche se presente spesso nei casi di MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Lazione patogena svolta sulle emazie e sui leucociti per la prima, solo sui leucociti per la seconda: entrambe le tossine agiscono sui leucociti stimolando la produzione di citochine, PVL in particolare si pensa crei pori per il passaggio di ioni e attivi la fosfolipasi A2 alterando il signaling di membrana Esistono diverse esotossine batteriche che agiscono a livello del citosol, interferendo con il normale metabolismo cellulare. A seconda del batterio e della cellula bersaglio gli effetti sono diversi: alterazioni del contenuto di cAMP, inibizione della sintesi proteica, azione neurotropa. Inoltre esistono tossine che agiscono da superantigene, e la tossina carbonchiosa che ha un effetto peculiare. In questi ultimi due post sulle tossine batteriche vedremo di capire meglio come funzionano, cercher di essere il pi chiaro possibile.

Alterazione del contenuto di cAMP

Esistono due gruppi di tossine capaci di modificare il contenuto di cAMP: le prime sono tossine che hanno unattivit enzimatica ADP-ribosilante, le quali agiscono alterando la funzionalit di una serie di proteine G preposte alla regolazione delladenilato-ciclasi; le seconde sono invece tossine che hanno una attivit adenilato-ciclasica intrinseca.

Della prima specie di tossine fanno parte la tossina colerica, la tossina pertossica e la tossina termolabile (LT) di Escherichia coli. Il minimo comun denominatore tra loro che sono tutte tossine di tipo A-B: sono divisibili infatti in due tipi di domini, quelli denominati con A sono importanti per lazione tossica allinterno della cellula, ma non sono in grado di entrarvi senza la parte B della proteina, senza cio i domini capaci di riconoscere i recettori, ma che di per s non hanno attivit tossica. La tossina colerica e la LT hanno azioni molto simili. Le proteine G sono composte da tre subunit: , che pu avere azione stimolatoria (s) o inibitoria (i) sulladenilato-ciclasi, e il complesso che va ad attivare varie cascate di segnale. Le due tossine hanno come bersaglio la subunit s delle cellule intestinali, di fatto attivandola perennemente. La conseguente attivazione delladenilato-ciclasi aumenta la concentrazione di cAMP e, come conseguenza, il contenuto di elettroliti cellulare si altera: ioni e acqua escono dalla cellula superando la capacit di assorbimento del colon e causando una diarrea molto grave, che pu portare a morte per disidratazione. La tossina pertossica prodotta da Bordetella pertussis e il suo bersaglio invece la subunit inibitoria, o i, delle proteine G, di fatto inattivandola. Le cellule bersaglio sono varie, cambiano quindi gli effetti: inibizione della fagocitosi dei macrofagi, leucocitosi, aumentata produzione di insulina Comunque il bersaglio iniziale la mucosa tracheo-bronchiale, che quindi porta, come conseguenza, alla pertosse. Della seconda specie fanno parte ledema factor (EF) della tossina carbonchiosa, che vedremo pi avanti, e la tossina adenilato-ciclasi/emolisina, chiamata anche ciclolisina, prodotta anche questa da B. pertussis. Le conseguenze dellazione adenilato-ciclasica sono le stesse della tossina pertossica, lazione emolitica data dalla sua capacit di creare pori nelle cellule eucariotiche, dei quali si pensa si serva per entrare nelle cellule.

Inibizione della sintesi proteica


Le tossine che inibiscono la sintesi proteica sono la tossina difterica, prodotta dal Corynebacterium diphtheriae, la tossina A, prodotta da Pseudomonas aeruginosa, e la tossina di Shiga prodotta da Shigella dysenteriae e le tossine Shiga-like (SLT o tossine Vero) prodotte dai ceppi di Escherichia coli enteroemorragici. La tossina difterica e la tossina A hanno un meccanismo molto simile: entrambe hanno una struttura A-B ed entrambe hanno una attivit ADP-ribosilante non dissimile da quella colerica, ma il bersaglio la proteina EF-2, fondamentale per la sintesi proteica. Il complesso EF-2-ADP-ribosio che ne risulta inattiva lallungamento della sintesi proteica, portando quindi a morte la cellula. La tossina di Shiga e le SLT hanno invece un meccanismo molto diverso. Entrano nelle cellule per endocitosi mediata da recettori ed hanno unattivit catalitica N-glicosidasica, il cui bersaglio lRNA ribosomiale 28s, contenuto nella subunit 60s. Il taglio al 3 dellrRNA 28s causa un mancato legame, EF-1 dipendente, dellaminoacil-tRNA al sito A del ribosoma, bloccando quindi la sintesi proteica con conseguente morte cellulare. Abbiamo ancora alcune tipologie di tossine batteriche da vedere, oggi le vedremo tutte: le tossine con azione sul citoscheletro, la tossina carbonchiosa, le tossine neurotrope e i superantigeni

Alterazione del citoscheletro

La maggior parte delle tossine batteriche che agiscono sul citoscheletro hanno un meccanismo A-B, ma le due subunit sono secrete separate e si uniscono solo in prossimit della membrana cellulare, sono tutte ADP-ribosil-transferasi e il loro bersaglio lactina. Il prototipo di questo tipo di tossine la tossina C2 di Clostridium botulinum. Il batterio secerne C2I e C2II (rispettivamente subunit A e B) separati, quando C2II lega il recettore lega anche C2I e ne causa lingresso. Lazione di C2I tale che causa morte cellulare molto rapidamente e, nelle cavie, il DL50 della tossina si aggira intorno a 550 ng. Da ricordare inoltre il fattore citotossico necrotizzante (CNF-1 e CNF-2) di ceppi uropatogeni di Escherichia coli, che agisce sul signaling di membrana tramite proteine G, e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.

Esotossina carbonchiosa
Lesotossina del Bacillus anthracis composta da tre distinte componenti, nessuno dei quali tossico di per s: Edema Factor (EF), o fattore I; Protective Antigen (PA), o fattore II; Lethal Factor (LF), o fattore III. EF e LF sono il componente A della tossina, mentre PA il componente B. Il meccanismo dazione (qui unimmagine) piuttosto complesso: PA, una proteina di circa 83 kDa, lega un recettore (ATR, anthrax toxin receptor) e viene attaccato da una proteasi che ne taglia via circa 20 kDa. la parte rimanente, chiamata p63, ora in grado di legare EF e LF, avvenuto il legame la tossina endocitata nella cellula. EF una adenilato ciclasi attivata dalla calmodulina, che aumenta la concentrazione di cAMP, la cui conseguenza ledema. LF una metalloproteasi capace di attivare la cascata di segnale delle MAP kinasi, sfociando nella attivazione del fattore NF-B. Il bersaglio preferito dalla tossina batterica rappresentato dai macrofagi, che con lattivazione di NF-B, rilasciano ingenti quantit di citochine, tra cui il tumor necrosis factor- e linterleuchina-1 (TNF- e IL-1), che portano a shock e sono responsabili della letalit della tossina. La tossina del carbonchio prodotta dal plasmide pX-01, mentre il plasmide pX02 produce la capsula, che un altro fattore di virulenza del batterio. La perdita di pX-01 per le alte temperature porta alla formazione di un batterio attenuato non virulento, la perdita di pX-02 invece porta ad una virulenza ridotta, da questi si pu ricavare un vaccino.

Tossine neurotrope
Due specie di Clostridium producono le tossine neurotrope: C. tetanii e C. botulinum, i quali rispettivamente producono tossine capaci di causare una paralisi spastica o flaccida. Per capire come funzionano queste due tossine prima di tutto bisogna capire come funziona il movimento muscolare collegandolo al sistema nervoso centrale. Mettiamo il caso in cui vogliamo flettere un braccio. Normalmente il cervello mander i suoi impulsi alla spina dorsale, da l partir il nervo che passer limpulso alla giunzione neuromuscolare e dar il comando al bicipite di contrarsi. Il tricipite risponde con una distensione. Questa distensione manda un impulso al midollo spinale che chiede una nuova contrazione, che non avviene solo perch esiste, sempre nel midollo spinale, un neurone che ha ricevuto limpulso dal cervello di inibire questa contrazione riflessa e che agisce sugli stessi motoneuroni su cui agisce limpulso riflesso di contrazione. C. tetanii produce una tossina di 150 kDa, che viene tagliata in due parti (Heavy o H e Light o L) di 50 e 100 kDa, unite da un ponte disolfuro, di cui la pi pesante funziona come parte B della tossina. La tossina tetanica agisce legando i recettori dellacido -amminobutirrico (GABA) nelle sinapsi tra i neuroni inibitori della contrazione riflessa e i motoneuroni: il risultato che tutti i muscoli sono

contratti contemporaneamente (paralisi spastica) portando alla classica posa del malato grave di tetano (opistotono qui) e che comincia con una smorfia sulle labbra chiamata trisma. C. botulinum ampiamente presente e produce una proteina capace di resistere agli acidi dello stomaco, ma non alle alte temperature (quindi non presente negli alimenti trattati in maniera adeguata): il botulino quindi una intossicazione alimentare. La tossina botulinica ha un DL50 bassisimo, per il topo di circa 10-10 g, e questo ne fa una delle tossine pi potenti in natura. La sua azione quella di inibire il rilascio di acetilcolina nei motoneuroni, questo porta allimpossibilit di contrarre qualunque muscolo e ad una paralisi chiamata paralisi flaccida.

Superantigeni
Alla classe dei superantigeni appartengono alcune enterotossine staffilococciche (SE) e la tossina dello shock tossico (TSST) di Staphilococcus aureus, le tossine pirogene streptococciche (SPE) e il superantigene streptococcico di Streptococcus pyogenes. La dicitura di superantigene data loro perch attivano in maniera abnorme il sistema immunitario, causando una elevatissima secrezione di citochine e interleuchine che a loro volta causano shock. Il motivo di questo meccanismo che formano un ponte tra lMHC delle cellule presentanti lantigene (APC) come i macrofagi e il TCR dei linfociti. Normalmente il legame TCR-antigene-MHC breve e specifico, perch il recettore del linfocita molto selettivo, il linfocita si moltiplica e produce citochine. Questo superantigene invece lega una regione di MHC che normalmente non fa parte della normale presentazione dellantigene, con la conseguenza che lega il TCR in maniera aspecifica (quindi lega tutti i linfociti presenti, indipendentemente dalla loro specificit) e pi intensa (qui unimmagine). Questo, oltre a portare uno shock per lazione della gigantesca attivazione linfocitaria, porta anche ad un abbassamento delle difese immunitarie, perch la moltiplicazione stata aspecifica, e quindi c un effetto diversivo rispetto allinfezione in atto