Antibiotici, antibiogramma, MIC prossima lezione

Effetti dei fattori ambientali sulla crescita

Quando si coltivano i microrganismi in laboratorio ci si mette nelle condizioni più vicino possibili del nostro
organismo, si cerca di replicare le condizioni naturali in cui vive quell’organismo. I componenti che si
aggiungono ai terreni servono come fonti energetiche e di carbonio e da altre fonti in quanto la cellula è
costituita anche da macronutrienti, che si aggiungono a più alte concentrazioni e micronutrienti, si
forniscono nel terreno di coltura in tracce. Caratteristiche nutrizionali, quando si prepara un terreno si deve
far conto dei fattori nutrizionali, in genere il terreno è fornito da ditte specializzate con nutrienti utili a quel
microrganismo. Ad esempio si posso utilizzare terreni per batteri eterotrofi che hanno un contenuto di
componenti organici e inorganici che permettono la crescita di microrganismi, ci sono anche terreni che si
preparano che non sono in commercio, fino a qualche tempo fa si preparavano per le alghe, ora è stato
formulato un terreno preparato in commercio che è il BG11, il ricercatore che progettò questo terreno lo
mise appunto per far crescere organismi algali. Procedure di arricchimento, tabella, procedure per
l’isolamento di bacilli, organismi sporigeni, variando piccole concentrazioni di sostanze che si aggiungono al
terreno si ottiene la crescita di un gruppo microbico rispetto ad un altro, si variano condizioni nutrizionali e
ambientali.

Dalle esigenze del microrganismo, per far crescere microrganismi bisogna considerare i fattori ambientali
della crescita, dipende dal tipo o dal gruppo di microrganismi considerati. La maggior parte dei
microrganismi cresce in condizioni moderate, mesofilia si intendono tutte le condizioni di mezzo, condizioni
più vicine all’habitat umano, è una definizione antropocentrica.

Altri microrganismi amano le condizioni estreme, estremofili, tutte quelle condizioni che impediscono la
vita di tutti gli altri organismi viventi, questi microrganismi estremofili vivono a ridosso di vulcani,
profondità marine, pH acidi come l’aceto, miniere, a pH molto alcalini al di sopra di pH 8. Abbiamo
organismi che amano proprio questi ambienti e che raggiungono l’optimum a queste condizioni. Dobbiamo
dividerli in base ai vari fattori ambientali, ci sono
organismi che vivono bene con la maggior parte dei
fattori ambientali che sono in range di mezzo (mesofili)
ma alcuni possono essere ad alte temperature.
Possono avere più di una richiesta di fattori ambientali
estremi o solo per quanto riguarda temperatura, pH,
ossigeno. Con questa nostra divisione in range di
adattabilità li dividiamo in maniera idonea. La
classificazione si basa sulla disponibilità di soluti,
osmotolleranti, alofili (necessarie alte concentrazioni
saline ma non quelle dell’ambiente marino, in quanto
la concentrazione in ambiente marino definisce un
organismo alotollerante), alcalofili, neutrofili.

Fattori ambientali comuni di cui hanno bisogno i

microrganismi sono pH, disponibilità di acqua,
pressione osmotica, temperatura, pressione
atmosferica, radiazioni.

pH, range che va da 0-14, gli estremi non supportano la

vita, non esistono organismi che vivono a pH 0 o 14, ci
sono organismi che vivono ad un pH intorno ad 1-2, e
altri che riescono ad arrivare fino a 12, sono i range in
cui troviamo i pH divisi in estremi acidi e alcalini e in
mezzo a questi pH c’è quello neutrale. Gli organismi che vivono in questi ambienti sono detti neutrofili se
vivono ad un pH intorno a 7, tra (4-9) si adattano in ambienti suscettibili a variazioni di pH in quanto ci
possono essere delle variazioni. In colture promosse in laboratorio ci sono le soluzioni tampone per
mantenere un pH costante, le soluzioni tampone hanno ingredienti con una doppia funzione, una miscela di
fosfati, monobasico e dibasico con funzione tamponante, aggiustiamo il pH della soluzione con il pH
desiderato dai microrganismi, poi sono i microrganismi che vanno a modificare il pH, dura per un certo
tempo la soluzione tampone in quanto i microrganismi possono rilasciare composti di scarto che possono
essere acidi o alcalini, vanno a modificare il pH del sistema. In genere si usano le soluzioni tampone in
ambiente chiuso, ambiente liquido, come una fiasca. Nella piastra i microrganismi stanno fermi dove sono
seminati. Nella curva di crescita abbiamo una serie di interruzioni quando c’è una variazione di pH perché
vengono rilasciati dai microrganismi delle sostanze, come quando vengono rilasciati acidi ed il pH va verso
l’acidità, se rilascia composti alcalini andrà verso pH basico. Molti organismi non amano queste
concentrazioni di pH, abbiamo molti parametri, i microrganismi che resistono meglio alle variazioni di pH
sono per l’appunto i microrganismi che sono correlati alla crescita all’interno dell’organismo (come
organismi patogeni), l’organismo in cui vivono ha un ambiente più stabile di quello naturale e non ci sono
notevoli variazioni di pH. Questo range di 4-9 non è fisso per tutti i neutrofili, ci sono quelli che hanno un
range molto ristretto, come tra 6- 7.5, non possiamo variare il pH per la crescita di questi microrganismi,
altri hanno variabilità molto elevata. Alcalinofili, organismi che vivono in pH maggiore di 7, tra 8-11.5, 11.5
è il limite di crescita.

acidofili range tra 1-5,5

neutrofili range di tolleranza tra 4-9

alcalinofili range tra 8-11.5

esempio curva range di tolleranza alle concentrazioni saline

quando si parla di range lo dobbiamo immaginare come un segmento rapportato in asse cartesiano in cui si
definisce un valore minimo, un valore massimo e un valore ottimale, variano da microrganismo a
microrganismo. Al di sotto del valore minimo non si ha la crescita del microrganismo, al di sopra del valore
massimo non si ha la crescita del microrganismo e si ha inoltre la denaturazione delle macromolecole,
valore ottimale, optimum, massima velocità di crescita del microrganismo. Le macromolecole più
influenzate dalle variazioni di pH sono proteine e DNA, ci sono valori soglia in cui si denaturano proteine e
DNA, sono processi irreversibili che portano alla morte della cellula. A valori ottimali si ha la massima
crescita del microrganismo.

Il fatto che i microrganismi vivano a pH diversi ci fa riflettere, il citoplasma di ogni microrganismo ha un pH

vicino alla neutralità, la cellula dovrà mantenerlo tramite vari sistemi. Uno di questi è l’ATPasi, regola
l’ingresso dei protoni per poi attuare la sintesi di ATP. In alcuni organismi, per regolare il pH passano ioni
potassio invece che protoni in modo da non rendere acido il citoplasma. Ci sono altri sistemi, ad esempio il
microrganismo rilascia prodotti acidi o basici e rende l’ambiente più idoneo alla sua crescita oppure se non
ha la possibilità di aggiustarsi, ad esempio, come un microrganismo che vive nelle rocce, avviene il rilascio
di composti acidi, un po' come quando si versa acido cloridrico su calcare che porta alla solubilizzazione
della struttura carbonatica, si forma anidride carbonica e acqua e si creano delle bollicine in seguito alla
reazione chimica si ha questa reazione, anche gli acidi deboli che rilasciano i microrganismi determinano la
solubilizzazione del carbonato di calcio, si ripristina l’ambiente neutro che preserva la vita dei
microrganismi. Rilascio di sostanze acide che vengono tamponate dal substrato su cui vivono i
microrganismi, precipitazione e solubilizzazione, si possono avere solubilizzazioni in ambiente naturale,
servono per creare nicchia idonea per la colonizzazione, gli ambienti in una superficie liscia non permettono
la colonizzazione in quanto non intrappolano acqua, su una superficie non liscia si creano concavità con
acqua che può ristagnare più a lungo e si ha una superficie più stabile per la crescita di microrganismi.

Ci sono tutta una serie di cambiamenti del pH in cui si ha forte movimento di protoni per far stare il pH
costante e si ha la possibilità sintesi di proteine ambivalenti, permettono protezione dall’ambiente acido o
da alte temperature. Le alte temperature o variazioni di pH causano un cambiamento a livello dei
componenti della membrana, gruppi carbossilici, amminici e lipidici possono cambiare, come in Bacillus
acidocaldarius, presenta acidi grassi di tipo ciclico, senza legami tetraetere, risposta contro pH acidi,
acidocaldarius resiste a due input estremi, quali pH e temperatura.

Un altro fattore è l’attività dell’acqua o potenziale dell’acqua, tutti gli organismi richiedono acqua per
svolgere le proprie funzioni vitali, la disponibilità di acqua è il fattore di crescita più importante per un
microrganismo, non dipende solo da quanto è umido o secco un ambiente ma anche dalla concentrazione
di soluti disciolti nell’acqua presente, i soluti disciolti rendono l’acqua meno disponibile per l’organismo.
L’attività dell’acqua aw è un valore che varia tra 0 e 1 in base alla concentrazione di acqua che richiede il
microrganismo, 1 acqua pura senza soluti presenti, 0 è assenza totale di acqua, corrisponde al rapporto tra
la pressione di vapore dell’aria in equilibrio con una sostanza o una soluzione e la pressione di vapore
dall’aria in equilibrio con acqua pura. Se in base all’attività dell’acqua, i microrganismi presentano la
possibilità di vivere in ambienti secchi, la maggior parte dei microrganismi muore in ambienti secchi, un
organismo può resistere (e quindi non crescere) in ambienti privi d’acqua, come endospore, ci sono altri
organismi con strategie che permettono di sopravvivere a condizioni limite di disponibilità d’acqua, 0,7 è il
valore limite di sopravvivenza degli organismi che vivono in assenza di acqua, come funghi xerofili, funghi
neri, presentano melanina, protegge dall’ossidazione della luce solare, inoltre permette di farli sopravvivere
in ambienti desertici, non solo climi secchi senza acqua, la carenza di acqua è anche dovuta al fatto che non
si trova allo stato liquido, sono entrambi climi estremi per quanto riguarda la disponibilità di acqua, i funghi
xerofili hanno questo guscio di melanina, permette di vivere senza riprodursi, le endospore hanno la
capacità di sopravvivere per millenni, come dimostrato dai carotaggi dell’Antartide, sono state trovate
strutture sporigene che hanno ripreso a germinare quando poi sono state coltivate nel terreno di coltura.
Alcuni microrganismi vivono in ambienti vicini all’acqua pura, 0.995 soluzione fisiologica, sangue umano,
quando si fa una coltura in laboratorio si simulano le condizioni del sangue umano con 0.9% di soluzione
fisiologica. diversi substrati con concentrazione inferiore dovuta alla presenza di soluti creano ambienti non
idonei nella crescita. in ambienti isotonici, non succede niente, se si cambiano le condizioni e l’ambiente
diventa di tipo ipotonico, c’è minore concentrazione di soluti all’interno della cellula, l’acqua entra nella
cellula e scoppia se la cellula si presenta priva di parete cellulare, in ambiente ipertonico ci sarà fuoriuscita
di acqua con raggrinzimento della cellula, sempre nelle cellule sprovviste di parete cellulare. Di norma il
citoplasma ha una concentrazione di soluti superiore a quella dell’ambiente circostante che far si che
l’acqua tenda a diffondersi all’interno della cellula.

Pressione osmotica, in base a questa possiamo distinguere i microrganismi osmofili o xerofili. I

microrganismi osmofili sono quelli che riescono a crescere in ambienti con elevate concentrazioni
zuccherine, i microrganismi xerofili sono in grado di crescere in ambienti secchi. I funghi xerofili sono quelli
che vanno a deteriorare i dipinti, si trovano su substrati che non contengono acqua. Osmofili possono
crescere ad alte concentrazioni zuccherine, nelle marmellate abbiamo la conservazione in cui la
concentrazione di zuccheri è così elevata che non permette la crescita di determinati microrganismi.
Quando apriamo la marmellata inizia a formarsi la muffa in superficie, condizioni idonee alla crescita,
aprendo il contenitore abbiamo condizioni di aerobiosi, favoriamo i funghi aerobi. Si creano poi condizioni
in cui l’organismo usufruisce delle capacità zuccherine (osmofili). Il miele è sconsigliato per i neonati, può
contenere spore, potrebbe essere pericoloso per il sistema immunitario del lattante. Può verificarsi la
presenza eventuale di spore rimaste nel processo di lavorazione del prodotto. Ci possono essere anche
organismi osmotolleranti, riescono a vivere in presenza di alte concentrazioni zuccherine ma non
raggiungono l’optimum

La pressione osmotica è data dalla presenza dei Sali ad alte concentrazioni, esistono microrganismi alofili,
organismi alotolleranti e alofili estremi in base alla concentrazione di sale ideale che si utilizza per la
crescita degli organismi. Alofili, l’acqua di mare contiene circa il 3% di cloruro di sodio di sciolto e poi ci sono
concentrazioni di minerali e altri elementi, i microrganismi marini necessitano di NaCl e crescono in
maniera ottimale con valori di aw tipici degli ambienti marini, intorno a 0,98. Questi organismi sono alofili,
per questi la necessità di NaCl è assoluta e non potrebbero viverne senza ne può essere sostituito da altri
minerali. Quindi per poter crescere gli alofili hanno bisogno di NaCl, il valore ottimale dipende dal tipo di
microrganismo e varia in relazione al suo habitat. Gli organismi marini varia tra 1-4%, per gli organismi che
provengono da ambienti ipersalini varia tra 3-12%, poi ci sono anche alofili estremi che vivono ambienti
ipersalini e richiedono livelli anche maggiori di NaCl, ad esempio le saline, il mar Morto ecc.

Ci sono inoltre organismi che riescono a tollerare basse concentrazioni di soluti disciolti, ma riescono a
vivere meglio senza questa presenza di soluti disciolti, questi sono gli alotolleranti. Al contrario, ci sono
organismi definiti alofili estremi che sono crescono solo in contrazioni molto elevate di NaCl e non crescono
al di sotto di queste concentrazioni

Quando un organismo viene trasferito da ambienti ad elevata a w ad ambienti con bassa aw, il microrganismo
mantiene un bilancio positivo aumentando la concentrazione intramolecolare di soluti. Questo avviene o
pompando soluti dall’interno all’esterno della cellula oppure il microrganismo sintetizza soluti nel
citoplasma, questi soluti però non inibiscono i processi biochimici della cellula, vengono chiamati soluti
compatibili. Questi non interferiscono con i soluti all’interno della cellula, le cellule possono sintetizzare o
comunque integrare all’interno della cellula differenti tipi di soluti compatibil

I soluti compatibili più comuni sono glicerolo e glicina betaina. La designazione degli organismi come non-
alotolleranti, alotolleranti, alofili e alofili estremi, riflette la capacità di questi organismi di produrre o
accumulare soluti compatibili.
Tutte molecole o prodotte dall’organismo a condizioni ipertoniche o prelevate dall’ambiente esterno,
definiti come soluti compatibili, non rientrano nei processi normali nella cellula, sono molecole polari
idrosolubili. Questo vale per ambienti ipertonici (maggiore concentrazioni di soluto nell’ambiente
extracellulare)

In ambienti ipertonici la cellula utilizza canali meccanosensibili per far uscire i soluti in modo da non andare
incontro a disidratazione.

Gli alofili si dividono in vari gruppi

- se vivono solo in presenza di alte concentrazioni saline, superiori al 3%, sono alofili
- altri sono ipersensibili al sale, condizione chiamata come non alofilia, come quella che presenta
escherichia coli, basta un piccolo incremento di sale e la crescita si blocca, il sale inibisce la crescita
- altri sono alofili estremi, la loro crescita inizia solo quando la concentrazione salina raggiunge un
certo livello, quando raggiungono l’estremo dove c’è il valore minimo inizia la crescita di questi
organismi, aumentando ancora la concentrazione salina raggiungono l’optimum e avremo una
crescita esponenziale, aumentando la concentrazione salina si blocca la crescita e si va nella fase di
morte quando raggiungono il valore massimo, questo vale per gli alofili. Nei microrganismi alofili
propriamente detti, hanno un optimum completamente diverso dai precedenti, ognuno si
distribuisce a seconda delle esigenze proprie del gruppo di appartenenza. Abbiamo valori di crescita
ottimale degli alofili intorno a 0,2M, gli alofili estremi hanno valori ottimali di crescita maggiori di
2M. La tolleranza può essere anche compatibile con la replicazione, l’optimum per la massima
crescita dell’organismo. all’interno dei vari microrganismi, le concentrazioni di soluti sono
abbastanza costanti, non ci sono differenze sostanziali all’interno di composizione di soluti, le
concentrazioni citoplasmatiche sono simili tra di loro.

Temperatura, i microrganismi sono capaci di crescere in ambienti ad alta temperatura, come suoli, pozze
d’acqua scaldate dal sole, sorgenti termali bollenti, i microrganismi che vivono in questi ambienti sono
altamente adattati alla temperatura del loro habitat. La temperatura si può usare come sistema per la
sterilizzazione dei microrganismi, ci sono tecniche come becco Bunsen e autoclave, la stufa. Nel laboratorio
ci sono 3 modalità di utilizzo della temperatura diverse, una è la fiamma diretta, Bunsen, un analogo è il
lanciafiamme, si usa per grandi epidemie, i pazienti infettati con infezioni da virus in cui non si conoscono i
modi per neutralizzarli, causano epidemie, ad esempio quelle di peste, colera, in queste epidemie tutto
veniva bruciato, le case venivano sanificate con calce viva, altamente alcalina, in quanto batteri patogeni
sono mesofili per pH.

Temperatura ha un effetto sterilizzante, possiamo fare differenza tra calore secco e calore umido, calore
umido è quello generato dal vapore, da acqua allo stato liquido si trasforma in vapore, la temperatura è a
100°, vapore fluente. L’autoclave non è vapore fluente, è un vapore sotto pressione, la pressione fa si che la
temperatura del vapore da 100° può passare ad una temperatura superiore 121°, questo perché secondo la
legge di Gay-Lussac a volume costante, pressione e temperatura sono direttamente proporzionali. La
sterilizzazione può avvenire all’interno di un recipiente con volume costante, autoclave.

Tindallizzazione, metodo del riscaldamento frazionato, è un tipo di sterilizzazione termica mediante calore
ideata da Tyndall. Si fanno dai 3 ai 5 riscaldamenti a temperature tra i 60 e 80° della durata di circa un’ora
ciascuno e l’intervallo di tempo tra un riscaldamento e l’altro è di circa 24h. si basa sul principio che le
forme vegetative vengono distrutte dal primo riscaldamento, nelle successive 24h andrebbero a germinare
le forme sporigene formatesi con il primo riscaldamento, avviene nel primo giorno l’uccisione delle forme
vegetative che poi vengono distrutte dai successivi riscaldamenti, si può ripetere fino a 5 volte per
sicurezza. È un riscaldamento frazionato in 3 giorni, uccisione delle forme vegetative. Veniva associato
anche nella preparazione di cibi, inscatolati e sterilizzazione di questo tipo. L’unica pecca di questo metodo
è che non considera che le spore per germinare hanno bisogno di condizioni ottimali; quindi, potrebbero
anche non germinare dopo 24h. Molte delle scoperte sono associate all’attività militare, era più comodo
fornire di scatolette i militari, le scatolette erano sterilizzate proprio grazie alla tindalizzazione. Un’altra
scoperta che fu tenuta segreta fu quella della penicillina fu tenuta segreta per essere usata come arma, si
tiene segreta così il mio nemico ferito non può usare questa procedura per curare i soldati feriti, così noi la
possiamo usare per guarire i feriti nostri, i nemici muoiono. Ogni cosa ha un suo perché, la microbiologia
favorisce la guerra, abbandonare i principi morali è il primo passo.

I microrganismi si possono distribuire in base al loro range di sopravvivenza e di crescita alle basse o alte
temperature.

- tra 0-20° ci sono gli psicrofili, esistono anche organismi che hanno il loro range di tolleranze tra 0-
35°C, psicrotrofi
- mesofili hanno un range che va da 8-46, ambienti in cui possono crescere organismi patogeni,
- termofili range di tolleranza tra 40-70 gradi, temperature superiori al limite massimo dei mesofili
- ipertermofili 65-95°C,
- ipertermofili estremi superano la temperatura di ebollizione dell’acqua, si trovano in prossimità di
bocche vulcaniche, geyser, possono vivere anche dove sono presenti vulcani sottomarini 115° in
quanto l’aumento di pressione favorisce l’aumento della temperatura, sono organismi sia
ipertermofili e sono anche costretti a vivere a alte pressioni. Camini idrotermali, sorgenti termali
nelle profondità oceaniche, possono raggiungere 350°.

Nell’autoclave non passa l’acqua all’interno dei recipienti contenenti le fiasche o i terreni agarizzati, si
mantiene lo stato liquido sennò andrebbero a bollire, c’è una forte pressione interna, fa si che il nostro
recipiente si mantenga libero. Una volta terminato il processo di sterilizzazione non si può aprire l’autoclave
a più di 100 gradi, sennò c’è l’ebollizione istantanea del terreno, scoppio dei tappi, si aspetta che la
temperatura sia al di sotto di 80°, si stabilizza la pressione, avremo un terreno molto caldo ma non con la
temperatura di ebollizione. I microrganismi non hanno un sistema di regolazione della temperatura come
organismi più complessi, sono sensibili a temperature non consone alla loro crescita. se dovessero
riscontrare temperature non consone alla crescita andrebbero incontro a quiescenza. Questa limitazione
che impedisce la crescita a temperature non idonee è dovuta al fatto che i microrganismi possiedono
molecole organiche sensibili alla temperatura, ad esempio le strutture proteiche possono perdere la loro
funzionalità, gli enzimi infatti hanno una temperatura ottimale alla quale funzionano in modo ottimale.
Temperature superiori a quella ottimale determinano la denaturazione delle proteine, una volta portati a
temperatura non idonea alla crescita, queste proteine riportate a temperatura più bassa non riescono a
riprendere la propria funzionalità. Le basse temperature mantengono la vitalità delle cellule, possono
servire alla conservazione dei nostri ceppi in laboratorio, bisogna proteggere quello che c’è all’interno della
cellula. il frigo ha un a funzione importante nella conservazione degli alimenti che hanno una certa durata.
Se si tengono per troppo tempo carne o alimenti di origine vegetale si vede la muffa e assume un cattivo
odore, la bassa temperatura mantiene i microrganismi in uno stato di quiescenza che non dura a lungo, poi
c’è l’adattamento del microrganismo che si adatta alle condizioni ambientali e inizia la crescita,
pseudomonas cresce a 4°C determina il cattivo odore dal rilascio di sostanze e formazione di biofilm, muffe,
organismi che crescono a basse temperature, sui formaggi ad alta concentrazione proteica si possono
trovare funghi neri, di altri colori e biofilm di colore rosso. Le sospensioni si preparano a temperature di -
20°C, -80°C, prepariamo le sospensioni in ambiente protetto e glicerolo, il glicerolo con concentrazione al
10% viene messo in una sospensione batterica per evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che
potrebbero forare le cellule batteriche col congelamento. Con il glicerolo si può effettuare un congelamento
senza intaccare la vitalità delle cellule per poi consentire la ripresa di un ciclo vegetativo normale.

I fattori di crescita abbiamo detto che hanno un valore minimo, massimo ed un optimum. Minimo
temperatura al di sotto della quale non si ha crescita, il valore massimo è quello che al di sopra non si ha
crescita. La non crescita è data da due processi, la temperatura più elevata determina la denaturazione, la
 bassa temperatura porta a processi di gelificazione
delle membrane. L’Optimum, è determinato dalla
cinetica enzimatica, la cinetica della reazione
aumenta con l’aumentare della temperatura, nella
cinetica chimica però non si hanno limiti di
temperatura. Nella cinetica biologica invece si
hanno limiti di temperatura, l’optimum è dato
dalla temperatura vicino al massimo ma al di sotto
del valore massimo, punto di massima velocità di
crescita, siamo nella fase esponenziale di crescita a
queste temperature, aumentando ancora la
temperatura c’è la fase di morte in quanto avviene
la degradazione delle proteine. Le proteine
resistenti al calore hanno delle variazioni alla
catena amminoacidica, sono tipicamente
caratterizzate da un incremento dei legami ionici
tra amminoacidi acidi e basici e presentano domini
altamente idrofobi. Un esempio di enzima
termostabile è la DNA polimerasi isolata da
Thermus acquaticus, Taq polimerasi, viene
utilizzata per automizzare la ripetizione delle fasi della reazione della catena delle polimerasi, PCR, tecnica
di amplificazione del DNA.

Psicrofili e psicrotrofi, amano basse temperature. Psicrofili sono caratterizzati dalla crescita a 0°, tutti e due
hanno la capacità di crescita in comune a 0°, crescita significa riproduzione, 0° vale a dire acqua solida, però
se si inserisce in questo ambiente dei soluti si abbassa la soglia di solidificazione per la presenza di soluti e
torna la disponibilità di acqua, l’acqua si mantiene liquida fino ad un ceto punto, lo strato superiore
solidifica e sotto abbiamo acqua allo stato liquido.
quelle riportate sopra sono le condizioni di crescita dei vari gruppi di microrganismi in relazione alla
temperatura, in inglese perché si spilava a tradurle. Sono tutte curve di crescita che partono nel momento
in cui la temperatura diventa compatibile per quel determinato organismo, esprimono anche l’optimum del
microrganismo. Tutti i mesofili possono crescere a 37°, temperatura comune a tutti i mesofili. I termofili
non ci sono punti comuni. Organismi termodurici, microrganismi che resistono alle sterilizzazioni.

definizione di range e optimum

Crescita psicrofila, avviene con i ribosomi a basse temperature, resistono a queste basse temperature ed
eseguono al meglio la sintesi proteica, se la temperatura va sopra i 20° si blocca la sintesi proteica o c’è
comunque una diminuzione di questa attività, sono adatti per climi freddi. Le basse temperature fanno si
che la sintesi avvenga in maniera ottimale a 0° e la membrana si modifica con l’adattamento di acidi grassi
insaturi, evitano la gelificazione della membrana che non permette gli scambi tra interno ed esterno. Se il
freddo causa la gelificazione della membrana cellulare, la sua struttura diventa rigida e meno permeabile,
impedendo il passaggio di sostanze attraverso di essa. Ciò causa problemi alla cellula poiché limita la sua
capacità di assorbire nutrienti o espellere composti di rifiuto, in alcuni casi causa la morte della cellula
stessa.
Fattori ambientali, il fatto che un gruppo di microrganismi cresca in un determinato range significa che quel
fattore ambientale andrà a selezionare il microrganismo a seconda dell’ambiente che stiamo considerando.

Tutti i range è un segmento, non una retta, il segmento ha un inizio ed una fine, è definito da un punto
minimo e da un punto massimo, nel caso della temperatura avremo una temperatura minima ed una
temperatura massima e all’interno di questo range ci sarà una temperatura ottimale (optimum), la
temperatura ottimale è quando si ha la massima crescita del microrganismo in questione e questo valore è
posto vicino alla temperatura massima ma al di sotto di essa. Questo perché la velocità della crescita
microbica tiene conto della cinetica enzimatica che a sua volta tiene conto della cinetica chimica, in cui la
temperatura regola la velocità di crescita, maggiore è la temperatura maggiore sarà la velocità di quella
reazione chimica. Nella cinetica enzimatica, la temperatura gioca un ruolo ottimale fino ad un certo punto
perché poi, a temperature troppo elevate, avviene il misfolding delle proteine, inibisce la funzionalità
dell’enzima stesso, è regolata dal limite dell’innalzamento di temperatura che può avvenire fino ad un certo
punto, perché poi la denaturazione causa la morte cellulare. Le endospore sono l’eccezione alla regola in
quanto possono resistere a temperature elevate fino a valori non compatibili con la vita, valori di
resistenza. Al di sotto della temperatura minima del range non significa morte cellulare, questo perché
portiamo l’esempio del frigorifero, dopo un certo tempo gli alimenti del frigo sono deteriorati, fanno puzza
o si formano biofilm. Il frigo sta a 4°, i microrganismi hanno un periodo di adattamento a questa
temperatura per poi andare a crescere sugli alimenti. Basse temperature servono anche a conservare i
ceppi di collezione, -20° o -80°, bisogna avere la precauzione di mettere un agente protettivo come il
glicerolo al 10% per evitare che si formino cristalli di ghiaccio che infilzano la membrana plasmatica con la
fuoriuscita di tutto quello che presenta. Modalità dei ceppi della liofilizzazione, processo che trasforma
l’acqua in forma solida in uno stato di vapore, mantengono le caratteristiche quando il contenuto di acqua
viene ripristinato, cellule che vengono conservate che perdono tutta l’acqua possibile e ripristinando il
contenuto di acqua riprendono (la maggior parte dei microrganismi, alcuni muoiono) la vitalità e possono
essere piastrati. L’allontanamento dell’acqua fa si che la vita possa essere prolungata più a lungo, questo
perché l’acqua permette processi che determinano il deterioramento. Tutti i processi chimici avvengono in
presenza di acqua, allontanando l’acqua non avviene il processo.

La crescita a basse temperature avviene in base al fatto che i ribosomi possano funzionare al meglio per il
processo di sintesi proteica a temperature inferiori ai 20°, sono instabili (le due subunità non possono
essere unite per svolgere la sintesi proteica) a temperature superiori ai 20°. C’è un fattore proteico che
permette la sintesi a 0°. L’acqua allo stato liquido a 0° si ha quando in soluzione troviamo dei soluti, ad
esempio in ambiente marino la temperatura di congelamento è più bassa rispetto a quella dell’acqua
distillata. Le membrane si modificano, nel caso di psicrofili si vede un aumento di acidi grassi insaturi, nel
caso dei termofili aumentano gli acidi grassi saturi, questo fa si che le membrane non perdano la
funzionalità, la funzionalità della membrana è quella di favorire gli scambi e inserimento di proteine canale
per favorire gli scambi. I termofili hanno modifiche che tendono a stabilizzare le strutture per la
comunicazione con l’esterno. amminoacidi non polari vengono sostituiti con amminoacidi polari,
aumentano legami ionici e legami idrogeno, le cellule possono avere dimensioni più piccole per ottimizzare
il rapporto superficie/volume, modificazioni biochime delle macromolecole, acidi grassi saturi e catene più
ramificate e più lunghe.

Rapporti dei batteri con l’ossigeno

- aerobi vivono in presenza di ossigeno e

questo ha un ruolo fondamentale in
quanto è l’accettore finale di elettroni,
- Anaerobi, ossigeno è un ossidante
potentissimo, se le cellule sono prive di
enzimi adatti per neutralizzare i
composti di ossidazione che si formano
a contatto con l’aria questi muoiono
perché tossico

Radicali dell’ossigeno, ossigeno singoletto, superossido e perossido, questi possono essere idrolizzati se
sono presenti gli enzimi, se non sono presenti le cellule muoiono. Da questo deriva la variabilità dei
microrganismi che sono classificati in aerobi o anaerobi.

Ci sono anche aerobi:

- Obbligati, non riescono a vivere in assenza di ossigeno

- Facoltativi, l’ossigeno non è fondamentale per la crescita ma crescono meglio in presenza di O 2
- Microaerofili, richiedono ossigeno a basse concentrazioni, interessanti dal punto di vista evolutivo,
vivono a concentrazioni di ossigeno del 10% invece che del 20%, non crescono se hanno
concentrazione maggiore di ossigeno. ci indica che possono essere i primi aerobi che si sono
formati quando ancora non c’era nell’atmosfera primitiva un’alta concentrazione di ossigeno. si
trovano in ambiente naturale, in ambiente marino l’ossigeno non si scioglie bene, basse
concentrazioni di ossigeno si possono trovare già al di sotto del pelo d’acqua, alcuni sono patogeni
 e vivono all’interno di altri organismi. Si possono isolare solo se incubati a basse concentrazioni di
ossigeno. esistono dispositivi che fanno si che l’ossigeno venga mantenuto basso nell’ambiente di
incubazione.

Ci sono anaerobi che possono essere:

- Aerotolleranti, non richiedono ossigeno e non risentono della sua presenza

- Obbligati, l’ossigeno è tossico, vive in assenza totale di ossigeno

In laboratorio, la crescita all’interno di tubi ci può fare vedere a quale delle classi sopracitate appartengono
i vari microrganismi.

- (a) in questo caso abbiamo microrganismi aerobi obbligati che

hanno bisogno dell’ossigeno per sopravvivere; infatti, stanno in
prossimità della superficie
- (b) in questo caso abbiamo microrganismi anaerobi obbligati,
stanno sul fondo del tubo per non entrare in contatto con l’aria
- (c) in questo tubo abbiamo microrganismi aerobi facoltativi,
non richiedono ossigeno per crescere ma crescono meglio
quando sono in presenza di ossigeno; infatti, abbiamo alta
concentrazione di microrganismi nella parte superiore del tubo
- (d) microaerofili, richiedono ossigeno a basse concentrazioni, si
trovano poco sotto la superficie.
- (e) aerotolleranti, organismi che non richiedono ossigeno e non
risentono della sua presenza, distribuiti omogeneamente nel
terreno di coltura liquido

L’ossigeno ha questo effetto tossico dovuto al perossido, al superossido, al radicale ossidrile, la

presenza di enzimi neutralizza questi radicali, forme tossiche dell’ossigeno.

Test per evidenziare la catalisi

La catalasi è un enzima prodotto dai microrganismi che neutralizza le forme tossiche di ossigeno. il test
consiste nell’inoculo viene miscelato in una soluzione con perossido di idrogeno al 3%, se produce bolle
vuol dire che possiede l’enzima catalasi e quindi il microrganismo è aerobio, se non produce bolle vuol
dire che il microrganismo è anaerobio
 Crescita di microrganismi aerobi

Si possono far crescere con aerazione forzata o agitazione del terreno

per facilitare gli scambi gassosi.

Crescita di microrganismi anaerobi

Si deve escludere l’ossigeno dall’ambiente o dal terreno. Per farlo bisogna aggiungere agenti riducenti,
colture bimicrobiche (un forte aerobio e l’organismo anaerobio). Si possono inoltre utilizzare dei
contenitori sigillati come giare per anaerobiosi. Tutti gli anaerobi stretti non hanno gli enzimi
superossido dismutasi e catalisi. Devono essere coltivati senza ossigeno. sistema anaerobico Gaspak.

Camera per incubazione

Giara per anaerobiosi

Un altro fattore di crescita è quello della pressione

Pressione idrostatica, esistono due tipi di microrganismi:

- Barotolleranti, crescono a pressioni comprese tra 1 e 400 atm

- Barofili, crescono solo a pressioni elevate

La pressione dipende dal tipo di fonte di carbonio utilizzata dal microrganismo

Piruvato 200atm

Ribosio 450 atm

glucosio550 atm

la crescita di questi microrganismi in laboratorio può avvenire in camere pressurizzate. Gli archea
riescono a crescere meglio aumentando la profondità, invece solo pochi bacteria riescono a crescere a
pressioni elevate

BIOFILM

La maggior parte dei microrganismi cresce adesa a superfici (organismi sessili), piuttosto che essere
fluttuante (planctonica). I microbi adesi alle superfici fanno parte di comunità complesse e sono chiusi da
una sostanza mucillaginosa chiamata biofilm. Il biofilm si forma quando i microbi aderiscono ad una
superficie e rilasciano polisaccaridi, proteine e DNA per formare la sostanza polimerica extracellulare (EPS).
Un biofilm maturo è una comunità complessa e dinamica di microrganismi, si verificano delle iterazioni tra i
microrganismi adesi, avvengono infatti scambi metabolici, di DNA, assorbimento e comunicazione. La
produzione di EPS causa un cambiamento fisiologico nei microrganismi e vengono protetti da raggi UV,
luce, antimicrobici e antibiotici. Quando si formano biofilm su dispositivi medici causano infezioni ricorrenti,
anche perché il distacco dei microrganismi dal biofilm causa la contaminazione della fase acquosa.
Le cellule del biofilm comunicano tra di loro attraverso un metodo chiamato quorum sensing (QS) è un
metodo che dipende dalla densità cellulare. Le cellule all’interno del biofilm producono proteine man mano
che si replicano e l’aumento della concentrazione di queste proteine rende i microrganismi competenti,
possono quindi assorbire DNA esogeno (processo di trasformazione) e vengono rilasciate batteriocine
(sostanze che uccidono specie batteriche filogeneticamente vicine).

L’acilomoserina lattone (AHL) è una molecola autoinduttrice prodotta da gram negativi, si diffonde
attraverso la membrana plasmatica ed una volta all’interno della cellula induce l’espressione di geni
bersaglio che regolano una varietà di funzioni.