Metodi di misurazione della crescita microbica

La curva di crescita si realizza misurando il numero di cellule coltivabili vitali e la massa cellulare.

Determinazione del numero di cellule, risaliamo al numero di cellule presenti nel campione (possiamo
naturalmente considerare il numero di cellule totali del campione oppure considerare quelle vive, ogni
cellula messa nel terreno di coltura, moltiplicandosi, forma una colonia, dal numero di colonie,
considerando che sono state generate da una cellula, possiamo determinare il numero di CFU/mL di un
campione.

Determinazione della massa, non si determinano le unità, è una determinazione imprecisa delle unità che
formano la massa, possiamo farlo solo in determinati momenti della crescita batterica.

Abbiamo diversi metodi di coltivazione o diversi metodi applicati alla conta (ad esempio nella conta in
piastra facciamo un’analisi statistica).

Strumenti per la conta.

Possiamo avere diversi strumenti elettronici per la determinazione del numero di cellule e sono metodi che
prescindono dalla coltivazione, possiamo avere metodi con strumenti elettronici o per conta diretta:

strumenti elettronici. Tutti e due questi sistemi si avvolgono di un sistema di capillari di dimensioni poco
superiori a quelle cellulari in modo da far passate una cellula per volta per poterle contare.

- Per il contatore Coulter scegliamo un

capillare con dimensioni leggermente
più grandi delle cellule che devono
essere contate in modo che le cellule
passino singolarmente attraverso il
capillare (in questo modo non
tratteremo la massa ma le singole
cellule). bisogna inoltre diluire il
campione in modo ottimale per
distanziare le cellule tra di loro. Il
conto del numero di cellule della
sospensione può avvenire per
semplice contatto elettrico, in questo
caso il contatore registra
l’interruzione del fascio di luce. il campione deve essere costituito solo da solvente e le cellule di
interesse, altrimenti le impurità verrebbero considerate come cellule. sfrutta l’interruzione
dell’energia elettrica che viene registrata dal fotodiodo.
- Citometria a flusso utilizza un fascio di luce laser per la rilevazione, il conteggio, la caratterizzazione
e, utilizzando strumenti avanzati, la separazione di cellule in sospensione. La citometria a flusso si
avvale dell'impiego di uno strumento, il citometro a flusso che è in grado di misurare
contemporaneamente alcuni parametri morfologici derivanti dall'attraversamento di singole cellule
da parte di un fascio di luce laser. Lo strumento è detto a flusso perché le cellule fluiscono
velocemente e singolarmente attraverso il raggio di luce che le colpisce, fluiscono attraverso un
sistema di capillari. Si possono applicare fluorocromi per distinguere cellule vive da quelle morte.
Ioduro di propidio, in verde le cellule vive ed in rosso quelle morte.

Conte dirette
- Metodo di Breed con malto rapido (volume noto in 1 cm 2 del vetrino), serve ad esempio nelle
industrie casearie per valutare rapidamente la qualità del latte.

- Conta in camera Petroff-Hausser con o senza coloranti, camera che possiede un ponte centrale che
si presenta come una griglia, la griglia è costituita da vetrini porta oggetto più spessi, con quadrati
uguali o di dimensioni diverse. L’altezza della camera ci da la terza dimensione, bisogna leggere più
campi per diminuire l’errore. Non ci permette di distinguere cellule morte dalle vive

- Conta di microcolonie su vetrino con agar dopo un breve periodo di incubazione. Un’aliquota viene
appoggiata su un terreno nutritivo e si aspetta la crescita della colonia. Nella conta vitale contiamo
le colonie cresciute.
 - Conta diretta mediante membrane filtranti e osservazione al microscopio ad epifluorescenza
(organismi autofluorescenti o a previa colorazione con coloranti fluorescenti). Si filtra un volume
noto di liquido o di aria con il sistema di membrane filtranti e si aggiunge il colorante a fluorescenza
per la conta delle cellule. Con il microscopio a fluorescenza si contano direttamente le cellule
raccolte da un sistema di membrane filtranti, però possono richiedere di essere colorate. C’è una
parte superiore (liquido da filtrare) ed una parte inferiore (liquido filtrato); in genere si usano
membrane di
dimensioni di 0,22
micrometri per i
batteri (conteggio
diretto, coltura in
piastra e
sbatterizzazione dove
vengono trattenuti i
batteri ma non i
virus). Il numero delle
cellule viene
evidenziato diluendo
il campione ed
evidenziandone le
cellule con
fluorocromi, diluiamo in passaggi successivi nelle provette, tagliamo la membrana in cui sono
trattenuti i batteri in pezzettini e osserviamo il pezzettino al microscopio. Il sistema di filtrazione ha
dimensioni standard, è sterile e monouso, si usa per contare le colonie o il numero di cellule, le
colonie vengono isolate ed in questo modo possiamo risalire al numero di cellule del filtrato.
Questa è una conta totale, per sapere il numero di cellule vive andremo a piastrare su un apposito
terreno di coltura quello che è stato filtrato.

- Tecnica FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)

Conta in piastra (o conta vitale), due metodi (piastramento per inclusione o piastramento in superficie)

- Piastramento per inclusione, un volume noto di una coltura è pipettato in una capsula Petri sterile
vuota, successivamente viene aggiunto terreno agarizzato fuso ad una temperatura superiore a
 quella dello stato di gel (intorno ai 50°), viene mescolato con delicatezza il tutto per renderlo
omogeneo e viene lasciato solidificare per poi essere incubato.
- Piastramento in superficie, un piccolo volume 0,1 mL di una coltura opportunamente diluita viene
distribuito sulla superficie del terreno agarizzato usando una spatola di vetro sterile.

Per la conta in piastra utilizziamo diluizioni opportune in modo che le cellule del campione siano separate
tra loro in modo che le colonie siano distinguibili. Le diluizioni decimali sono molto importanti (CFU 30-300
per batteri e 10-100 per i funghi). Per organismi anaerobi non possiamo usare piastre, si crea un terreno
agarizzato, vengono fatte le opportune diluizioni del campione, si agita rapidamente la sospensione
inoculata e si congela rapidamente, in modo tale da contare le colonie e per sicurezza si aggiunge paraffina
che solidifica e forma di tappo nella provetta per non fare entrare aria e ossigeno.

Diluizioni torbide, sono le prime e presentano grandi quantità di microrganismi, in genere si mette una sigla
N.C. che sta ad indicare che non sono contabili.

Diluizioni limpide, sono sterili, pochissimi microrganismi se non assenti

La torbidità viene convertita attraverso le diluizioni, in genere le prime due diluizioni danno troppe colonie
batteriche, si può iniziare a piastrare dalla terza diluizione in poi. Il numero di cellule che otteniamo lo
possiamo vedere nella tavola statistica di MacGrady, tecnica MPN da una sospensione batterica si
allestiscono diluizioni decimali in serie, da ciascuna di queste si preleva un mL e si inocula in un terreno
nutritivo liquido di 9mL, per ciascuna diluizione si fanno almeno due repliche, si osserva l’avvenuta crescita
nelle varie diluizioni
Determinazione della massa, è un metodo non preciso ma abbastanza affidabile, possiamo ottenere la
formazione di colonie che ci dicono che la curva di crescita sta andando in una direzione.

Metodi diretti. Contiamo direttamente la biomassa (peso umido e peso secco), le centrifughe separano il
surnatante dal pellet. Dopo trattamento in centrifuga avremo il pellet ed il surnatante, per ottenere il peso
secco serve estrarre il pellet tramite o filtrazione o estrazione diretta. Il pellet è messo in una stufa e
aspettiamo che raggiunga un peso costante (senz’acqua in quanto il calore della stufa è un calore secco che
arriva a 160° o 180°). Il peso secco si può ottenere per filtrazione, otteniamo una determinazione che viene
comparata con altre determinazioni. Si può anche determinare la misurazione di un costituente cellulare.
Dopo trattamento con stufa avremo il peso secco che sarà circa il 20-25% del peso umido.

Metodi indiretti, densità cellulare (nefelometria e turbidometria), metodo che prevede l’uso di uno
spettrofotometro, che usa diverse lunghezze d’onde della luce per eliminare eventuali interferenze nel
terreno.

Nefelometria= valuta la quantità di luce riflessa

Turbidometria= valuta la quantità di luce trasmessa

Trasmittanza ed assorbanza, trasmittanza è direttamente proporzionale al numero al numero di cellule, una

soluzione troppo ricca non viene letta bene dallo spettrofotometro, dobbiamo diluirla. La densità ottica
(O.D.) va misurata all’istante.
Spettrofotometro, misura la torbidità. La fotocellula misura la luce trasmessa, quella che non viene dispersa
dalle cellule in sospensione e fornisce una lettura della densità ottica.

Fattori ambientali e effetti sulla crescita

Soluzioni tampone, mantengono costante il pH. Questo perché soprattutto le proteine sono suscettibili a
condizioni di pH alterate, il pH va ad influire sulla struttura avvolta della proteina e influenza la sua
funzionalità, soprattutto delle proteine enzimatiche. Questo non vale solo per il pH ma ad esempio vale
anche per la temperatura.

Noi viviamo in ambienti moderati come la maggior parte dei microrganismi. Ci sono però altri organismi che
vivono in ambienti non idonei all’uomo o non adatti per altri microrganismi, questi sono estremofili. Altri
microrganismi si sono invece adattati ad ambienti estremi e sono estremotolleranti. Non esiste in natura un
ambiente sterile in quanto tutti gli ambienti sono colonizzati da organismi, anche quelli più estremi.

Range di tolleranza, intervallo preciso che ha un minimo ed un massimo.

pH fattor determinante per la crescita di microrganismi

- Acidofili, pH tra 0 e 5.5

- Neutrofili, pH tra 5,5 e 8.5
- Basofili, pH tra 8.5 e 11.5

Non ci sono organismi in grado di vivere in ambienti dove il pH >12, probabilmente a causa del pH
ambientale. Il citoplasma ha un pH di circa 7, i microrganismi fanno di tutto per mantenere questo pH e
gestire così il proprio metabolismo energetico, un esempio sono le pompe protoniche, proteine che
resistono a shock termici.
Un microrganismo può anche modificare l’ambiente circostante, un esempio è la crescita di un
microrganismo in una roccia calcarea (sciolgono CaCO2 e producono CO2 e H2O), creando un ambiente
autotamponante. La regolazione del pH può avvenire anche attraverso il sistema dell’ATPasi,