Crescita microbica e metodi di

determinazione del numero di

cellule

La crescita microbica

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La crescita microbica

22

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24

2n

Progressione geometrica in base 2

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La crescita microbica
Tempo di
duplicazione
= 30 min
Crescita
esponenziale

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La crescita microbica
! NUMERO DI GENERAZIONI
! N0: n di batteri inoculati nel terreno nellistante iniziale
! N: n di batteri al termine di un dato intervallo di tempo t
! n: n di generazioni

N = N0 . 2n
logN = logN0 + nlog2
n = log N - logN0
log2

log2=0.301

n = 3.3 (log N - logN0)

n = 3.3 log N
N0

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La crescita microbica
! TEMPO DI GENERAZIONE
! Corrisponde al tempo necessario per la duplicazione
cellulare
! Si pu calcolare dividendo il tempo per passare da N0 a N
per il n di generazioni

tgen = t/n = t/3.3log(N/N0)

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Curva di crescita

Figura 6.8

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Curva di crescita
! Fase di latenza o fase lag
La durata di questo periodo molto variabile e dipende da molti fattori quali 1) la
composizione del terreno colturale di partenza e quella del terreno in cui vengono
seminate. Infatti se cambia la fonte di carbonio la cellula dovr sintetizzare gli enzimi
necessari per metabolizzare i nuovi composti. 2) Temperatura. 3) Et della coltura
seminata. 4) Numero delle cellule seminate

! Fase logaritmica o esponenziale

In questa fase tutte le cellule si riproducono con un tempo di generazione costante
determinato sia dalle caratteristiche genetiche del microrganismo sia da fattori
ambientali

! Fase stazionaria
Le cellule non sono pi in grado di riprodursi. Ci pu essere dovuto a 1)
esaurimento di uno dei componenti del terreno (fattore limitante), 2) accumulo di
prodotti del metabolismo tossici, 3) raggiungimento del numero di cellule massimo

! Fase di mortalit
Il numero delle cellule vitali diminuisce geometricamente in un processo inverso alla
crescita.
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Metodi di determinazione del numero di

cellule
! METODI INDIRETTI
! Misura della quantit di azoto proteico: i batteri contengono circa il 14%di
azoto in peso secco. Per utilizzare questa tecnica si devono raccogliere le cellule,
liberarle dal terreno di coltura ed eseguire unanalisi chimica
! Centrifugazione e valutazione del volume
! Determinazione del peso secco
! Determinazione di un metabolita (es. acido lattico per i lattobacilli)
! Torbidit della coltura: diffusione della luce dovuta allalto indice di rifrazione
dei batteri

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Metodi di determinazione del numero di

cellule

Lassorbanza (A) definita come il logaritmo del rapporto tra lintensit che colpisce la
sospensione (I0) e quella trasmessa attraverso la sospensione
A=log I0/I

Figura 6.12

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Figura 6.12

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Metodi di determinazione del numero di

cellule
Petroff-Hausser

Figura 6.9
! METODI DIRETTI
!

Camere di conta: vetrini da microscopio recanti una quadrettatura e costruiti in modo

che sia noto lo spessore di liquido che viene introdotto tra il vetrino ed il suo
coprioggetto (camera di Thoma, camera di Petroff-Hausser). I limiti di questa tecnica
sono: 1) incapacit di distinguere le cellule vive dalle cellule morte 2) concentrazione
cellulare di almeno 106 cellule/ml

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Metodi di determinazione del numero di

cellule
! METODI DIRETTI :
!

Coulter counter: la sospensione microbica viene forzata attraverso un piccolo foro

(circa 30 micrometri). Un flusso di corrente elettrica viene fatta passare attraverso il
foro, mentre gli elettrodi posti ai lati dellorifizio misurano la resistenza elettrica.
Ogni volta che un microrganismo transita nellorifizio, si registra un aumento della
resistenza elettrica (caduta di conducibilit) e viene contata. Si pu quindi registrare
sia il numero dei componenti di una popolazione microbica che la distribuzione delle
dimensioni cellulari. Viene utilizzato soprattutto per la conta di cellule piuttosto
grosse ed molto sensibile alla presenza di particelle inerti (polvere).
Anche in questo caso non si possono distinguere le cellule vive dalle cellule morte.

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Metodi di determinazione del numero di

cellule

! METODI DIRETTI :
! Tecnica di conteggio su piastra: i risultati ottenuti con questa
tecnica vengono espressi in termini di unit formanti colonia (CFU)

Figura 6.10

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Metodi di determinazione del numero di

cellule: IMP. DILUIZIONI SERIALI

Figura 6.11

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! METODI DIRETTI :
!

Conta di colonie su membrane filtranti: questo metodo si utilizza quando si

devono saggiare grandi volumi con una carica microbica bassa.
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Metodi di determinazione del numero di

cellule

! METODI DIRETTI :
! Time lapse: Cellule di una sospensione diluita, sono state depositate
su un sottile strato di terreno YPD colato su un vetrino e ne stata
seguita la crescita al microscopio per 24 ore .
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Quale terreno usare?

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Effetto della concentrazione di

nutrienti sulla velocit di crescita

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Accrescimento sincrono
! Durante la fase di crescita le cellule non sono tutte uniformi, ne come
dimensioni, ne come momento del loro metabolismo.
! Per studiare laccrescimento si dovrebbe seguire il destino di una singola
cellula. Ci non possibile, ma invece possibile sincronizzare una
coltura.
! Esistono molti modi di sincronizzare una coltura; in ogni caso la
sincronia dura solo per qualche generazione.
! Es

Taglia cellulare (elutriatore o filtrazione)

uso di mutanti di ciclo cellulare termosensibili
uso di temperature subottimali
uso di composti che inibiscono la progressione del ciclo cellulare (es.: nocodazolo, !factor)

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Crescita sincrona delle cellule in

coltura

! Coltura sincrona: coltura in cui ciascuna cellula nelle stesso grado di

divisione.
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Crescita bilanciata e crescita

sbilanciata
! La crescita esponenziale un tipo di crescita bilanciata in quanto tutti i
costituenti cellulari vengono prodotti a velocit costante.
! La crescita sbilanciata si ha invece quando la sintesi dei vari costituenti
cellulari avviene a velocit diversa.
Es. shift up
una coltura batterica viene trasferita da un terreno povero di nutrienti ad un terreno
pi ricco. In questo caso le cellule producono pi ribosomi per incrementare la sintesi
proteica quindi si ha un aumento della sintesi di proteine e del DNA.
Es. shift down
una popolazione batterica viene trasferita da un terreno ricco ad un terreno povero di
nutrienti. A questo punto necessaria lattivazione delle vie biosintetiche

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Efficienza della crescita: rese di crescita

!
!
!
!
!
!
!
!

!
!

Efficienza della crescita: efficienza di un microrganismo nel convertire un

substrato in massa cellulare
Resa di crescita:
rappresenta lindice dell efficienza della conversione dei nutrienti in materiale
cellulare
ysub= massa dei microrganismi formati/massa del substrato consumato
xmax = massa cellulare ottenuta
x0 = peso delle cellule allinoculo
ysub= xmax - x0 / moli di substrato utilizzate
La resa di crescita viene spesso espressa in termini di grammi di cellule per
grammo di substrato oppure grammi di cellule per mole di substrato (crescita
molare).
In terreni arricchiti i microrganismi usano la fermentazione dei carboidrati solo
come fonte di energia, mentre il materiale di base necessario ai processi biosintetici
deriva da altre componenti del terreno. Lefficienza di utilizzazione di ATP
durante la fermentazione espressa come YATP
YATP = grammi di cellule formate/numero di moli prodotte
Questo valore abbastanza costante in tutti i microrganismi (circa 10grammi/mole
di ATP)
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Questa costanza non si riscontra in termini di resa in cellule

per mole di substrato fermentato in quanto i diversi
microrganismi possono fermentare un substrato utilizzando
vie metaboliche che differiscono per la resa di ATP
Resa di crescita di batteri che utilizzano il glucosio come fonte di energia
METABOLISMO

Mole ATP/
Ymax (grammi
Mole glucosio cellule/mole
glucosio

YATP (grammi
cellule/mole
ATP

Saccharomyces Fermentazione
alcolica via
cerevisiae

21

10,5

Lactobacillus
delbrueckii

21

10,5

20

10

Enterococcus
faecalis
Zymomonas
mobilis

Embden-Meyerhof
Fermentazione
omolattica via
Embden-Meyerhof
Fermentazione
omolattica via
Embden-Meyerhof
Fermentazione
alcolica via
Entner-Doudoroff

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Colture in batch o continue

! Colture in batch: beuta
! Colture continue: chemostato
! Se il terreno utilizzato possiede un nutriente essenziale in
quantit limitante, il tasso di crescita sar funzione della
velocit di flusso del terreno.
! D = f/V
! D :Velocit di scambio (velocit di diluizione)
! f: velocit di flusso del terreno (ml/ora)
! V:volume del terreno contenuto nel recipiente (ml)
! Esempio
! f = 30ml/ora, V = 100ml
! D = 0.3/ora
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Coltura continua in un chemostato

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Raggiungimento dello stato di equilibrio

! Nel chemostato la coltura influenzata dalla concentrazione
del substrato. Allaumentare della concentrazione del
nutriente limitante, e con la velocit di diluizione che
rimane costante, anche la concentrazione delle cellule
aumenter, mentre la velocit di crescita rimarr invariata.
! Quando la concentrazione complessiva delle cellule e il
rifornimento dei nutrienti sono bilanciati ed hanno
raggiunto lequilibrio, allora il sistema ha raggiunto lo
steady state (stato di equilibrio).

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Relazione tra la concentrazione del nutriente, la velocit di

crescita e la resa di crescita in una coltura batch. Le basse
concentrazioni di nutriente influenzano sia la velocit che la
densit di popolazione

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Relazione nello stato di equilibrio (steady

state) fra la concentrazione del substrato
e lo sviluppo della massa batterica

Con una coltura di 1000 ml ed una velocit di flusso di 500ml/h si ottiene una velocit di
diluizione di 0,5/h
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Relazione nello stato di equilibrio (steady

state) fra la concentrazione del substrato
e lo sviluppo della massa batterica

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