PARTE 1

Contaglobuli
Il contaglobuli è un dispositivo medico usato in ambito di
laboratorio clinico per effettuare, come dice il nome, un
conteggio degli elementi corpuscolari del sangue

L’esame emocromocitometrico o emocromo (EE) è uno degli

esami maggiormente richiesti. Esso si suddivide in analisi
quantitativa, di conteggio (num. componenti solidi) e
determinazione (solido/liquido), oltreché un'analisi qualitativa o
morfologica della componente solida. Queste vanno a
determinare i seguenti parametri:

- il numero delle cellule sanguigne

- la formula leucocitaria (% dei 3 tipi di globuli bianchi)

- la concentrazione dell'emoglobina

- l'ematocrito (volume dei globuli rossi in 100mL

- l'analisi delle caratteristiche fisiche delle cellule sanguigne,

come forma e dimensioni.

Per indicare le varie misure effettuate si utilizza sigle: MCV

(dimensione media globuli rossi), MCH (quantita media di
emoglobina nel globulo rosso), MCHC ( [emoglobina in globulo
rosso] ), MPV (dimensioni medie di una piastrina)

METODO DI ANALISI
Il sangue intero viene prelevato dalla provetta e suddiviso in
varie provette in base allo studio da effettuare che è diverso a
seconda della camera usata.

METODO DI ANALISI AUTOMATICO

Il sangue intero viene prelevato dalla provetta e viene trattato e

diluito, prima di essere inserito in un contaglobuli che sfrutta il
principio impedenziometrico. I principali vantaggi sono l'alta
precisione e velocità, oltre alla diminuzione dei costi ed il tempo
di operabilità.

FUNZIONAMENTO DEL CONTA GLOBULI

Il sangue o soluto (cattivo conduttore elettrico), viene diluito in

un solvente (ottimo conduttore elettrico) ed inserito nella
camera di conta, a carica negativa. Immerso in essa si trova
un capillare, a carica positiva. Tra la camera di conta ed il
capillare viene generata una differenza di potenziale o d.d.p.
che genera il flusso. Nel capillare è presente un'apertura
attraverso cui possono passare le cellule, il cui passaggio
genera una variazione di corrente proporzionale alla
dimensione della cellula stessa e considerando che la tensione
d.d.p. è costante, si può determinare il tipo di cellula.

SUNTO

Nell'apertura è presente un campo magnetico E, che al

passaggio di una cellula varia generando un impulso con
ampiezza proporzionale alla grandezza della cellula.

L'analisi dell'ampiezza dell'impulso permette di determinare

grandezza e numero di determinate cellule.

L'analisi volumetrica dei segnali permette la creazione di un

grafico piramidale delle popolazioni di cellule sanguigne.
CONTEGGIO DELL’EMOGLOBINA

Il campione di sangue diluito viene trattato con un apposito

diluito che causa la lisi (distruzione) degli eritrociti (globuli
rossi). Tutti gli impulsi registrati con volumi superiori a 35fl sono
considerati leucociti (globuli bianchi). Tutte le registrazioni
inferiori a 35 fl sono considerate piastrine o resti di eritrociti.

TECNOLOGIA VCS (Volume Conduttività Scatter di luce

laser):

- il volume cellulare è misurato con il principio

impedenziometrico

- la conducibilità è il rapporto di densità del nucleo rispetto al

citoplasma

- lo scatter di luce laser identifica i granulociti

Tante più strutture ha una cellula, tanto minore sarà l’elettro

conduttività della cellula, di cui solo il nucleo è un ottimo
conduttore.

L’insieme delle precedenti conoscenze permette la distinzione

tra linfociti e granulociti (linfociti che nel plasma presentano
grossi granuli)

Vantaggi: si ha un conteggio diretto di tutti i leucociti e la

relativa suddivisione in classi (cluster), mantenendo l'integrità
biologica. Le varie popolazioni vengono accuratamente
separate, sul monitor, tramite AccuGate.
PARTE 2
Si riprende i concetti base di funzionamento del conta globuli precedentemente
descritti.

Si introducono due elettrodi che generano un campo magnetico nell’orifizio del

capillare di conta e due elettrodi di misura della variazione d’impedenza.

Per avere una lettura perfetta sarebbe necessario fare un orifizio della stess
apertura del volume dei globuli rossi, motivo per cui si scende a compromessi.

SOVRAPPOSIZIONI ORIZZONTALI

Talvolta ci possono essere delle sovrapposizioni di due o più cellule

nell’orifizio, per cui si considera la coincidenza orizzontale e verticale assieme
alla non identificazione. Se le due cellule sono di dimensioni differenti sarà
possibile distinguerle nel grafico (sommatoria a 2 picchi di altezze diverse),
mentre due cellule di pari dimensioni generano una sommatoria a 2 picchi di
altezze uguali, a forma di M.

SOVRAPPOSIZIONI VERTICALI

Sono costituite dalla somma delle ampiezze di due impulsi derivanti da due
cellule sovrapposte. (segnale a V contraria, no M)

NON IDENTIFICAZIONE

è una sovrapposizione verticale in cui ci sono due ampiezze, una grande ed una
piccola, che non sono distinguibili tra loro

NON IDENTIFICAZIONE AD M

è dovuta da una singola cellula, di piccolissime dimensioni, passante sui bordi

dell’orifizio che va a generare un impulso ad M., ciò avviene poiché la cellula
ha un elevata densità rispetto a tutto il resto dell’area dell’orifizio.
FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA

è una tecnica che consiste nello far scorrere un diluente sui bordi del orifizio
capillare ed iniettare le cellule al centro per evitare sovrapposizioni. Questa
tecnica impedisce il ricircolo ( vortici ) delle cellule contate o un loro eventuale
accumulo.

METODO RF/DC

Il metodo capacitivo è identico a quello resistivo, con la differenza che la

corrente usata è ad alta frequenza e l’impulso segnale è una variazione
capacitiva.

Se nel metodo resistivo l’ampiezza dell’impulso dipende solo dal volume

cellulare, nel metodo capacitivo l’ampiezza dell’impulso dipende dal volume e
dal contenuto cellulare.

Dunque il metodo resistivo + capacitivo permette di ottenere un numero

maggiore di informazioni, anche morfologiche.

Era costoso fabbricare e mantenere in efficienza i macchinari di questo genere

per cui ebbero vita breve.

METODO OTTICO – SCATTERING

Questa tecnologia è basata sull’analisi ottica, dove una luce viene puntata su un
oggetto, il quale assorbe un determinato range di frequenze, ciò genera calore, e
ne devia (scattering) l’altra parte variando la lunghezza d’onda.

Ogni tipologia di leucociti riflette la luce in modo proprio, rendendo

distinguibili le varie famiglie.

Per aumentare l’efficacia dello scattering e l’identificazione morfologica di

leucociti ed eritrociti è possibile utilizzare specifici coloranti fluorescenti. Parte
della luce emessa viene trasformata in calore dalle cellule colorate, mentre la
restante parte viene re_irradiata con una lunghezza d’onda diversa
In questa tecnologia sono impiegati due sensori:

1) il sensore posto tra l’emittente di luce e le cellule da analizzare è in grado di

identificare le caratteristiche della cellula tramite la differenza di luminosità
dovuta all’ assorbanza ed dallo scattering (lunghezza d’onda variabile).

2) il sensore è posto con un angolo differente rispetto alla luce incidente ed

identifica le caratteristiche della cellula interpretando l’intensificazione
luminosa.

La cellula è studiata in base a:

- angolo piccolo sul sensore coassiale del raggio (forward scatter) identifica il
volume cellulare e l’eventuale presenza di granuli, di cui ne determina le
dimensioni.

Il forward scatter è costituito da piccole celle su una struttura lineare o curva. Le

cellule centrali identificano le dimensioni effettive della cellula, mentre quelle
più esterne identificano uno scatter ad angoli elevati che suggeriscono la
presenza di strutture interne alla cellula di grandi dimensioni. (Min. è la
granulazione interna alla cellula, magg. è la dimensione dei granuli); Bassissimo
rapporto SNR; Il segnale generato dal sensore viene digitalizzato, amplificato
ed elaborato ai fini di fornire informazioni utili all’operatore.

- angolo grande (side scatter) è determinato dal materiale dell’interno della

cellula;

Problemi del metodo ottico sono riconducibili alla necessità di un fascio

luminoso perfettamente allineato e collimato, motivo per cui si usa il laser, il
quale però è limitato in lunghezza d’onda ed ad un tempo di utilizzo breve
(evitare surriscaldamento).

Per evitare letture errate, causa sovrapposizione cellulare, è necessario utilizzare

un flusso focalizzato. Si riprende i concetti precedentemente descritti, ma
aggiungendo che la pressione (velocità) del flusso interno dev’essere maggiore
di quello esterno.
Per massimizzare l’efficienza dei contaglobuli si è andato ad integrare il metodo
ottico con quello resistivo.

Nei moderni sistemi di analisi dell’emocromo si utilizza il VCS (volume

conductivity scattering), precedentemente descritto, il quale combina in
un'analisi simultanea di impedenziometria a bassa frequenza (DC), conduttività
di radio frequenze (2RF) & scattering di luce laser.

Da qui si ottiene informazioni riguardante il volume cellulare, la conduttività

ottenuta applicando una i HF alla cellula e studiandone la conduttività e lo
scatter sfruttando una luce laser monocromatica He o Ne, il quale permette di
determinare la granularità e l’integrità del nucleo.

Da qui è possibile rappresentare graficamente la distribuzione delle famiglie

leucocitarie in 3D tramite lo scatterplot. L’opacità identifica la conducibilità
cellulare.

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-------------Riassunto

Il sangue opportunamente diluito con un apposito diluente è contenuto in una

camera, che tramite un foro portacapillare, sul quale è presente un foro calibrato
con un rubino, porta la soluzione al sistema di conta globuli. Il sistema di conta
è costituito da due elettrodi, uno esterno ed uno interno che generano un campo
elettrico costante e ne misurano le eventuali variazioni dovute l passaggio di
cellule.

La soluzione che dev’essere usata per la misura dei leucociti viene trattata con
lisante per eliminare gli eritrociti.

Procedura d’aspirazione e diluizione:

1) l’ago aspira il campione da analizzare e subito dopo aspira il diluente;

2) l’ago inietta la soluzione nel miscelatore;

3) l’ago viene sciacquato ed asciugato per ripetere la procedura.

APPUNTI PER ESAME

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CONTAGLOBULI funzionamento & struttura

Metodo impedenziometrico R info. dimensioni

Metodo capacitivo ® info. dimensioni + contenuto granuli

VCS (volume, conducibilità, scattering)

Volume impedenziometria

conducibilità con capacitivo (nucleo conduce + del citoplasma)

scattering (misura differenza di luce post assorbanza

& intensificazione luminosa

SCATTERING (metodo ottico)

con laser (fascio collimato)

misura in detector multistrato

- angolo piccolo det. V & granuli

- angolo grande det. materiale interno