Divisione cellulare e sistemi di riproduzione, controllo microbico.

Come viene mantenuta la specie? la specie viene mantenuta con le strategie di riproduzione, quando
intendiamo la riproduzione in ambito di microrganismi si parla di crescita microbica, ci sono diverse
strategie di riproduzione, nel mondo degli eucarioti possiamo avere una riproduzione sessuata o asessuata,
il corredo può essere aploide o diploide. I batteri hanno un corredo genetico solo aploide, la riproduzione è
asessuata e la maggior parte dei microrganismi si divide per scissione binaria, si passa da una cellula madre
a due cellule figlie ma ci sono anche modelli in cui la riproduzione avviene per gemmazione, rottura del
filamento, come per la formazione delle artrospore negli streptomiceti, creazione all’interno della cellula di
tante cellule divise in corrispondenza di un setto di divisione, la modalità di riproduzione più comune è la
scissione binaria. In qualunque tipo di meccanismo di replicazione avviene prima un evento di replicazione
e sequenziamento del genoma batterico, prima si replica, si allontanano le due repliche del DNA ai poli
della cellula in modo che avviene la formazione del setto di divisione in modo da far avvenire la divisione
fisica tra due cellule figlie.

Crescita batterica, crescita che riguarda la singola cellula, questa va incontro a divisioni cellulari multiple
formando una colonia batterica, andiamo a studiare l’aumento del numero delle cellule della popolazione
batterica. La scissione binaria porta a tante riproduzioni della stessa cellula madre attraverso le generazioni
successive di cellule figlie, una divisione binaria porta ad una crescita esponenziale della popolazione
batterica, c’è un continuo raddoppio di numeri delle cellule considerate, la fine del processo di crescita
esponenziale è dato sia da fattori nutrizionali che ambientali che circondano la popolazione batterica, si ha
una fase di declino con morte cellulare. La crescita può richiedere tempi minimi, 10 minuti solo quando la
cellula attiva il meccanismo di replicazione del DNA con genoma parzialmente replicato e in condizioni di
laboratorio che facilitano questo processo, per replicare un genoma dall’inizio, la cellula ha bisogno almeno
di 20 minuti, quello che si riesce a vedere è il risultato di replicazioni già iniziate, processo estremamente
veloce che avviene in condizioni sperimentali di laboratorio o in tempi molto lunghi. Ci sono delle condizioni
metaboliche necessarie al processo di replicazione. Batteri studiati in condizioni di laboratorio, in natura ci
sono tanti fattori che incidono sulla crescita, in natura avremo condizioni standard o riconducibili.
Esperimento riproducibile, si possono continuare a estrarre fattori utili alle conoscenze della popolazione
microbica. Ci sono diversi tipi di terreni di coltura:

- Terreni definiti, sono preparati aggiungendo all’acqua distillata quantità precisa di composti
organici ed inorganici, contraddistinte da un alto grado di purezza. È nota l’esatta composizione sia
dal punto di vista qualitativo che quantitativo
- Terreni semplici, terreni che utilizzano solo una fonte di carbonio, come il glucosio in E.coli
- Terreni complessi, non si conosce l’esatta composizione del terreno, impiegano derivati della
digestione microbica, animale e vegetale, come estratto di lievito o di carne. Si trovano in
commercio e per essere utilizzati devono essere idratati con acqua distillata.
- Terreni selettivi, permettono la crescita di alcuni microrganismi ma inibiscono la crescita di altri
microrganismi.
- Terreni differenziali, terreno a cui viene aggiunto un indicatore che cambiando colore rivela se è
avvenuta o meno una determinata reazione metabolica durante la crescita. ad esempio batteri
lattici che secernono acido lattico causando un abbassamento del pH
- Colture di arricchimento, necessaria la coltivazione in terreni selettivi, è necessario allestire un
terreno colturale ed un insieme di condizioni di incubazione che risultino selettive per la
coltivazione dell’organismo d’interesse, si riproducono per quanto fedelmente possibile le
condizioni ambientali di una nicchia ecologica, sia risorse nutritive che condizioni ambientali

I terreni possono inoltre essere liquidi, solidi o solidificati. I terreni solidi o solidificati immobilizzano in un
punto le cellule così che si accumulino durante la crescita formando delle colonie. Le colonie microbiche
variano nella forma, nel colore, nel tessuto e nella dimensione a seconda del microrganismo. La morfologia
delle colonie può essere utile per identificare i microrganismi e vedere se una coltura sia pura (solo un
microrganismo), contaminata (si trovano microrganismi indesiderati) o mista (comunità microbica).

Colture a termine, batch colture, stabiliamo i parametri iniziali, non si effettuano

cambiamenti all’interno del recipiente e non inseriamo nessuna modifica, andiamo
a monitorare nel tempo quello che sta accadendo. Ha un inizio ed una fine, si ha
una curva di crescita della popolazione, è un sistema chiuso in quanto non
facciamo nessuna modifica. colture continue, sistemi aperti in cui si possono
effettuare delle modifiche. Il dispositivo che molto spesso si usa per ottenere una
coltura continua è il chemostato (raffigurato qui a fianco). Abbiamo sensori di
torbidità o componenti chimici che ci dicono che una sostanza chimica è stata
esaurita e si deve aggiungere, la torbidità ci dice che la coltura è arrivata ad un
punto critico, aggiungiamo terreno nuovo per far crescere il microrganismo in
maniera indefinita.

L’arricchimento del terreno è un processo mediante il quale si aggiungono sostanze organiche ed

inorganiche per la crescita di particolari microrganismi ed inibire la crescita di altri.

Altro approccio che permette di stabilire i componenti prodotti da organismi sono colture sincrone, quando
si studia una popolazione batterica in ambiente liquido, i processi di duplicazione delle cellule sono
considerati portati come media di tutte le cellule presenti nella popolazione, un organismo può essere in
uno stato in cui ha replicato il DNA e lo sta segregando, uno ha già formato il setto, tutti questi processi di
replicazione avvengono in tempi differenti nella popolazione, si fa una media per stimare il tempo oppure
bisogna sincronizzare la crescita, metodi che sforzano l’omogeneità dei processi di crescita delle cellule,
dura per due o tre generazioni.

Quello che si studia in laboratorio avviene con un procedimento per il quale si ottengono risultati, in base
alle condizioni naturali ci sono fattori che non riusciamo a comprendere appieno, in ambienti naturali
complessi non si possono capire le iterazioni, successioni ecologiche, tutti i microrganismi che troviamo in
una comunità microbica cooperano per la migliore fitness dell’ambiente, sono colture miste, non
rispondono allo stesso modo dell’ambiente naturale quando immesse in un terreno di coltura.

La divisione cellulare consiste in una serie di eventi che porta dalla cellula madre all’ottenimento di due
cellule figlie, questo quando si parla di scissione binaria, l’omogeneità delle
cellule figlie durante la scissione binaria rende le cellule che si accrescono per
scissione binaria delle cellule ottime dal punto di vista della sperimentazione in
quanto si possono controllare i tempi di crescita. La scissione binaria procede per
due eventi fondamentali, replicazione del DNA e citochinesi, grazie alla divisione
cellulare abbiamo una divisione che porta ad un aumento del numero delle
cellule dato da una serie di valori che già abbiamo, un microrganismo posto in
determinate condizioni avrà tempi che si possono già stabilire, tempo di
generazione G (tempo necessario alla cellula per duplicarsi), velocità di crescita
(variazione del numero di cellule per unità di tempo), il numero delle cellule
calcolate si esegue come logaritmo in base 10, quando si fa il grafico della
crescita di popolazione abbiamo una maggiore facilità di conta in un grafico
semilogaritmico in quanto si avrà una crescita lineare, il numero è espresso
come logaritmo e non numero totale, grazie a questo abbiamo una curva
gaussiana con invece di avere una curva all’apice avrà un andamento piatto con
fase stazionaria, è importante avere un grafico semilogaritmico per stimare il
tempo di generazione di una coltura in quanto sappiamo il tempo (t) e il tempo necessario per compiere
una generazione (n), g=t/n.

La riproduzione binaria è un meccanismo di riproduzione, un altro

è la gemmazione, meccanismo secondo il quale da una cellula
madre si generano delle piccole estroflessioni, è una crescita non
simmetrica a differenza della scissione binaria, in questa divisione
emerge una cellula che si separa dalla madre che mantiene
comunque la propria identità ma sarà comunque più piccola della
cellula madre. frammentazione come per la formazione delle
artrospore, si ha una frammentazione dell’ifa miceliale nei setti
che si vengono a creare a scopo riproduttivo. Lo scopo della
divisione è quello di aumentare la chance di sopravvivenza di una
specie. La velocità di divisione è l’aumento del numero di cellule
che si ottengono dai processi di divisione in un determinato arco
di tempo. La divisione può avvenire in maniera uguale come nel
caso della scissione binaria o si possono avere prodotti disuguali,
gemmazione semplice (si forma l’escrescenza e si ha una cellula
più piccola che andrà poi ad aumentare il volume una volta
separata dalla cellula madre), gemmanti da ife (porta alla
formazione di ife, all’apice dell’ifa avviene la gemmazione),
divisione da organismi peduncolati (cellula adesa al substrato tramite un peduncolo e avviene all’apice della
cellula in allungamento e la crescita delle cellule non è
direttamente correlata alla divisione cellulare). differenziamento
cellulare, una parte aderisce ed una parte si stacca dalla
popolazione. Una parte si differenzia per poter aderire al substrato,
streptomyces, organismo filamentoso simile ai miceti, c’è una
disposizione a catena delle cellule, assumono un aspetto allungato,
si formano delle ife aeree che formano un filamento e all’interno
del filamento abbiamo una divisione che può avvenire con la
formazione di artrospore date dal micelio aereo, ha un aspetto
polveroso come i funghi, fanno parte del phylum degli
actinobacteria, ci sono delle caratteristiche simili tra questi batteri,
sono batteri che presentano un pleomorfismo, ovvero durante il
ciclo vitale possono cambiare forma più volte, producono sostanze volatili che fanno odore di terra
bagnata, geosmina, sono inoltre legati alla produzione di antibiotici, come la penicillina. Si pensava che la
penicillina potesse uccidere tutti i batteri poi si è visto che ci furono risposte di difesa da parte dei batteri
alla penicillina e si notarono meccanismi di resistenza alla penicillina (la penicillina non permette la
formazione dei legami peptidici), si scoprirono organismi produttori di antibiotici, degli streptomiceti, uno
degli antibiotici prodotti dagli streptomiceti è la streptomicite, molti streptomiceti furono identificati ma
non pubblicati perché sotto brevetto ai tempi.

Regolazione dell’inizio della replicazione del cromosoma.

Interviene la proteina DNA A che si lega all’oriC (origine di replicazione) e separa i due filamenti di DNA e
avviene anche il caricamento del complesso del replisoma (grande complesso formato dalle proteine di
replicazione che si aggregano per la replicazione del cromosoma). La DnaA per essere attiva si deve legare
all’ATP formando un complesso DnaA-ATP. Per la ripartizione viene usato il sistema Par che suddivide
equamente cromosomi e plasmidi tra le cellule figlie durante la crescita.
Nel momento in cui la cellula ha ripartito il cromosoma batterico, si inizia ad avere la separazione dei setti, il
cromosoma dei batteri è unico (i batteri hanno un solo cromosoma) e circolare, la sua replicazione inizia da
un punto che è l’origine della replicazione OriC e finisce nella zona terminale che dipende dalla fine del ciclo
di replicazione del cromosoma. Vengono coinvolte proteine necessarie alla sintesi del DNA che fanno parte
di un insieme detto divisoma, questo processo può avvenire in entrambe le direzioni del cromosoma
circolare, abbiamo questo ciclo in cui inizia la replicazione, si formano le forcelle di replicazione, ogni
filamento funge da stampo per il filamento complementare e si andrà a duplicare il DNA; si avrà anche
l’allontanamento dei due cromosomi che andranno a portarsi nelle due estremità della cellula stessa, solo
quando è avvenuta completamente questa fase, inizia il processo di separazione fisica delle due cellule
figlie con la formazione del setto di divisione. Nel processo di segregazione, nella separazione fisica
abbiamo il coinvolgimento di proteine del citoscheletro che servono ad allontanare fisicamente il
cromosoma alle due estremità della cellula, MreB omologo dell’actina, e si trovano solo nelle forme
bastoncellari, allontana i cromosomi e regola la morfologia della cellula formando bande filamentose sotto
la membrana plasmatica, nella formazione del setto entra in gioco FtsZ (omologo della tubulina), forma
l’anello Z e questo sito sarà regolato in posizione centrale dalle proteine MinC, MinD e MinE. Min D forma
una struttura a spirale sotto la membrana plasmatica che si estende per tutta la cellula e posiziona Min C
sulla membrana plasmatica, MinD oscilla avanti e indietro lungo la cellula in crescita e non permette la
formazione dell’anello Z dato da FtsZ, MinE oscilla da un polo all’altro spostano MinC e MinD di lato
permettendo la formazione dell’anello di divisione al centro della cellula, garantisce che il divisoma si formi
al centro della cellula e non in posizioni subterminali. DNA extracromosomico, plasmide, contiene
all’interno i geni per la sua replicazione, sintetizza proteine necessarie per la sua replicazione, Par M, Par R
e ParC, la ParM forma dei filamenti lunghi, la parR controlla la divisione del plasmide, la ParC inizia la
divisione degli elementi plasmidiali nel punto di origine. Questo processo si può controllare con fluorocromi
e si vede gli elementi che si formano, il plasmide è per lo più circolare al di fuori del cromosoma batterico, si
divide e via via c’è un elemento che fa si che i due elementi plasmidiali si allontanino nei due comparti della
cellula stessa. Quando abbiamo un episoma, la replicazione del plasmide avviene contestualmente alla
replicazione del cromosoma batterico. Divisione delle due cellule figlie, abbiamo differenti tappe, una è la
formazione dell’anello Z, controllato dalle proteine FtsZ, è strettamente collegato alla membrana
citoplasmatica, poi abbiamo il restringimento dell’anello e la divisione fisica delle cellule. le proteine
MinCDE che controllano la centralità dell’anello, abbiamo altri elementi del citoscheletro che entrano nel
momento in cui c’è la separazione fisica del cromosoma batterico, siccome sono elementi che collegano la
divisione cellulare sono chiamate proteine del divisoma, formato da Fts e ZipA (collega l’anello FtsZ alla
membrana plasmatica).

Le proteine si possono taggare mediante colorazioni fluorescenti, si possono vedere eventi, si possono
legare a proteine ben precise, questi fenomeni si possono vedere ad una tempistica ben precisa, tramite
Palm si può tracciare il movimento della proteina che lega un dato nucleotide all’interno della cellula.

Si deve anche formare il setto, dopo che si forma si deve determinare la forma delle cellule, il
peptidoglicano è quello che determina la morfologia della cellula. La sintesi del peptidoglicano è
fondamentale, la cellula madre forma il setto e le due cellule figlie stanno per separarsi, il peptidoglicano
della cellula madre non è sufficiente per essere ripartito alle due cellule figlie, avviene un processo di
divisione con peptidoglicano diviso nelle due cellule figlie, a meno che
non vengano sintetizzati monomeri del peptidoglicano, entrano in
gioco elementi differenti in base alla forma della cellula. vengono
coinvolte penicillin binding protein PBP che legano la penicillina,
target della penicillina, questa inibisce la formazione dei legami
crociati, la parete cellulare debole viene distrutta molto facilmente,
abbiamo la formazione di autolisine, degradano in maniera
puntiforme il peptidoglicano in modo che possano essere aggiunti
elementi del peptidoglicano. Il precursore del peptidoglicano è composto da N-acetilglucosammina, acido
N-acetilmuramico e un pentapeptide e viene trasportato con il bactoprenolo, questo è un lipide a 55 atomi
di C e permette il passaggio all’esterno di questa unità di peptidoglicano e va a legarsi nei siti appositi, punti
in cui è avvenuta la rottura del peptidoglicano già esistente e l’inserimento di queste componenti. La
deposizione del nuovo peptidoglicano avviene in modo differente in base alla morfologia della cellula,
ovvero se abbiamo forme sferiche o allungate, la sintesi del nuovo peptidoglicano avviene in
corrispondenza del setto di divisione della cellula, nel caso in cui si ha una forma bastoncellare si hanno 3
modalità di deposizione, distribuzione a tipo rete dei pescatori, si può rompere in qualsiasi punto, riparata
con l’inserimento di nuove unità di peptidoglicano, in corrispondenza del setto di divisione durante
l’allungamento, o sempre in corrispondenza di questo ma al momento della divisione fisica.

I punti sono determinati dall’intervento di queste proteine, nei bastoncelli entra in gioco la proteina MreB, i
vibrioni non hanno le stesse dimensioni dei due lati della cellula, nella parte minore abbiamo che la
crescentina (omologo dei filamenti intermedi) impedisce la deposizione del nuovo peptidoglicano in
maniera corrispondente all’altro lato della cellula stessa, la crescentina impedisce la formazione del
bastoncello, le cellule che presentano questo omologo del citoscheletro assumono l’aspetto a virgola. La
crescentina si posiziona per impedire l’inserimento equo del peptidoglicano. Tutto preciso e controllato.

Curva di crescita. Studio di una popolazione in ambiente chiuso con una coltura a termine, Batch culture.

Una coltura a termine, esempio, si vuole costruire una curva di crescita con una popolazione pura, si
verificano i tempi di generazione di quel particolare tipo di microrganismo, si deve vedere in quanto una
cellula madre si divide nelle due cellule figlie per calcolare i tempi di monitoraggio nel tempo. La
sospensione si mette in un terreno sterile in un contenitore di una beuta contenuta in un litro o due litri
ecc. il terreno nutriente contiene tutti i nutrienti necessari per favorire la crescita. si mette una soluzione
tampone per mantenere il terreno di coltura ad un determinato pH e si controlla la temperatura per far si
che il microrganismo abbia la massima efficienza di crescita, si deve capire le variazioni di numero dei
microrganismi all’interno della popolazione, si devono applicare tecniche che ci permettono di calcolare il
numero di cellule in funzione del tempo. Stabilito il numero iniziale di microrganismi, si inizia il periodo di
incubazione, ad intervalli di tempo (preferibilmente tenendo conto di g [tempo di generazione]) si fanno dei
prelievi che stabiliscono se ci sono variazioni di numero e quante mediante tecniche, determinazione per
CFU (unità formanti colonie) per millilitro, unità di volume per millilitro, questo perché delle cellule possono
essere avvolte da una guaina contenente più cellule e non si possono contare come singola cellula, si
calcolano le unità formanti colonie. Si misura anche la torbidità del sistema, un organismo crescendo in
liquido fa passare il terreno da limpido a torbidità crescente, la torbidità sarà indicazione dell’andamento di
crescita della popolazione. La torbidità si misura con uno spettrofotometro (strumento che rileva la luce
che attraversa il campione senza essere dispersa) ad una determinata lunghezza d’onda compatibile con il
nostro terreno. Spettrofotometro strumento che misura il passaggio della luce attraverso cuvette,
attraverso le cuvette l’acqua distillata permette il passaggio al 100% della luce, ha il vantaggio di poter
settare una gamma di lunghezze d’onde, sia visibile che infrarossa che violetto, in genere si utilizzano
540nm o 600nm, nei fototrofi 700nm per la clorofilla. Abbiamo un fascio luminoso che passa nel sistema,
abbiamo il massimo della trasmittanza, trasmittanza e assorbanza sono uno l’inverso dell’altro,
inversamente proporzionali. Nel momento in cui si ha cellule in crescita, il sistema rileva 10^6 cellule per
millilitro inizia a vedere variazioni di trasmittanza o assorbanza in base al numero delle cellule che
assorbono o deviano il fascio luminoso. Più cellule ci sono più aumenta l’assorbanza, valori che ci danno
una buona idea delle cellule, cellule possono essere vive o morte, si misura per sbaglio anche
l’assorbimento non dovuto ad organismi vitali, inoltre ci possono essere detriti cellulari, ci sono anche
determinate concentrazione di albumina, non rispecchia sempre un valore attendibile. Ci sono anche
correzioni tra gram positivi o negativi. L’unità di torbidità è detta densità ottica (OD).
Mettiamo caso di avere un organismo che si divide ogni 30 minuti. Se un organismo si divide ogni 30 minuti
allora faremo un prelievo ogni 30 minuti. Avremo intervalli di tempo ognuno di 30 minuti per stimare le
variazioni del numero di cellule a determinati intervalli di tempo e si portano i valori sul grafico
semilogaritmico. Per calcolare il numero di cellule iniziale si deve fare un conteggio con diluizioni decimali
in quanto la concentrazione dei microrganismi nella beuta sarà troppo alta e non potremo fare la conta in
piastra, ad esempio prendiamo 10^6 microrganismi, andiamo a decimarli fino ad arrivare a 10^2. Si può
fare il conteggio attraverso queste diluizioni. Mettiamo caso che nella piastra 10^4 avremo 4,5 CFU. Si
moltiplica per l’inverso della diluizione, otterremo 45000 CFU/mL. Questa sarà l’unità iniziale al tempo t0.

È possibile vedere quando si traccia il grafico che inizialmente avremo una fase di latenza perché il
trasferimento in un terreno fresco comporta nuove condizioni ambientali per le cellule che devono
modificare il proprio stato metabolico.

Fase di crescita esponenziale quando la popolazione raddoppia ad intervalli regolari, la velocità della
crescita è variabile in base al tipo di microrganismo.

Avremo poi una fase stazionaria in cui non si noterà ne aumento del numero di cellule ne una diminuzione,
in quanto ci saranno sempre delle cellule che si divideranno per scissione binaria ma il numero delle cellule
neoformate sarà molto simile a quello delle cellule morte o che hanno smesso di crescere.

Fase di morte, il numero totale delle cellule diminuisce a causa della morte cellulare. In questa fase
vengono messi in evidenza dei ceppi resistenti, la persistenza è legata alla resistenza agli antibiotici
(popolazione di batteri sensibili agli antibiotici produce un numero limitato di cellule che diventano
temporaneamente tolleranti ad antibiotici.