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MIGLIORAMENTO GENETICO DEI LIEVITI

Docente: Lisa Solieri

25/09/2019

Nell' industria alimentare in cui si utilizzano processi ferementativi, è necessario


utilizzare colture starter. Si è sviluppata la necessità di creare banche dati, in cui le
collezioni microbiologiche sono caratterizzate da informazioni relative al ceppo ed il
ceppo stesso.
La specie del microorganismo (lievito o batterio), viene caratterizzata mediante indizi
ottenuti con tecniche diverse (biochimiche e biologia molecolare), in modo da
ottenere il sequenziamento dei marcatori filogenetici ed I caratteri fenotipici.
I microorganismi utilizzati nelle colture di interesse industriale per fermentazioni
alimentari, sono:
• LIEVITI (eucarioti; DOMINIO: eucaria)
• BATTERI LATTICI (procarioti, quali batteri lattici utilizzati nell' industria
casearia e probiotici)
• BATTERI ACETICI (procarioti)
I lieviti sono organismi unicellulari eucarioti appartenenti ai funghi, ma che si
differenziano da questi, in quanto durante la riproduzione sessuale (meiosi) NON
danno corpi fruttiferi, ma I gameti sono contenuti in una struttura detta asco. Durante
la divisione cellulare mitotica, I lieviti si possono dividere per:
• gemmazione, in cui la cellula figlia è più piccola rispetto alla cellula madre
(budding yeast, quale Saccharomyces)
• o per scissione binaria (fission yeast, quale Schizosaccharomyces).
Quindi I lieviti presentano diversi fenotipi, risultanti dalla interazione tra genotipo ed
ambiente (pseudo ifa, mitosi, meiosi).
Le specie di lieviti utilizzate nelle fermentazioni alimentari, prendono il nome di
Saccharomyces sensu strictu.

(V. tassonomia slide 4, prima dispensa).


(V. storia dispense)
(Pichia pastoris ora si chiama Komagaetella pastoris)

Applicazioni di S. cerevisiae

• biotecnologie industriali (cell factory necessarie per la produzione di beni di


interesse commerciale: ad esempio espressione eterologa di proteine (es
insulina di interesse terapeutico) e di enzimi)

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• biotecnologie industriali (processi fermentativi degli alimenti)
• modelli per la ricerca genetica e biologica di base, in quanto possiede geni
ortologhi (geni omologhi che possiedono un comune ancestore presenti in
specie distinte), le cui informazioni ottenute nel lievito, che è un organismo
semplice da manipolare, possono essere trasposte all' uomo.

Il S. cerevisiae permette, partendo da substrati zuccherini ottenuti dagli scarti di


industrie, di ottenere metaboliti primari (ad esempio bioetanolo, metaboliti secondari
(ad esempio acido succinico), espressione eterologa di proteine e biotrasformazioni in
vivo.
(I lieviti non Saccharomyces utilizzati nelle biotecnologie industriali, prendono il
nome di non conventional yeast).
Per bioprocesso si intende la bioconversione di un substrato nel prodotto desiderato
in condizioni anaerobiche, ossia mediante fermentazione (senza respirazione).
Le fermentazioni utilizzate sono:
• fermetazione alcolica
• fermentazione acido lattica
• fermentazione malo-lattica (vini rossi).

La coltura starter è la coltura che si associa ad un processo fermentativo ed è una


preparazione microbica di un gran numero di cellule.
L' obbiettivo di una coltura starter è di rendere il processo fermentativo EFFICIENTE
e VELOCE.
Il processo di selezione di colture microbiche che soddisfino queste esigenze, è un
processo sequenziale:
• selezione di un aliquota di coltura di un processo fermentativo che casualmente
è avvenuto con successo e utilizzo in altri processi fermentativi (ad esempio
impasti acidi), che è ancora una coltura complessa di lieviti e batteri lattici.
• Dopo successive selezione si ottiene una coltura starter.
• Coltura starter funzionale, ossia una coltura che conferisce al prodotto finale
delle caratteristiche aggiuntive e funzionali salutistiche (ad esempio vengono
utilizzati batteri lattici che fermentano e producono peptidi antiipertensivi).

Una coltura starter che viene utilizzata per un determinato processo per produrre un
certo prodotto, deve possedere un fenotipo desiderato:
• caratteri tecnologici (performance fermentativa)
• caratteri di qualità (aspetti sensoriali, ad esempio dovuti alla produzione di

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composti aromatici desiderati per l' alimento)
Nella ricerca della migliore cell factory, si studiano le proprietà della cellula, la lista
dei tratti desiderati e si cercano le informazioni disponibili relative alle basi genetiche
del fenotipo desiderato. Una volta selezionato il set di fenotipi desiderati, si ricerca in
una certa nicchia ecologica un ceppo già selezionato dalla natura e si applicano
tecniche di miglioramento genetico che possono essere:
• GE : (genetical engineering) nel caso la destinazione d' uso sia medico-
farmaceutica
• non-GE, nel caso in cui la destinazione d' uso sia alimentare
L' utilizzo di un approccio di ingegneria genetica, dipende anche dai determinanti
genici su cui devo agire:
• monogenici (unico gene)
• poligenici
• quantitativi, ossia un certo carattere fenotipico è determinato da un numero
elevatissimo di loci genici, per cui un approccio di ingenegneria genetica non è
l' approccio di elezione, ma si utilizza un approccio casuale (blind).

Il lievito Saccharomyches cervisiae è definito come organismo sicuro per l' utilizzo
umano (GRAS o PTS) sulla base della lunga storia d' uso, che ne comprova la
sicurezza.
(v. leggi su slide).
Un organismo è definito transgenico se possiede, in seguito ad approcci di ingegneria
genetica, del materiale genetico esogeno, ossia proveniente da organismi di specie
diverse, ed è definito organismo OGM.
Se un organismo possiede materiale genetico proveniente da ceppi della stessa specie
o ottenuto mediante delezioni o inserzioni, l' organismo è definito CISgenico e la
normativa al riguardo è ancora confusa (non si sa se definirlo OGM-free).

27/09/19

Struttura dei lieviti

I lieviti sono organismi eucarioti unicellulari eterotrofi, con richieste nutrizionali

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semplici. A seconda delle condizioni ambientali, I lieviti possono andare incontro a
differenziamento cellulare:
• stato ANAMORFO, in cui I lieviti non vanno incontro a riproduzione sessuale,
ma si dividono per mitosi.
• Stato TELEOMORFO in cui I lieviti vanno incontro a divisione cellulare
sessuale per meiosi e successiva sporificazione in seguito a stress esterno
(carenza di zuccheri). Le spore sono contenute in una struttura detta asco e
circondate da un involucro coriaceo che gli permette di soppravvivere agli
stress ambientali. La struttura che si osserva, costituita da 4 spore contenute
nell' asco, è detta tetrade.
• Strutture multicellulari, dette pseudoife, in cui più cellule di lievito che fanno
budding, sono unite tra di loro a formare strutture lineari oppure ramificate.
• Shmoo: è una sorta di ponte coniugativo, che si forma quando le cellule
formano ibridi e quindi serve a fare la coniugazione tra una cellula aploide ed
un altra cellula aploide.
Al microscopio è possibile osservare sulla parete delle strutture denominate scars, che
sono I punti di distacco tra la cellula madre e la cellula figli, di precedenti divisioni
mitotiche cellulari. Una cellula di lievito generalment va incontro a 40 mitosi prima
di morire.
La dimensione di una cellula di lievito va da 4 a 7 μm.
Il generation time (tempo di generazione) è il tempo necessario alla popolazione
cellulare di raddoppiare il suo numero e per il lievito Saccharomyces cerevisiae è di
90 minuti circa.
Come detto, il lievito è un organismo diplontico, ossia può esistere come organismo
aploide oppure diploide, il che lo rende molto flessibile: il lievito può andare incontro
a sporificazione solamente se è in stato diploide; mentre se non può andare incontro a
sporificazione, questo può trovarsi in stato aploide, oppure può presentare difetti
genetici, oppure ancora può essere in forma di ibrido (un ibrido è un organismo che
possiede materiale genetico proveniente da specie differenti e che è sterile).

Struttura della cellula di lievito

La cellula di lievito, che è un organismo eucariote unicellulare, possiede le seguenti


strutture:
• PARETE
• MITOCONDRI (a differenza di altri organismi eucarioti, nei lieviti, non sono
la sede della β-ossidazione degli acidi grassi, che avviene esclusivamente nei
perossisomi)
• NUCLEO contenente il materiale genetico, costituito da 12 Megabasi di DNA
organizzato in 6000 geni suddivisi in 16 cromosomi nella forma aploide. Il
genoma del lievito è molto compatto, contenente pochi introni e poche regioni
intergeniche, caratteristiche che lo hanno reso il candidato ideale come primo

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microrganismo il cui DNA è stato completamente sequenziato.

PARETE

La parete cellulare nei lieviti è una componente significatica, costituente fino al 30%
del peso secco della cellula in forma vegetativa e con spessore di circa 200 nm nella
cellula vegetativa. A partire dalla parte più interna della parete (più vicina alla
membrana cellulare, intracellulare) verso l' esterno, questa è costituita da glucano
(polimero del glucosio), che è una molecola strutturale planare con legami del tipo
β-1,3 (non presenta contorsioni ed ingombri sterici). Tra una catena di glucano ed una
catena adiacente, vi sono dei cross linker costituiti da legami β-1,6. Verso l' esterno vi
sono molecole di chitina, che è un polimero di N-acetilglucosammina β-1,4 linked.
Nella parte più esterna vi sono le mannoproteine. La chitina può essere presente nella
parete, come:
• forma libera
• forma legata al glucano β-1,3, come nel collo dove avviene la divisione tra la
cellula madre e la cellula figlia
• forma legata al glucano β-1,6
La chitina aumenta quando I lieviti fanno mating, in risposta a concentrazioni di
feromoni.
Le mannoproteine sono proteine glicosilate con residui di mannosio in
corrispondenza di asparagina (link N) oppure di serina e treonina (link O).
Queste possono essere enzimi idrolasi, che scindono gli zuccheri situati all' esterno
della cellula, oppure che mediano l' agglutinazione di cellule di lievito mediante
formazione di interazioni non covalenti, oppure possono essere proteine del quorum
sensing, che fungono da sensori di stress esterni e mediano risposte della cellula a
breve termine (chiusura pori di membrana), oppure a medio/lungo termine, quali
modifiche del trascrittoma.
La cella di lievito che va incontro a meiosi e sporificazione, forma una struttura detta
asco, che è la cella madre che funge da sacco. Le pareti delle spore vanno incontro a
modificazioni, che la rendono una forma di resistenza agli stress ambientali.
La parete della spora, presenta una organizzazione invertita rispetto a quella della
cellula di lievito in forma vegetativa, in cui a partire dal lato più interno a quello più
esterno, si incontrano rispettivamente le mannoproteine, il glucano, I cross linker fino
al chitosano (a differenza della chitina della parete, di cui costituisce una variazione,
possiede glucosammina e non N acetil-glucosammina). Nella parte più esterna vi
sono dimeri di tirosina, la cui funzione non è ancora nota.

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DNA

Il DNA della cellula di lievito è suddiviso in:


• DNA MITOCONDRIALE
• DNA CROMOSOMICO PRESENTE NEL NUCLEO
• DNA PLASMIDICO EXTRACROMOSOMICO (ORI di 2 μ)
• RETROTRASPOSONI Ty
• ELEMENTI EXTRACROMOSOMICI contenenti geni killer, che producono
tossine killer attive contro lieviti non convenzionali e che sono forme non
stabili.

SISTEMA SECRETORIO E VACUOLI

Le proteine nei lieviti sono sintetizzate da poliribosomi situati sulla superficie del
reticolo endoplasmatico. Una volta sintetizzate, queste sono trasportate all' interno
dell' RE dove vanno incontro a modificazioni post-traduzionali, quali glicosilazione,
folding mediato da chaperon, trimming. Queste passano poi mediante vescicole all'
apparato di Golgi dove subiscono ulteriori modificazioni post-traduzionali, quali
mannosilazione e altre modificazioni con carboidrati.
Le proteine dall' apparato di Golgi, sulla base di peptidi segnale, che si trovano sulla
proteina, possono essere diretti ai vacuoli; alla cellula figlia, attraversando I punti di
gemmazione, mediante veicolazione su actina; alla membrana plasmatica; secrete all'
esterno della cellula. Ad esempio il peptide del feromone, che è destinato ad essere
secreto, possiede un peptide segnale, che se aggiunto a qualsiasi peptide, ne media l'
uscita dalla cellula.

PEROSSISOMI

I lieviti crescono in presenza di ossigeno: nei perossisomi avviene la sintesi di specie


reattive dell' ossigeno (ROS) e la loro inattivazione, mediante gli enzimi
detossificanti catalasi e glutatione perossidasi. I lieviti risultano positivi alla reazione
della catalasi, per cui se viene aggiunta una goccia di acqua ossigenata (perossido di
idrogeno), si ha la formazione di bolle. I perossisomi sono anche sede del
metabolismo primario di fonti di carbonio inusuali, quali metanolo, come in Pichia
pastoris e della β-ossidazione degli acidi grassi e del ciclo dell' acido glioxidico.

METABOLISMO

Catabolismo degli zuccheri: I carboidrati possono entrare nella cellula in 2 forme:


• le idrolasi extracellulari scindono I disaccaridi all' esterno della cellula ed I
monomeri entrano nella cellula mediante I trasportatori degli esosi
• Oppure possono entrare come disaccaridi, che vengono poi scissi in

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monosaccaridi dalle idrolasi intracellulari.
Ne segue la glicolisi, che genera il piruvato, questo può subire 2 destini differenti:
• entrare nel ciclo di Krebs, mediante l' azione della piruvato deidrogenasi, che
avviene nei mitocondri (resa netta 36 molecole di ATP)
• subire una fermentazione alcolica, in seguito alla conversione del piruvato
medinate la piruvato decarbossilasi (resa netta 2 molecole di ATP)
La regolazione del passaggio del piruvato alle 2 vie, è mediato da:
• concentrazione degli zuccheri
• concentrazione di ossigeno
Il lievito S.cerevisiae, a differenza di altri lieviti, è un organismo fermentativo
facoltativo (anaerobio facoltativo).
Un organismo aerobio obbligato, in presenza adi ossigeno, consuma zuccheri,
produce biomassa, ma NON produce etanolo.
Un organismo anaerobio facoltativo, consuma zuccheri, produce biomassa e produce
etanolo.
Un microorganismo ferementatore facoltativo, sulla base del suo comportamento in
risposta alla presenza di zuccheri, si può distinguere in:
• CRABTREE POSITIVO (è un carattere di specie), come S. cerevisiae, in cui
in presenza di ossigeno e di concentrazione di zucchero oltre una certa sogli
(per S.cerevisia è di 150 mg/l), si ha fermentazione. Questo è stato dimostrato
sperimentalmente sia in chemostato che in bach
• CRABTREE NEGATIVO, produce biomassa e anidride carbonica, ma non
etanolo

Quindi un organismo CRABTREE POSITIVO, in presenza di concentrazioni di


zuccchero sotto la concentrazione threshold, consuma ossigeno, tanto quanto rilascia
anidrode carbonica (RESPIRA). Veros la concentrazione soglia, il consumo di
ossigeno rimane stabile, ma aumenta il rilascio di anidride carbonica (FERMENTA).
Per concentrazioni zuccherine sopra la soglia, il consumo di ossigeno rimane stabile,
ma la concentrazione di anidride carbonica rilasciata sale a picco (FERMENTA).