CAPITOLO 5: LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI I TERRENI DI COLTURA

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “terreni “o “mezzi di coltura “con i quali si
cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio
che si desidera coltivare. Naturalmente un terreno prima della semina dovrà esser sterile in incubatrici
altrettanto sterili. I terreni di coltura si distinguono in liquidi e solidi, l’unica differenza è appunto lo stato
fisico. Il materiale solidificante più usato è rappresentato dall’agar, un polisaccaride acido estratto da
alcune alghe, il quale disciolto a caldo in un liquido, ne provoca durante il successivo raffreddamento la
gelificazione. L’agar non è tossico per i batteri e solo pochissimi di loro possiedono enzimi capaci de
depolimerizzarlo. La gelificazione è abbastanza solida per consentire manipolazioni e umida per la
replicazione, ma povera di acqua il che rende difficoltoso il movimento dei batteri. La composizione chimica
dei diversi terreni di coltura è naturalmente differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio
che si desidera coltivare. I terreni di base usati in batteriologia medica, per la coltivazione dei batteri senza
particolari esigenze nutritive, sono costituiti dal:
-Brodo normale: Costituito da una soluzione allo 0,5 di peptoni (prodotti della digestione della carne) e per
lo 0,3 da estratti di carne. Il tutto tamponato a pH 7 e portato all’isotonicità con NaCl.

-Brodo normale solidificato con agar: Brodo normale addizionato all’1.5 % di agar.

Ai terreni di base (brodo e agar normali) si aggiungono, di volta in volta e a seconda delle esigenze
nutrizionali del batterio che si desidera coltivare, vari altri materiale come: sangue, siero, estratto di lievito
ecc… molto spesso l’aggiunta di uno di questi materiali può servire a più di uno scopo. Ad esempio,
l’aggiunta di siero non solo arricchisce il terreno di sostanze utilizzabili dal batterio come alimenti, ma
elimina anche varie sostanze che potrebbero essere tossiche anche in piccole quantità, attraverso la
multiforme capacità dell’albumina di legare varie classi di composti a basso peso molecolare. L’aggiunta di
sangue oltre ad arricchire il terreno consente anche di rilevare la produzione di tossine batteriche
emolitiche e così via. Inoltre il terreno dovrà essere incubato alla temperatura ottimale per il metabolismo
batterico (circa 36 °C) dovrà essere fornita la concentrazione di CO2 necessaria che di norma coincide con
quella presente nell’aria, inoltre, per i batteri aerobi, si dovrà assicurare la fornitura di ossigeno.
Ovviamente per gli anaerobi obbligati sarà necessario sottrarre tutto l’ossigeno dall’ambiente di
incubazione.

SVILUPPO DEI BATTERI IN TERRENI LIQUIDI

Lo sviluppo dei batteri in terreno liquido si appalesa con un intorbidimento del terreno. A seconda della
specie batterica interessata l’intorbidimento può essere diverso nell’aspetto, diffuso in tutto il recipiente di
coltura, o limitato agli strati superficiali o addirittura in una pellicola alla superficie del liquido. Quando tutti
i batteri presenti nella coltura sono in grado di portare a termine i processi metabolici necessari alla
riproduzione (fase di latenza), inizia la fase esponenziale o logaritmica di crescita, nella quale l’aumento
del numero di batteri e della massa totale sono paralleli e procedono con un incremento progressivamente
crescente in rapporto al tempo. Nella fase esponenziale, poiché’ tutti i batteri si moltiplicano, dopo ogni
generazione si ha un numero di batteri doppio di quello precedente. Naturalmente il ritmo esponenziale di
crescita non può durare continuamente. Il progressivo esaurimento dei nutrienti e l’accumulo di scorie
tossiche del metabolismo provocano un allungamento del tempo di moltiplicazione nonché’ l’arresto della
moltiplicazione di un numero sempre maggiore di batteri. La popolazione batterica, quindi, attraverso la
fase di decelerazione della crescita entra in quella che si chiama fase stazionaria in cui c’è un bilancio tra
batteri che nascono e che muoiono. L’ultima fase è quella di morte in cui si assiste ad una decrescita della
popolazione batterica, causa esaurimento scorte!
SVILUPPO DEI BATTERI IN TERRENI SOLIDI
Inoculati alla superficie di un terreno gelificato con agar i batteri possono crescere formando una patina o
colonie isolate. La produzione di una patina si osserva nelle colture inoculate con un numero sufficiente di
batteri perché’ i batteri originati da ogni singolo centro di crescita confluiscano in un'unica massa; la
produzione di colonie si ha invece quando il numero di batteri in ciascun punto di crescita originale, sia
sufficientemente piccolo perché’ i singoli centri di crescita diano luogo a singole masse di batteri separate le
une dalle altre. La forma delle colonie segue spesso la forma del singolo batterio (batteri mobili hanno
margini frastagliati). I più importanti tipi di colonie sono le così dette colonie S (lisce), le colonie R (rugose),
e le colonie mucose. Il passaggio da S a R spesso avviene per la perdita di un componente superficiale della
cellula batterica, ad esempio la capsula negli pneumococchi. I batteri in fase R hanno quindi un potere
patogeno diminuito e di conseguenza antigeni diversi. Nel prodotto morboso di solito si isolano colonie in
fase S. LE

COLTURE ISOLANTI
Per studiare un batterio, come qualsiasi altro microrganismo, e procederne alla identificazione, è
assolutamente necessario poter disporre di una coltura pura, di una coltura cioè, costituita esclusivamente
da batteri identici. Poiché’ raramente una specie microbica si ritrova in natura in assenza di altri
microrganismi si comprende come il primo passo per lo studio di un batterio sia costituito dal suo
ottenimento in coltura pura, isolandolo dal materiale di origine e dalle specie microbiche contantinanti. Le
colture isolanti tendono appunto a questo scopo. Di norma, i terreni che si impiegano per l’isolamento sono
terreni solidi, in quanto l’utilizzo di un mezzo liquido determinerebbe ancora la comparsa di popolazioni
batteriche miste rispetto quelle di partenza. Con i terreni solidi invece inoculando i vari batteri in punti
diversi e distanziati tra loro avremo colonie separate e circoscritte (per batteri incapaci di muoversi.

COLTURE DI MANTENIMENTO
Per mantenere una coltura in laboratorio sono necessari periodici trapianti in terreni freschi per evitare la
morte di fame dei batteri. Per ridurre la frequenza dei trapianti si mantiene la coltura a temperature
inferiori (frigorifero e a T ambiente) dopo che si è raggiunta la fase stazionaria. Per tempi molto lunghi si
ricorre all’essiccamento in liquidi ricchi di sostanze proteiche oppure alla liofilizzazione.

Capitolo 6: GENETICA BATTERICA

Il genoma serve alla duplice funzione di deposito delle informazioni genetiche. Il genoma batterico
presenta:
la presenza di un unico cromosoma
l’assenza di istoni
l’utilizzazione di quasi tutta l’intera sequenza di DNA per la codificazione di proteine
l’esistenza di unità genetiche accessorie – i plasmidi -.

Plasmidi: sono elementi genetici extra cromosomici, formati da una molecola di DNA bicatenario a struttura
circolare, sono estremamente più piccole di quelle del cromosoma batterico (che presenta da 1 a 5 milioni
di coppie di basi). Un singolo batterio può contenere numerosi plasmidi differenti e di diverse dimensioni
ed esser presenti in copie. Naturalmente ogni specie batterica ha un corredo plasmidico peculiare. Le
funzioni codificate dai plasmidi, tra l’altro, raramente sono indispensabili per la sopravvivenza e la
moltiplicazione del batterio in ambienti ottimali ed è relativamente facile osservare la perdita di uno o più
plasmidi nei batteri mantenuti a lungo in colture artificiali. Ogni plasmide possiede una serie di geni
finalizzati alla duplicazione del plasmide stesso e alla sua ripartizione nelle cellule figlie. Molti plasmidi però
possiedono informazioni genetiche ulteriori in grado di codificare prodotti utili a garantire la sopravvivenza
del batterio in particolari situazioni. Le proprietà cellulari codificate da questi plasmidi sono numerose
(anche se a volte non indispensabili alla sopravvivenza ) comprendono , la produzione di tossine , di pili e di
altri tipi di adesine, la produzione di enzimi capaci di interferire con l’azione di diversi farmaci antibatterici ,
la produzione di batteriocine (proteine “ tossiche “ in grado di uccidere altri batteri ) .Alcuni plasmidi ,
denominati “ plasmidi coniugativi “ sono in grado , mediante un particolare set di geni , di codificare una
serie di prodotti che sono in grado di promuovere un intimo contatto tra cellule diverse ed il successivo
trasferimento del plasmide attraverso un ponte coniugativo consentendo così il trasferimento orizzontale
( da una cellula donatrice ad una accettrice) in aggiunta a quello verticale , possibile per tutti i plasmidi.

Sia il cromosoma batterico che i plasmidi contengono elementi che possono traslocare da una zona all’altra
del genoma e sono denominati elementi trasponibili:

- Sequenze di inserzioni: piccoli tratti di DNA i cui estremi sono caratterizzati dalla presenza di corte
sequenze nucleotidiche ripetute.
- Trasposoni: elementi genetici di maggiori dimensioni. L’elemento trasponibile originale rimane nella sede
iniziale mentre una sua copia compare in un’altra zona del genoma.
- Elementi invertibili: simili ai trasposoni ma hanno in più un enzima peculiare, la DNA-invertasi che è
capace di invertire l’orientamento dell’elemento che lo possiede, nella sua collocazione nel cromosoma.

Le mutazioni
Le mutazioni consistono in modificazione della sequenza di basi in zone più o meno ampie del DNA e
possono essere rappresentate da microlesioni, quando sia alterata una singola coppia di basi, o in
macrolesioni quando la modificazione riguardi sequenze di maggiori dimensioni. Le mutazioni sono le
medesime di quelle già viste per gli eucarioti. Come è noto le mutazioni sono per la maggior parte
conseguenza di errori nella duplicazione del DNA ed avvengono quindi con una frequenza bassissima. Le
principali mutazioni microlesioni comprendono:
-Transizione: Una base purinica è sostituita con un’altra base purinica o una base pirimidinica con un’altra
pirimidinica
-Trasversione: sostituzione di una base purinica con una pirimidinica o viceversa
-Frame shift: Scorrimento della sequenza di trascrizione dovuta all’aggiunta a o perdita di una o due basi.

Le macrolesioni invece:
-Delezione: perdita di più di una coppia di basi -Duplicazione di sequenze preesistenti
-Inversione e traslocazione: dovute rispettivamente ad inversioni e trasferimenti di basi all’interno della
sequenza nucleotidica
Le mutazioni possono essere a volte compatibili con la vita del batterio, a volte letali in quanto geni mutati
determinano un alterata o mancata codifica di proteine indispensabili alla vita cellulare.

Il trasferimento intercellulare del materiale genetico:

- Trasformazione: i batteri assumono DNA presente in forma solubile nell’ambiente.

- Trasduzione: alcuni batteriofagi possono trasferire occasionalmente geni batterici da una cellula ad
un’altra. -Coniugazione: trasferimento diretto di materiale genetico attraverso un contatto fisico, è
presente nei batteri che possiedono particolati plasmidi detti plasmidi coniugativi.
Il plasmide coniugativo meglio conosciuto è il plasmide F, F è una molecola circolare di DNA bicatenario, in
grado di replicarsi autonomamente. Circa un terzo del materiale genetico del plasmide è occupato da
almeno 13 geni tra ed essi codificano la produzione di un pilo F. Il plasmide contiene anche quattro
elementi IS (altri geni plasmatici).
L’attacco del pilo F ad una cellula F- innesca eventi che culminano con il taglio di un filamento del DNA
plasmidico e l’avvio della replicazione del filamento polinucleotidico tagliato attraverso un meccanismo a
rolling circle in direzione 5’ a 3’.

Solo la trasformazione è evoluta per portare al trasferimento di materiale genetico. Le altre due possono
portare al trasferimento di materiale genetico ma solo come conseguenza di errori.