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Le biomasse microbiche sono culture di microrganismi che costituiscono esse stesse il prodotto del
processo biotecnologico.
Vengono utilizzate in funzione del loro contenuto come fonte alternativa di proteine vitamine,
nell’alimentazione umana e animale. Sono anche usate per l’estrazione di componenti chimici come enzimi,
vitamine, a geografici e lipidi.
Inoltre vengono utilizzate in funzione della loro attività come culture selezionate e starter nella produzione
del pane e di altri prodotti da forno, nell’industria enologica e delle bevande alcoliche.
L’impiego di biomasse microbiche può avere alcuni inconvenienti virgola che possono essere legati a:
Presenza di acidi nucleici virgola che possono interferire nel metabolismo animale e umano.
Residui tossici o cancerogeni da alcuni substrati come le paraffine.
Scarsa digeribilità
Possibile reazione allergica
SCP -> Single cell proteins indica microrganismi cellulari impiegati come fonte proteica.
È possibile utilizzare tipi diversi di microrganismi per la produzione di SCP, ognuno dei quali presenti aspetti
più o meno vantaggiosi. L’impiego di SCP riguarda soprattutto l’integrazione proteica dell’alimentazione
umana e animale.
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SACCHAROMYCES CEREVISIAE PER LA PANIFICAZIONE
Un parametro di cui occorre tenere conto in questo tipo di produzione è la concentrazione del substrato
nutritivo zuccherino che deve essere inferiore a 50g/L per non incorrere in un effetto inibitore -> EFFETTO
CRABTREE: in condizioni di aerobiosi, il metabolismo ox. è inibito da concentrazioni troppo elevate di
zucchero perché la quantità di zucchero esplica un’azione di repressione della sintesi degli enzimi del ciclo
di Krebs.
FONTE DI CARBONIO è rappresentata da melassa, mentre l’azoto viene fornito da Sali di ammonio e
vengono aggiunti fosfato di sodio e solfato di magnesio. La temperatura è mantenuta intorno ai 30 ° e il PH
non deve allontanarsi da valori di 4- 4,5 (utili per evitare per le contaminazioni).
La produzione di lievito per panificazione avviene in più stadi, la fase iniziale avviene anaerobiosi, allo scopo
di non deprimere alla capacità fermentativa per repressione degli enzimi responsabili. Mentre gli stadi finali
sono invece in aerobiosi.
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COLTURE INSETTICIDE DA BACIULLUS
I pesticidi o fitofarmaci, molecole usate in agricoltura per il controllo e l’eliminazione dei parassiti dannosi,
pongono gravi problemi legati alla loro scarsa o assente biodegradabilità e alla conseguente persistenza nel
suolo e nelle acque.
L’obiettivo è quello di ottenere dei microrganismi molecole attive contro gli insetti dannosi. La diffusione
nel produrre grosse quantità di cultura insetticide costituiscono tuttavia un limite alla loro diffusione su
larga scala. In agricoltura sono impiegate tossine ottenute da specie di Bacillus e culture di Bacillus
Thuringiensis.
Le colture di Bacillus Thuringiensis si ottengono su terreno contenente corna step liquor, amido e idrolato
di caseina. La sporificazione è associata alla produzione di una tossina detta gamma- endotossina. Dopola
lisi dello sporangio, questi corpi di inclusione che contengono la tossina sono rilasciati in ambiente insieme
alla spora.
I geni plasmidi che codificano per la tossina, detti geni Cry, possono essere clonati in batteri naturalmente
presenti nei vegetali, ma ciò equivale all’immissione di ambiente di microrganismi geneticamente
modificati. Questo problema può essere superato uccidendo e fissando questo batterio transgenico dopo
che ha prodotto al suo interno grosse inclusioni parasporali, che in questo modo rimangono incapsulate
dalla parete batterica: la tossina è quindi rilasciata in ambiente senza microrganismi vitali.
Sono state create anche piante transgeniche, che contengono i geni cry da Bacillus tabacco, patate, mais e
cotone.
Lando tossina, denominata ICP non è tossica per l’uomo e per gli animali, perché è inattivata a livello
gastrointestinale.
Il trattamento a base di biotossina deve essere effettuato come i prodotti chimici, perché il bacillo non
persiste molto a lungo.
Gli effetti della tossina si hanno dopo l’ingestione da parte delle larve: l’attivazione del gamma endotossina
è dovuta sia all’ambiente alcalino dell’intestino che all’azione di proteasi. Le larve muoio se per setticemia e
per paralisi dell’apparato digerente in seguito alla necrosi cellulari.
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COLTURE DELL’AZOTOFISSATORE RHIZOBIUM
Rhizobium è un batterio endosimbionte delle radici delle leguminose, è in grado di fissare l’azoto
atmosferico rendendolo disponibile per la pianta, che a sua volta fornisce al batterio carbonio e altri
nutrienti.
Le radici delle piante emettono flavonoidi, che attirano i batteri e inducono i geni nod i quali codificano per
la produzione dei noduli radicali (sono quindi formati da cellule ingrossate del batteroide azotofissatore e
dall'accumulo di amiloplasti tra le cellule meristematiche della radice.)
I batteri azotofissatori svolgono un ruolo fondamentale in agricoltura arricchendo il terreno di azoto e nel
caso di azotofissatori simbionti, fissandolo alle piante.
La produzione industriale prevede una prima fase culturale in aerobiosi per favorire la riproduzione
cellulare, a cui segue una seconda fase in carenza di ossigeno per favorire lo sviluppo di nitrogenasi, un
enzima ossigeno-labile ( a contatto con l’O si degrada) responsabile della fissazione dell’azoto (da azoto
atmosferico in ammoniaca).
I batteri alzato fissatori trasformano l’azoto atmosferico in ammoniaca o NH 4 + che viene incorporato come
gruppo amminico negli aa e quindi nelle proteine. La nitrogenasi, enzima indispensabile per la fissazione
dell’azoto è molto sensibile all’ossigeno, da cui è facilmente inattivata. Molti batteri azotofissatori sono
aerobi: questa contraddizione viene superata con strategie diverse.
I noduli o tubercoli radicali formati in seguito all’infezione contengono LEG-EMOGLOBINA, molecola dotata
di un’elevata affinità con l’O.
I microrganismi producono inoltre un rivestimento di esopolisaccaridi che, oltre a svolgere un ruolo nel
limitare la diffusione dell’ossigeno, funzionano come segnali di riconoscimento specifico fra pianta e
rizobio, consentendo l’adesione del batterio alle cellule radicali.
Molti acidi organici si possono ottenere in modo economicamente conveniente dal metabolismo microbico,
sia aerobio che anaerobio.
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LA FERMENTAZIONE ANAEROBICA:
L’ ACIDO LATTICO è usato nelle industrie farmaceutica e alimentare come acidificante e conservante, in
zootecnia come ammonio lattato per l'alimentazione animale, nell’industria della concia (trattamento) delle
pelli, e per la produzione di polimeri biodegradabili (bioplastiche=acido polilattico (PLA) è un poliestere
termoplastico biodegradabile molto resistente e utilizzabile in vari impieghi: bottiglie per le acque minerali,
piatti, bicchieri e posate monouso)
La produzione avviene impiegando batteri lattici omofermentanti, che convertono il glucosio in acido
piruvico nella via di Embden Meyerhoff-Parnas -> GLICOLISI, in quanto gli eterofermentanti (che lo
producono attraverso la via dei pentoso-fosfati, mancano gli enzimi per fare la glicolisi) liberano altre
sostanze indesiderate: ciò porta a una diminuzione nella resa di processo.
o glucosio
o fosfato di diammonio -> (NH4)2HPO4
o malto
o vari fattori di crescita
o CaCO3 (carbonato di calcio) per tamponare l’eccessivo abbassamento di pH (Quando aumenta
l’acido lattico diminuisce la resa perché diminuisce il pH)
o Si aggiunge diidrossido di calcio che trasforma acido lattico in lattato di Ca
Questo batterio è piuttosto esigente dal punto di vista nutrizionale, inoltre non produce amilasi (enzima
necessario per la degradazione degli amidi, e in base alla presenza o assenza di questo enzima si seleziona il
terreno) -> è necessario predigerire il terreno = pretrattamento per immobilizzare gli zuccheri semplici.
Dal punto di vista biochimico, il processo coincide con la glicolisi, con la successiva riduzione dell’acido
piruvico da parte del NADH+H + liberato dalle reazioni della glicolisi per azione della lattico deidrogenasi e
formazione di acido lattico: si ottengono 2 molecole di a. lattico per 1 di glucosio con il guadagno di due
ATP.
Si tratta della tipica fermentazione lattica, con accumulo spontaneo del prodotto finale desiderato senza
necessità di un intervento di blocco metabolico
Il
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Terminata la fermentazione, la biomassa è trattata a 80° per eliminare i microorganismi, a cui segue una
filtrazione per recuperare la fase liquida. Questa poi è chiarificata su carboni attivi, purificata e concentrata.
Si aggiunge acido solfidrico così il calcio precipitata sotto forma di CaSO 4 e a. lattico rimane libero. Questa
soluzione di a. lattico va ulteriormente purificata e concentrata per evaporazione
LA FERMENTAZIONE AEROBICA
ACIDO CITRICO
Il microorganismo maggiormente usato è muffa Aspergillus niger (aerobio stretto, mesofilo), impiegando
come substrato polisaccaridi complessi grazie alla presenza dell’enzima amilasi.
ACIDO CITRICO è un metabolita intermedio del ciclo di Krebs, che è sintetizzato attraverso la relazione di
condensazione dall’acetil-CoA con l’acido ossalacetico, quindi non si accumula spontaneamente come
prodotto finale.
Se il ciclo di Krebs viene bloccato si può attivare il piruvato carbossilasi che produce ossalacetato senza la
produzione del CoA -> non si forma a. citrico quindi devo bloccare questo enzima.
Inoltre bisogna bloccare un altro enzima: glucosio-ossidasi che converte il glucosio in a. gluconico (-> no
glicolisi), per bloccare questo enzima è necessario mantenere il pH basso intorno a 3.
La materia prima mescolata con acqua è il brodo nutritivo ed è sterilizzata per eliminare i microorganismi
indesiderati.
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Le spore di Aspergillus sono fatte germinare su melassa nella fase di pre-fermentazione fino alla formazione
del micelio, quindi si procede all’inoculazione del brodo di coltura già sterilizzato all’interno del
fermentatore.
La muffa cresce sia in coltura superficiale quindi camere di fermentazione sia sommersa in condizioni di alta
ossigenazione con agitazione meccanica o sistema air-lift.
Al termine del processo fermentativo, il prodotto consiste di una miscela di acidi citrico e ossalico,
biomassa, acqua e metaboliti secondari.
Il citrato è separato per centrifugazione poi la soluzione viene purificata. Il filtrato è infine concentrato per
evaporazione sotto vuoto e sottoposto a ulteriore purificazione per cristallizzazione o essicamento.
Utilizzato: in campo alimentare, nell’industria dei metalli, nella concia delle pelli, agente lievitante, in
medicina, nei detergenti, nel trattamento della ruggine.
Questo acido è prodotto usando la muffa Aspergillus niger, batterio Gluconobacter suboxydans, impiegando
come substrati il glucosio.
È una bioconversione perché è una ossidazione (ad opera della glucosio-ossidasi localizzata in parete
cellulare) del glucosio che avviene in 2 fasi: da glucosio a -gluconolattone ad acido gluconico.
Non c’è sviluppo del microrganismo (il m.o è usato come biocatalizzatore)
L’acido gluconico viene prodotto in ambiente extracellulare. L’H 2O2 che si forma durante il processo è scissa
dalla catalasi prodotta dallo stesso microorganismo.
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IMPIEGO E PRODUZIONE DI ETANOLO
L’etanolo ha molto impieghi: dalla produzione di bevande alcoliche a l’industria cosmetica e delle essenze
(profumi), utilizzato come solvente e combustibile (bioetanolo), disinfettante, sintesi di molecole come
precursore per acetaldeide, acido acetico, etilene. (precursore dei polimeri dell’etilene: materiale plastico)
L’etanolo può essere prodotto sia per via chimica o fermentativa -> questa è preferita sia per convenienza
economica e perché consente di usare residui ed eccedenze di varie produzioni agricole e industriali.
La fermentazione alcolica si può realizzare partendo da svariate materie prime contenenti zuccheri, anche
complessi ma prima bisogna pretrattarli. I substrati impiegati per la fermentazione alcolica vengono anche
indicati con il nome di MOSTO.
Effetto Pasteur: quando il lievito è in condizioni di carenza di ossigeno compie metabolismo fermentativo
con produzione di alcol etilico, in condizioni di aerobiosi il m.o. compie la via respiratoria con aumento di
biomassa.
La concentrazione di etanolo porta a fenomeni di inibizione a feedback (inibisce alcuni enzimi e blocca la
crescita del m.o) e determina la permeabilizzazione delle membrane e quindi: l’ALCOLTOLLERANZA è una
caratteristica importante nella selezione dei lieviti per l’impiego industriale.
L’alcol può diffondere attraverso la membrana cellulare, alterandone la permeabilità e i delicati meccanismi
osmotici -> morte della cellula. L’abbondante presenza di acidi grassi insaturi e di opanoidi (molecole simili
agli steroli) nella membrana cellulare del batterio può spiegare perché questo batterio può produrre alcol
più velocemente. Ceppi ingegnerizzati di Zymomonas, utilizzano la via di Entner-Doudoroff per degradare il
glucosio.
Processo produttivo:
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IMPIEGO E PRODUZIONE DEGLI AMMINOACIDI
Vantaggio della produzione biologica rispetto alla produzione chimica: microrganismi ed enzimi di
derivazione cellulare sono specifici per la produzione di L-aminoacidi (la forma biologicamente attiva).
Produzione degli otto aminoacidi essenziali: fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina,
triptofano e valina.
Gli aminoacidi vengono estratti per idrolisi dalle proteine, per fermentazione (acido L-glutammico, L-Lisina),
per bioconversione enzimatica, per sintesi chimica.
Substrato nella produzione biotecnologica: melassa integrato da composti azotati organici o inorganici
Produzione di L-lisina
Impiego: integratore nell'alimentazione umana e animale (amminoacido essenziale). La produzione per via
biologica è economicamente più conveniente e si basa sull'utilizzo di due intermedi metabolici dei
microrganismi: acido piruvico e semialdeide aspartica (ottenuta da acido L-aspartico). Da questi due
composti attraverso la formazione di acido diamminopimelico, si ottiene L-lisina. (Fig.16.27 pag. 426)
Ceppo produttore: Corynebacterium glutamicum metabolizza il glucosio producendo oltre alla L-lisina
anche treonina e metionina, queste portano alla inibizione a feedback della produzione di semialdeide
aspartica -> no produzione di lisina. (inibiscono l’aspartatochinasi = riduzione della produzione di lisina)
Come ovvio il
problema di questa
inibizione?
1. Si produce un
ceppo
mutante
dove il
gene
2. Si ottiene un ceppo mutante che non produce omoserina deidrogenasi così inibendo la sintesi di
treonina che a sua volta andava ad inibire aspartatochinasi
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Recupero:
Dopo la fermentazione la biomassa viene messa in centrifuga per eliminare i residui solidi cellulari, il liquido
viene inviato a cromatografia da cui è estratta la soluzione contenente Lisina , la soluzione viene pompata
ad un cristallizzatore, la lisina cristallizzata viene centrifugata e poi essiccata , infine i cristalli sono
polverizzati ed ulteriormente essiccati.
Viene sintetizzato dall'acido α-chetoglutarico, un intermedio del ciclo di Krebs, e accumulato come
metabolita endocellulare.
I microrganismi impiegati nella loro produzione sono ceppi selezionati, o ingegnerizzati con la tecnologia del
DNA ricombinante. I microrganismi modificati sono soprattutto batteri (genere Bacillus) e muffe
appartenenti (genere Aspergillus)
Substrati di produzione: -melasse, amidacei, fattori di crescita, Sali minerali, fonti di azoto come urea e sali
d’ammonio
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enzimi endocellulari si richiede la lisi delle cellule
produttrici. Sono idrolitici (penicillina acilasi da E.coli) e non
(catalasi e glucosio ossidasi da Aspergillus niger)
Le amilasi sono enzimi esocellulari in grado di idrolizzare il legame 1,4-glicosidico dell’amido. α-amilasi:
scindono il legame glicosidico negli amidi fino ad ottenere maltosio e glucosio Beta-amilasi producono solo
maltosio prodotte da ceppi selezionati di Bacillus licheniformis, aspergillus niger
Utilizzo industriale:
La β galattosidasi o lattasi: idrolisi del lattosio. Impiego: scissione del lattosio negli alimenti destinati ai
soggetti intolleranti al disaccaride, e nella produzione di gelati per prevenire la granulosità dovuta alla
presenza di lattosio.
L'asparaginasi -> Impiego: farmaco antitumorale nella terapia di alcune forme di leucemia. I microrganismi
impiegati sono alcuni ceppi mutanti di E. coli e Serratia marcescens, ottenuti da mutazioni spontanee o
indotte o anche con la tecnologia del DNA ricombinante.
Le lipasi catalizzano l'idrolisi dei trigliceridi in glicerolo e acidi grassi e sono prodotte da funghi. Impiego:
detersivi per lavatrici e lavastoviglie.
Invertasi idrolisi del saccarosio. Scinde il legame glicosidico tra fruttosio e glucosio nel saccarosio. Impiego
industria dolciaria.
Impieghi: detersivi per rimuovere grassi e sostanze proteiche dai tessuti. Nell'industria casearia il caglio di
origine naturale estratto dall'abomaso (IV stomaco) dei ruminanti viene sostituito da
Proteasi acide (rennina) idrolisi della caseina del latte nella cagliata. La rennina microbica sostituisce quella
prelevata da stomaco di vitelli o agnelli
Enzimi pectinolitici vengono utilizzati per l'estrazione di succhi vegetali o a scopo chiarificante in molte
bevande.
La penicillina acilasi prodotta da ceppi mutanti di E. coli viene utilizzata per ottenere acido penicillanico,
precursore delle penicilline.
Taq polimerasi utilizzabile nella PCR estratto da Thermus aquaticus un batterio termofilo
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