FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

Sostanze nutritive

Ossigenazione

Temperatura

pH

LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I TERRENI DI COLTURA
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede limpiego di mezzi di coltura con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare. I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo. La composizione chimica dei diversi terreni di coltura naturalmente differente in relazione alle necessit nutrizionali del batterio che si desidera coltivare. In generale essi sono composti da: Carbonio; Idrogeno; Ossigeno; Azoto; Fosforo; Zolfo; Oligoelementi (ferro, calcio, cobalto, rame, manganese, ecc)

TERRENI DI COLTURA
Terreno liquido e/o brodo nutritivo
costituito da elementi nutritivi in genere un carboidrato (destrosio) o una fonte di carbonio organico come digerito peptico di tessuto animale (peptone), digerito pancreatico di caseina o gelatina, disciolti in acqua distillata alle concentrazioni richieste.

Terreno solido
costituito da componenti del brodo a cui si aggiunge agar (1.5-2%), polisaccaride formato da pi molecole di galattosio estratto da alcune alghe marine e non utilizzato dai batteri come elemento nutritivo, utile solo per rendere solido il terreno liquido. Lagar passa allo stato liquido alla T di circa 100C, rimane liquido fino a circa 45C e solidifica a temperatura ambiente.

Terreno semisolido
generalmente utilizzato per individuare la motilit microbica; costituito da brodo a cui si aggiunge agar in percentuale (0.3-0.5%) inferiore a quella che si utilizza per il terreno solidificabile.

TERRENI
TERRENI CON FUNZIONE DI MANTENIMENTO Permettono il mantenimento per un pi lungo periodo di tempo dei microrganismi isolati. TERRENI DI TRASPORTO Sono semisolidi, non posseggono alcun carattere nutrizionale, ma permettono la vitalit del microrganismo.

TERRENI DI COLTURA
Elettivi: sono quelli sui quali, pur sviluppandosi molte specie microbiche, la specie di elezione cresce in un tempo pi breve. Es. siero di Loeffler per i batteri della difterite. Selettivi: sono quelli che contengono sostanze batteriostatiche che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche. Es. terreno di Lowestien Jensen per i batteri della tubercolosi. Differenziali: sono tutti quei terreni che contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Es. MSA per lo Staphylococcus aureus.

Siero di Loeffler

Lowenstein Jensen

Mannitol salt agar

TERRENI DI COLTURA
Agar sangue: terreno non selettivo per microrganismi pi esigenti, permette la coltivazione e il mantenimento di una variet di microrganismi che necessitano di fattori di accrescimento e permette anche lindividuazione di attivit emolitica. Il sangue utilizzato proviene da animali (montone, pecora) non trattati con agenti antimicrobici. Il sangue viene aggiunto (5-10%) sterilmente al terreno base (Trypticase soy agar o Columbia agar). Enterococcosel agar: un terreno selettivo usato per isolare gli Streptococchi di gruppo D (Enterococchi); tale terreno contiene oltre al terreno base (infuso di carne) agar, esculina e cloruro di ferro: lidrolisi dellesculina indotta dagli Enterococchi determina la precipitazione di ferro e lannerimento del terreno.

TERRENI DI COLTURA
Mannitol Salt agar: terreno selettivo impiegato per lidentificazione degli Stafilococchi, inibisce la moltiplicazione dei batteri Gramnegativi per la presenza di NaCl 7.5%, inoltre con tale terreno possibile mettere in evidenza Stafilococchi mannitolo fermentanti (S. aureus, S.simulans, S. saprophyticus) per il viraggio di un indicatore (il rosso fenolo che vira al giallo in seguito alla presenza di radicali acidi liberati dalla fermentazione del mannitolo) presente nel terreno. MacConkey agar: terreno differenziale utilizzato per lidentificazione degli enterobatteri e per differenziare Escherichia coli e Klebsiella, infatti quest ultimi fermentano il lattosio presente nel terreno. Oltre il lattosio il terreno contiene un indicatore di viraggio (rosso neutro), cristal-violetto (che inibisce la crescita dei batteri Gram-positivi) e bile (che inibisce la crescita dei batteri Gram-negativi diversi dagli enterobatteri).

MSA

MAC CONKEY

Sabouraud agar: terreno che permette lo sviluppo di lieviti e muffe, e preparato ad un pH acido 5.6, considerato un terreno povero per mancanza di fattori di accrescimento, talvolta supplementato di glucosio e talvolta di antibiotici per ridurre linquinamento batterico.
Agar cioccolato: costituito da terreno base a cui si aggiunge sangue sterile, successivamente si riscalda sotto agitazione a 80C fino a che il terreno assume il colore del cioccolato dovuto alla cottura del sangue. Viene utilizzato per lo sviluppo di microrganismi esigenti (Neisseria, Brucella, Haemophylus, ecc.); se richiesto per lo sviluppo del microrganismo, la piastra dopo la semina viene incubata in presenza di CO2 (5-10%). Un esempio di agar cioccolato il terreno di Thayer Martin agar, a cui si aggiunge, dopo sterilizzazione, un complesso di fattori di accrescimento e una miscela di antibiotici, quali vancomicina, colistina, nistatina, inibenti rispettivamente germi Gram-positivi, Gram-negativi e miceti. Tale terreno favorisce, in condizioni ottimali adatte, lo sviluppo di Neisseria gonorrhoeae e N.

meningitidis

SABOURAUD

AGAR CIOCCOLATO

OSSIGENAZIONE
Aerobi batteri che crescono in presenza di O2 libero;
Anaerobi libero; Anaerobi facoltativi batteri che crescono sia presenza che in assenza di O2 libero; in batteri che crescono in assenza di O2

Microaerofili

batteri che crescono in presenza di

piccole quantit di O2 libero.

Suddivisione dei batteri in base alle temperature di crescita

T (C) T (C) T (C) MINIMA OTTIMALE MASSIMA PSICROFILI -10 10-20 30 MESOFILI 10 30-40 50 BATTERI

TERMOFILI

40

50-70

90

RIPRODUZIONE DEI BATTERI

DIVISIONE CELLULARE
Duplicazione del materiale genetico; Segregazione del materiale genetico dopo la sua duplicazione; Settazione e cio suddivisione della cellula in 2 compartimenti distinti; Scissione della cellula nelle 2 cellule figlie.

La riproduzione dei batteri asessuata e avviene mediante la divisione di una cellula in 2 cellule figlie uguali tra loro e identiche alla progenitrice e viene definita scissione binaria, processo molto simile, ma molto piu semplice della mitosi cellulare.

Scissione binaria dellEscherichia Coli; in rosso il nucleoide e in verde il citoplasma

TEMPI DI GENERAZIONE DI ALCUNI BATTERI IN CONDIZIONI OTTIMALI DI CRESCITA BATTERIO Vibrio natriegens Bacillus stearothermophilus Escherichia coli Bacillus subtilis MINUTI 9.6 10.8 21 26

Vibrio marinus
Mycobacterium tuberculosis

81
360

Se coltivati su piastre possibile apprezzare la crescita dei batteri che da invisibili si trasformano in colonie che arrivano a 1 cm2 di superficie. La crescita non risulta per essere costante nel tempo infatti, se si analizza una colonia per un breve arco di tempo si ottiene un curva di crescita, derivante dalla relazione tra relazione tra il tempo (ascisse) e il logaritmo del numero di batteri (ordinate).

FASI DI CRESCITA BATTERICA

1) Fase di latenza
Le cellule aumentano notevolmente di dimensioni, ma non nel numero. Nelle cellule vi un aumento di RNA e ribosomi. Il DNA rimane costante.

2) Fase di accelerazione 3) Fase esponenziale

Breve periodo durante il quale le cellule iniziano a dividersi, ma non ancora a velocit costante. Periodo di tempo durante il quale la divisione cellulare mantenuta ad un ritmo costante.

4) Fase di decelerazione

Periodo in cui si ha lesaurimento delle fonti nutritive, variazioni di pH dovute alla produzione di acidi.

5) Fase stazionaria

Il numero di cellule rimane costante per linstaurarsi di un equilibrio tra le cellule che muoiono e quelle che continuano a dividersi. Esaurimento di sostanze nutritive, accumulo di prodotti tossici, diminuzione di O2 e sviluppo di un pH non idoneo. La velocit con cui le cellule vanno incontro a morte dipende da specie a specie.

6) Fase di declino o morte

COLTURE CONTINUE
Lo scopo principale di questo tipo di colture di consentire che una popolazione batterica mantenga, nella fase esponenziale, una velocit di crescita costante per un periodo di tempo indefinito.

Apparecchiatura impiegata: Chemostato

CHEMOSTATO
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ESAME COLTURALE
Lidentificazione delle colonie viene eseguita ricorrendo a colture pure derivate da ciascun tipo di colonia precedentemente isolata e si basa sullo studio di alcuni caratteri:
ASPETTO DELLE COLONIE CARATTERI MICROSCOPICI (MORFOLOGIA E CAR. TINTORIALI) CARATTERI BIOCHIMICI
Fermentazione degli zuccheri

Produzione di prodotti metabolici peculiari

Presenza/assenza di enzimi particolari

CARATTERI AG

ESAME COLTURALE
Consiste Nellisolamento dei batteri presenti in un materiale impiegando in terreni pi adatti allo sviluppo della specie di cui si desidera accertare la presenza Si usano dei terreni solidi e il materiale viene seminato per strisciamento sulla superficie dellarea di semina, ci consente di ottenere delle colonie sufficientemente distanziate per procedere poi alla loro identificazione Dalle colture isolanti, soprattutto se eseguite su terreni selettivi ed indicatori si ottengono alcune informazioni che possono orientare e sul numero di specie batteriche presenti e sulla loro identificazione Molto utili sono le caratteristiche cromatiche e laspetto delle colonie

Staphylococcus aureus su Mannitol Salt Agar

Rhodotorula rubra su Sabouraud agar