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UNIVERSIT DEGLI STUDI DI PAVIA FACOLT DI SCIENZE MM. FF. NN.

Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari della pianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman (Chiriguayusa) e saggi di Bioattivit

RELATORE: Prof. Giovanni Vidari


TESI DI LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE DI Jorge EDUARDO PONCE ZEA ANNO ACCADEMICO 2009/2010

Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari della pianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman (Chiriguayusa) e saggi di Bioattivit

1. INTRODUZIONE Lo studio effettuato per la realizzazione di questa tesi si inserisce nellambito delle ricerche condotte nel Dipartimento di Chimica Organica dellUniversit degli Studi di Pavia sui metaboliti secondari presenti nelle piante e nei funghi. Questa ricerca giustificata nellambito della Chimica Organica, giacch lisolamento e lidentificazione strutturale di nuove sostanze naturali rappresenta un importante contributo per lincremento delle conoscenze nel contesto chimico e biologico. Si pu dire che la ricerca in questo campo ancora lontana dallessere terminata nonostante gli isolamenti di centinaia di migliaia di composti in passato e gli eccezionali risultati ottenuti in quanto la scoperta di nuove specie e le continue innovazioni dei metodi di analisi, hanno ampliato il numero di composti che possono essere oggetto della ricerca. Lisolamento di nuovi composti naturali di fondamentale importanza per lindividuazione di molecole con attivit farmacologica, che possono servire come base strutturale per la progettazione di nuovi farmaci in alternativa ai farmaci di

sintesi; inoltre lidentificazione di particolari scheletri molecolari pu essere utile per studi di tipo chemotassonomico. I metaboliti secondari appartengono alla gran variet di molecole (senza eterogenee) prodotte dalle piante superiori, che possono trovare importanti applicazioni commerciali in campo farmaceutico, cosmetico, e alimentare. Questo tipo di composti sono prodotti dal metabolismo ma non sono ritenuti essenziali per la crescita, sviluppo o riproduzione dell'organismo; in questo senso sono detti "secondari". La funzione, o l'importanza, di queste sostanze normalmente di natura ecologica in quanto esse possono essere utilizzate come meccanismi di difesa contro predatori, per la competizione interspecifica o per facilitare i processi riproduttivi. Alla categoria dei metaboliti secondari vegetali appartengono gran parte dei composti utilizzati dall'uomo come stupefacenti (morfina, principali cocaina, di tetraidrocannabinolo, metaboliti ecc.). Le classi secondari aromatici o

sono: Alcaloidi, Terpenoidi, Acidi organoalifatici balsami, Saponine. In questo il scenario di ricerca delle

eteroaromatici, Fenoli, Iridoidi, Steroidi, Olii volatili, Resine e

fitochimica,

stato

fondamentale

contributo

conoscenze

tradizionali

riguardo alluso delle risorse vegetali: conoscenze che hanno un uso ampio e diverso, dal ritualistico,a quello medicinale e cosmetico. In paesi in via di sviluppo come lEcuador, queste nozioni etnobotaniche sono parte della cultura tradizionale, e

riguardano

in

molti

casi

piante

endemiche

sulle

quali

linformazione scientifica relativa ai composti e ai meccanismi dazione scarsa. Sullampia variet di piante che sono parte integrante della tradizione indigena rimane ancora tanto da studiare e le informazioni sui componenti chimici e biologici sono ancora incomplete.

Il presente lavoro una descrizione dei processi di estrazione, di isolamento e didentificazione di metaboliti secondari compiuti sulla pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman e di saggi di attivit antimicrobica.

2. METABOLITI SECONDARI Nelle piante la produzione di metaboliti secondari pu essere indotta da stress, come ad esempio le radiazioni UV, o come meccanismo di difesa verso i nemici naturali. Esistono tre grandi classi di MS: -Terpeni (29000) che derivano del lisopentenil pirofosfato. -Alacaloidi (12000) che provengono dagli aminoacidi -Fenoli (8000) che derivano dalla via metabolica dellacido Shkiminico o dalla via del malonato-acetato.

Una classificazione pi ampia divide i metaboliti secondari tra: - quelli contenenti Azoto (N): Alcaloidi, glicosilati, aminoacidi non proteici glicosidi cianogeni. -quelli non contenenti Azoto: terpenoidi e fenolici. I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione cellulare di fiori e semi, attraggono insetti impollinatori, co involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione della pianta. La maggior parte di metaboliti secondari che vengono usati come farmaci o come composti guida per la loro produzione, appartengono alle famiglie di terpenoidi, alcaloidi e flavonoidi. In particolare alcuni composti di queste famiglie sembrano avere unattivit anti-cancerogena. La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversi compartimenti cellulari. I composti idrofili vengono prodotti principalmente nel citosol. I terpenoidi e alcuni alcaloidi vengono sintetizzati nel cloroplasto. Altri alcaloidi sono sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine. Infine i metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio). La funzione dei metaboliti secondari ancora motivo di discussione. Sono stati considerati come prodotti di scarto, ma questo non spiegava i fatti inseguito elencati: - I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi e non delle piante che sono esseri autotrofi.

-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto, non si potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani. - La produzione dei metaboliti secondari strettamente regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivit regolatorie, non potendo essere cos considerati delle scorie. Si pu ritenere che le funzioni secondari siano: -Difesa: contro gli organismi erbivori, microbi o altre piante con cui competono nel loro ambiente. -Protezione: contro le radiazione UV -Riproduzione La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali nei principali dei metaboliti

diversi ecosistemi, si crede abbia generato limmensa variet biologica attuale, che implica anche una diversit chimica a livello dei composti prodotti dai diversi organismi. La produzione di metaboliti secondari nella pianta non neccesariamente costitutiva, generalmente viene indotta dalle infezioni provocate dalle ferite, rotture o attacco dei microrganismi. In alcuni casi, nella zona attorno al danno, i compartimenti cellulari, dove si trovano i precursori dei metaboliti secondari, si possono rompere rilasciandoli nel citosol, dove possono subire modificazioni chimiche operate da enzimi. Questo il caso delle mirosinasi e i glucosinolati, che quando la cellula intatta, si trovano in compartimenti separati.

Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche chimiche specifiche, il che implica processi di estrazione specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio. Dopo lestrazione e lisolamento questi metaboliti devono essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi.

3. METODOLOGIE Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa tesi sperimentale, per lisolamento e la caratterizzazione di metaboliti secondari, appartengono a tecniche utilizzate nella Chimica delle sostanze naturali. Come gi stato detto spesso i metaboliti secondari sono molto diversi, ma sono caratterizzati da comuni origini biosintetiche e da propriet chimico-fisiche che ci permettono di inglobarli in determinati gruppi. Le informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di chemotassonomia. stato detto anche che lestrazione dei metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di analisi pianificati. Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue le seguenti tappe: - Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di partenza per ottenere i cosidetti estratti totali. - Separazione dei costituenti degli estratti totali.

- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite chimiche.

analisi fisico-

La preparazione degli estratti un passaggio determinante del lavoro. Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono essere non denaturanti, anche se non si conoscono le caratteristiche apriori dei nostri metaboliti. Si possono stabilire comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il rischio di degradazione dei nostri composti. Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in quanto durante il trattamento meccanico della biomassa, vengono ai rotti dei compartimenti creando cellulari cos che possono la bassa contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche metaboliti secondari, artefatti; temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi. In seguito si filtra la parte solida, e si evapora il solvente; si ottengono cos estratti di consistenza oleosa o cerosa, che vengono conservati a -20C. In altre occasioni la preparazione dellestratto, prevede un essicamento della biomassa da utilizzare; questa operazione viene effettuata al riparo del sole, in ambiente ventilato e a temperature relativamente basse (30C). Lessicamento utile quando si stanno cercando principi attivi che devono essere attivi anche nella sua forma secca. La diversit dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con pi di un solvente o miscela di solventi, aumentando la polarit ad ogni tappa di estrazione, in seguito vengono elencati i

solventi che possono essere usati, in ordine crescente di polarit: -Esano -Cloruro di Metilene -Acetato di Etile -Metanolo -Miscela di Acqua e metanolo -Acqua Spesso gli estratti pi ricchi di molecole di interesse sono quelli di polarit media alta. Talvolta quando si vuole semplificare lestrazione, questa si fa con un solo solvente o una sola miscela di solventi, ad esempio EtOH/H20. Da questa estrazione totale comunque si dovr operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasica, che utilizza due solventi non miscibili di polarit diversa messi in un imbuto separatore, dove viene messo lestratto totale. Nellimbuto separatore si former un sistema a due fasi, una sopra laltra con un ordine che dipender dalla densit dei solventi. In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo la loro affinit con i determinati solventi. Ad esempio in un sistema a due fasi, in cui abbiamo usato Esano e Acqua, i metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase organica, mentre quelli pi polari si distribuiranno in acqua. Le procedure finora descritte riguardano unestrazione indiscriminata di tutti i metaboliti secondari, e operando in questo modo nei nostri estratti totali troveremo pi composti

da separare e caratterizzare. possiedono determinate

Tuttavia esistono procedure di chimiche. Queste

estrazione mirata o selettiva, in cui si estraggono composti che caratteristiche estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi pi selettivi, ad esempio luso di solventi acidi per separare sostanze basiche, come nel caso dellestrazione degli alcaloidi. Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per lestrazione di acidi. Si pu inoltre far ricorso anche alla distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali. Una volta ottenuti gli estratti totali, si pu procedere con i processi di separazione la tecnica e di purificazione separazione dei pi componenti. usata la Attualmente

cromatografia per ripartizione, che si basa sulla diversa affinit che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e una fase mobile. La cromatografia di ripartizione viene divisa principalmente i due grandi classi: -cromatografia di ripartizione in fase diretta. Fase stazionaria polare (gel di silice) utilizzando solventi di polarit media bassa (esano, acetato detile, cloruro di metilene) -Cromatografia di ripartizione in fase inversa. Fase

stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a polarit alta. Quando si ha una piccola quantit di miscela e si vuole ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei

componenti, si pu far ricorso alla cromatografia strumentale, come la High Performance Liquid Cromatography HPLC. Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi relativamente brevi. Eventualmente quando si ha a disposizione di composti quasi puri e in quantit sufficiente, si ricorre ai metodi di purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oli essenziali, nicotina), la ricristallizzazione e la sublimazione (canfora, caffeina). I composti puri devono essere caratterizzati e identificati, cio ne devono essere identificate la struttura chimica, la stereochimica e le principali propriet chimico-fisiche. Per lidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche, di cui le pi importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza magnetica nucleare (NMR). Le spettroscopie NMR del protone (1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di indagine a cui il composto puro sottoposto. Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale che si affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di assorbimento nellinfrarosso (IR), che permette di identificare i gruppi funzionali della molecola, la spettrometria di massa (MS), che permette di risalire al peso molecolare nonch ad altre informazioni strutturali, la spettrofotometria UV-visibile, che riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori grazie alle relative bande di assorbimento.

Attualmente, si dispone di strumenti che permettono lidentificazione dei metaboliti secondari in maniera pi veloce e affidabile, arricchendo cos le caratteristiche chimico-fisiche banche dei dati di molecole. Da metaboliti. Queste queste banche si possono consultare i dati riguardanti le conoscenze possono servire per una successiva identificazione rapida e semplice di metaboliti, o di specie nuove o di specie che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello fitochimico. Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte.

4. CONOSCENZE ETNOBOTANICHE Mi sembrato opportuno per maggiore chiarezza

presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman, o come viene chiamata in lingua Kichwa Chiriguayusa. Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia vengono usate principalmente a scopo terapeutico, come antiinfiammatorio, emolliente e tonificante. In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali che prevedono luso della Chiriguayusa. Per il recupero fisico post-parto, in 5 litri dacqua bollente si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti.

Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per una settimana. Invece, per luso anti-infiammatorio, le foglie o la

corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori. Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su eventuali aree gonfie.1

5. INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA Brunfelsia un genere di pianta

della famiglia delle Solanacee, comprendente circa 50 specie. Il genere, descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640, originario occidentali. Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella dell atropina. Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene. Sono classificate in letteratura numerose specie di dellAmerica centro-meridionale e delle Indie

Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di carattere fitochimico.

1USEFUL PLANTS OF ECUADOR, Applications, Challenges and Perspectives; pagina 293, Prima Edizione

Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati qui di seguito: In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e dellincremento del profumo ed erano state ipotizzate due soluzioni: la prima, che avvenisse per induzione del pathway metabolico dellacido shkimico; la seconda, per degradazione di antocianine. La prima ipotesi risultata la pi probabile, contribuendo in maniera importante a chiarire i processi di produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia. Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una saponina di tipo Furostano, che ha mostrato unattivit leishmanicida potente.2 Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth stata isolata una cumarina, la scopoletina, con la quale sono stati effettuati test che suggeriscono unattivit spasmolitica non specifica, associata almeno in parte allinibizione della mobilizzazione del Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti.3

2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora. Fuchino. et Al. Research Center for Medicinal Plant Resources, National Institute of Biomedical Innovation, Ibaraki,
Japan.

3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin.


Oliveira EJ, Romero MA, Silva MS, Silva BA, Medeiros IA.

Uno studio4 volto a rilevare unattivit antiofidica e antiinfiammatoria di diverse piante, ha incontrato in Brunfelsia Uniflora unattivit analgesica lieve. Brunfelsia scientifici Chirikaspi Plowman qualche non presenta studi in

precedenti,

tranne

citazione,

come

unarticolo sullutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San Agustin in Colombia.


6. 4

MATERIALI

Per le tecniche cromatografiche: Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su colonna;

LiChrospher 100 RP-18 (12 m) Merck per separazioni su


colonna a fase inversa lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka, dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm; lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18, dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm; lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm; soluzione rivelatrice per TLC, costituita da vanillina 0,5 % in acido solforico-etanolo 4:1; Per la caratterizzazione spettroscopica: spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz

4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures: possible plant hallucinogenic influence . de Rios MD. University of California, Irvine, CA, USA

1. PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie di questa pianta, nel mese di dicembre 2009 nella foresta amazzonica dellEcuador, nella provincia di Napo (Sucumbios), dove prevale un clima umido tropicale. Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di 35C. Una volta secche sono state macinate ed stata ottenuta una polvere eterogenea di circa 300g. Sono stati effettuati due processi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la met delle foglie essiccate; le due estrazioni sono state condotte a temperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventi diverse: la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 95:5 ottenendo lEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma in rapporto 70:30 ottenendo Estratto II. Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerare per dodici ore, in seguito si filtrata la parte solida ed evaporato il solvente. In questa maniera si sono ottenuti i due estratti secchi: lEstratto I del peso di 19,38 g e lEstratto II del

peso di 7,99 g. Le procedure finora descritte sono state fatte nel laboratori dellUPS in Ecuador. In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 del Dipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 ed a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione dei componenti degli estratti. Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminari su lastre TLC, in fase diretta e inversa, per verificare se esistessero differenze significative tra i due estratti.(immagine delle TLC) Da queste TLC risultato che i due estratti erano costituiti da dagli stessi composti; si quindi deciso di riunire 6 g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale. Successivamente sono state operate una serie di ripartizioni bifasiche: lEstratto Totale stato posto in 500 mL di una soluzione idroalcolica al 90% e le ripartizioni sono state effettuate utilizzando esano, acetato di etile, butanolo e acqua. Cos operando si sono ottenute quattro frazioni dallestratto totale chiamate a seconda del solvente utilizzato: Frazione esanica, Frazione in AcOEt, Frazione Butanolica e Frazione Acquosa. Alla Frazione in AcOEt stata aggiunto sodio solfato per togliere leventuale acqua che pu essersi unita al solvente; dopo che il sale stato filtrato, sono stati allontanati i solventi in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti. Sono cos state ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella 1: FRAZIONE Esanica Acetato di Etile PESO 3,156 2,52

Butanolica Acquosa
Tabella 1

6,27 2,2

Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC in fase diretta e inversa, utilizzando diverse miscele eluenti per avere unidea della composizione delle frazione ottenute. Un esempio di queste TLC sono riportate nelle fig. 1.

Figura 1

Da queste prime analisi si scelto di lavorare unicamente con la frazione in Acetato di Etile. Si deciso di sottoporre separazione cromatografica in prelevati 1,2 g di estratto ed cromatografica utilizzando 50g la Frazione Acetato di Etile a fase diretta: sono stati quindi stata allestita una colonna di gel di silice ed utilizzando

circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato detile in rapporto 3:1. Di questa frazione erano gi state individuate nelle TLC preliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nm risultano di colore rosso. Come ci si aspettava questi composti sono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed, essendo presenti in ogni estratto di pianta, sono stati scartati. Dalle TLC delle provette della colonna, hanno mostrato la presenza di un composto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in acido solforico ed etanolo diventava viola. Le provette contenenti questo composto sono state riunite in ununica frazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione del solvente aveva una massa di 256mg. TLC IN FIGURA 2 mostra le frazioni con il composto viola prima della reunione.

Figura 2

Dopo varie prove in TLC riportate in fig3,4,5 della frazione I, abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i componenti presenti nella frazione prevedono lutilizzo della

fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo ed acqua in rapporto.

Figura 3

Figura 4

stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversa per separare i 256 mg della Frazione I. Le frazioni sono state analizzate mediante TLC riportate in fig. 5 da cui risultata evidente la separazione di alcuni composti.

Figura 5

Dopo colonna sono state raccolte le frazioni simili, cercando di non contaminare le frazioni relativamente pure. Durante questoperazione si notata la presenza di particolato proveniente dalla fase inversa che era passata attraverso il setto di vetro sinterizzato della colonna; per eliminare la fase stazionaria dai campioni sono stati realizzate delle micro filtrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto in una pipetta pasteur. Sulla base delle TLC in fig.5 sembrava essere promettente il composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette

una fluorescenza blu; inoltre se TLC veniva rivelata con una soluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in questione era visibile come una macchia gialla come si vede nella TLC riportata in fig5.. Sono state raccolte le frazioni contenenti il composto che, una volta secco, era di circa 20 mg. Successivamente si deciso di purificare ulteriormente il campione mediante una micro-colonna in fase diretta con 1g di silice, e come eluente una miscela di esano ed acetato detile in rapporto 2:3, incrementando gradualmente la polarit delleluente aggiungendo gocce di metanolo. Al termine dellultima piccola colonna il campione risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche e spettrometriche. stato sottoposto ad unanalisi 1H-NMR e lo spettro riportato in fig. (#) ed ad uniniezione in LC-MS di cui riporto il cromatogramma in fig. (*)

Fig(#)

Fig. (*)

Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delle separazione cromatografiche che mi hanno portato alla caratterizzazione della isoscopoletina.

2.

CARATTERIZZAZIONE

Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna abbiamo identificato la nostra sostanza come lisomero della scopoletina: iso-scopoletina. E tramite comparazione con altri spettri 1H-NMR presenti in bibliografia labbiamo comprovato. Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo metossi con il segnale 4ppm. I segnali degli H sono riportati nella tabella2. H Segnale (ppm) 3 4 5 8
Tabella 2

6.30 7.65 6.86 6.93

Immagine della molecola isoscopoletina

Figura 6

Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione molecolare con una massa di 191.1g, la massa corrispondente alliso-scopoletina di 192.16g, il fatto che sia un grammo in meno pu essere dovuto a che probabilmente nellanalisi lisoscopoletina perda unione. In letteratura, sono pubblicati gran numero di articoli che identificano alcune attivit della scopoletina, ma non ci sono articoli relativi alliso-scopoletina. Lattivit della scopoletina e varia, da attivit antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed enzimi cellulari. La scopoletina stata isolata in Brunfelsia hopeana come era stato segnalto nelle pagine precendeti. Le cumarine, gruppo di cui fa parte la scopoletina, vengono prodotte in quasi tutte le piante. La scopoletina stata trovata in piante dei generi Scopolia, Viburnum, Artemisia, e Brunfelsia. La biosintesi della scopoletina viene riportata in seguito nella figura 7:

Figura 7

3.

SAGGI DI BIOATTIVITA

Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivit sono stati effetuati presso la Sezione di Micologia del Dipartimento di Ecologia del Territorio dellUniversit di Pavia, sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi.

Lo scopo di questi sperimenti quello di individuare possibili attivit antimicrobiche di Brunfelsia Chirikaspi Plowman, e anche nel caso di risposte positive, indirizzare posteriori lavori disolamento nelle altre frazioni. Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche: Frazione Esanica. Butanolica, in Acetato di Etile e Acquosa, sono state usate nei test di bioattivit. Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi: 2 batteri Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus, e due funghi Candida Albicans e Aspergillus niger. In esame abbiamo portato le seguenti quantit:

Fraz. Esanica Fraz. Acetato Etile

35,1 mg

0,2 ml di solv. 0,9 ml di solv.

in 15,2 mg di

Fraz. Acquosa 12,4 mg Fraz. Butanolica


Tabella 3

1,24 ml di solv. 0,12 ml di solv.

48,6 mg

I campioni sono stati sciolti in cicloesano (F.Hex), acqua (F.acquosa) e metanolo (F. Acetato di etile e butanolica), nella minor quantit di solvente possibile, per non sorpassare le concentrazione alcoliche che possono tollerare i microrganismi. Lo sperimento stato effettuato nella maniera in seguito descritta.

Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del terreno liquido, opportuno per ogni microrganismo, LB per i batteri e Sabouraud per i funghi. Loperazione di riempimento delle piastre stata compiuta con lausilio di una cappa a flusso laminare verticale in modo da conservare le adeguate condizioni di sterilit.

stato decisso di fare prove dei campioni a diverse concentrazioni, per ogni microrganismo:

-0.25 mg/ml -2 mg/ml -1mg/ml -0.5 mg/ml -0.125 mg/ml -0.061mg/ml -0.036 mg/ml

Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i diversi estratti sono state organizzate per ogni microrganismo e con i rispettivi controlli cos:

F Esanica
2mg/ml 1mg/ml 2mg/ml 1mg/ml 2mg/ml 1mg/ml

C F Butanolica
C C

C F AcOEt
2mg/ml 1mg/ml
C C

C
2mg/ml 1mg/ml
C C

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

Tabella 4

Cs: Controllo della concentrazione del solvente. La frazione acquosa stata fatta in altri due piastre, alle stesse concentrazioni e con gli stessi microrganismi. Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le concentrazioni riportate. Dalla soluzione di 2mg/ml sono state fatte delle diluizioni seriali, in modo da ottenere quelle meno concentrate, alla fine ogni pozzetto conteneva un volume tra terreno e campione di 200 L. I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi prima nominati, con una quota di 1L per pozzetto. opportuno ricordare che queste procedure sono state effettuate in condizioni di sterilit. Le piastre sono state incubate per 24 ore, a una temperatura di 24C.

4. RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVIT Dopo un giorno d incubazione, abbiamo visto le piastre, non c stata alcuna inibizione nelle piastre che contenevano la frazione acquosa. Delle altre piastre i risultati vengono riportati. Candida Albicans, quando non c stata crescita stato segnalato col colore rosso.
F Esanica
2mg/ml 1mg/ml 2mg/ml 1mg/ml 2mg/ml 1mg/ml

C F Butanolica
C C

C F AcOEt
2mg/ml 1mg/ml
C C

C
2mg/ml 1mg/ml
C C

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

2mg/ml 1mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

Tabella 5

Bacillus Subtilis
F Esanica
2mg/ml 2mg/ml 2mg/ml

C F Butanolica
C

C F AcOEt
2mg/ml
C

C
2mg/ml
C

2mg/ml

2mg/ml

2mg/ml

2mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

1mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 5mg/ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 25mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 12mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

. 06mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

. 03mg/ ml

C S

Tabella 6

In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati positivi.

5. CONCLUSIONI. Nel presente lavoro stata presentata la pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellambito della ricerca di cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali. Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione dai suoi precendeti etnobotanici, ha dimostrato di avere composti come lisoscopoletina che possono esplicare attivit di uso farmacologico. Su portato Brunfelsia a isolare sono e a stati effetuati la lavori di

estrazione, isolamento e caratterizzazione che ci hanno caratterizzare molecola isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile. I saggi di bioattivit..... Con questo lavoro le potenzialit di Brunfelsia Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione, il lavoro su Brunfelsia C. Plowman ancora lungo, ma si spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano come punto di partenza per lavori succesivi.

INDICE
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 11. INTRODUZIONE................................................................................................2 METABOLITI SECONDARI..................................................................................4 METODOLOGIE.................................................................................................6 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE.....................................................................10 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA......................................................11 MATERIALI......................................................................................................13 PROCEDURA SPERIMENTALE..........................................................................14 CARATTERIZZAZIONE.....................................................................................20 SAGGI DI BIOATTIVITA...................................................................................22 CONCLUSIONI..............................................................................................29