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Coltivazione dei batteri Fattori influenzanti la crescita Identificazione dei microrganismi

Giovanni Di Bonaventura B.Sc., Ph.D.

Terreni di coltura
Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale pu avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica adeguato grado di umidit reazione (pH) adatta sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

Contenuto qualitativo

Terreni di coltura
(1 di 2)

Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.) NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessit osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari Estratti di lievito, carne, dorgano: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

Contenuto qualitativo

Terreni di coltura
(2 di 2)

Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la crescita di batteri pi esigenti dal punto di vista nutrizionale Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide) Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di pH

Terreni di coltura
Classificazione
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In base allo stato fisico: Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati. Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

Terreni di coltura
Classificazione
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In base alla costituzione chimica:


Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantit note. Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantit note. Terreni COMPLESSI: ignota lesatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.

Terreni di coltura
Classificazione
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In base alla funzione:


Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai pi breve rispetto ad altre specie microbiche. Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per lisolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

Tecniche di semina per isolamento

Terreni di coltura

Semina per isolamento

Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (1 di 3)


Cetrimide Agar: Terreno selettivo per lisolamento e lidentificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P. aeruginosa resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi. Columbia Blood Agar Base: Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella). Hektoen Enteric Agar: Terreno differenziale e selettivo per lisolamento di Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)

Cetrimide Agar

Columbia Blood Agar Base

Hektoen Enteric Agar

Salmonella: colonie nerastre Shigella: colonie incolori

Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (2 di 3)


MacConkey agar:
evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacit fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).

Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar:


non selettivo, per la crescita e tests di sensibilit degli anaerobi.

Urea broth base (terreno di Christensen):


evidenziazione attivit ureasica delle Enterobacteriaceae mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).

MacConkey agar
A B

A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli

Urea broth base

Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (3 di 3)


Mannitol Salt Agar:
Terreno selettivo per lisolamento di stafilococchi presunti patogeni. Azione selettiva dellelevata [NaCl]. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.

Mueller-Hinton agar:
per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilit.

Saboraud Dextrose Agar:


terreno acido indicato per lisolamento di diversi funghi e lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida nonalbicans (colonie rosa scuro/rosse).

Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):


terreno selettivo e differenziale per lisolamento di Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.

Mannitol Salt Agar

Sabouraud Agar

Salmonella Shigella Agar (SS-agar)


Salmonella typhimurium

Salmonella dublin

Fattori influenzanti la crescita


Crescita vs Tolleranza

(1 di 6)

Crescita generalmente indica lacquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni non permissive per la loro crescita. Il suffisso -fili viene spesso usato per descrivere le condizioni permissive per la crescita, mentre il termine tollerante descrive le condizioni in cui il microrganismo sopravvive, ma non necessariamente cresce. Ad esempio, un batterio termofilo cresce in presenza di elevate temperature, mentre un batterio termotollerante sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori.

Fattori influenzanti la crescita


Obbligato (stretto) vs facoltativo

(2 di 6)

Obbligato (o stretto) indica che una data condizione necessaria per la crescita batterica. Facoltativo indica che il microrganismo pu crescere in quella condizione, sebbene non necessaria. Il termine facoltativo viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali. Ad esempio, un termofilo obbligato necessita di elevate temperature per la sua crescita, mentre un termofilo facoltativo pu crescere ad alte temperature ma anche a temperature pi basse.

Fattori influenzanti la crescita


Temperatura
La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20C, esibendo la massima velocit di crescita ad un certo optimum termico Psicrofili: ~0 20C Mesofili: ~10 50C Termofili: ~40 75 C Ipertermofili: ~70 110 C

(3 di 6)

Fattori influenzanti la crescita


Temperatura

Fattori influenzanti la crescita

(4 di 6)

pH
Acidofili:
crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 6, generalmente) funghi e lieviti (pH 5 - 6) crescono tra pH 6 8 maggior parte dei batteri crescono a pH > 8 (pH 8 9.5, generalmente)

Neutrofili:

Alcalofili:

Fattori influenzanti la crescita

(5 di 6)

Concentrazione salina (pressione osmotica)


Alofili:
crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche; stafilococchi

Fattori influenzanti crescita vivono solo in presenza di la O


Batteri AEROBI OBBLIGATI Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI Batteri ANAEROBI OBBLIGATI Batteri MICROAEROFILI
2 2

vivono in presenza/assenza di O2

(6 di 6)

Ossigeno (O 2)vivono in assenza di O


Aerobi obbligati Aerobi facoltativi Anaerobi obbligati

vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

Terreni particolari per lisolamento di agenti eziologici poco frequenti


Origine prelievo Feci Diagnosi presuntiva Colera Batteri patogeni Terreni per l'isolamento Acqua peptonata alcalina TCBS Agar sangue cioccolato o agar Casman Agar Loeffler Agar Tinsdale Terreno al tellurito di sodio

Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae

Faringe

Infiammazione ostruttiva epiglottide e faringe

Faringite membranosa

Corynebacterium diphteriae

Terreni particolari per lisolamento di agenti eziologici poco frequenti


Origine prelievo Tampone rinofaringeo Escreato Diagnosi presuntiva Pertosse Tubercolosi Micosi polmonare Urina Sangue, midollo osseo o biopsia Leptospirosi Brucellosi Batteri patogeni Terreni per l'isolamento Bordet-Gengou alla patata LowensteinJensen Middlebrook 7H11 Brain-heart Infusion agar Semisolido di Fletcher Agar brucella

Bordetella pertussis Mycobacterium tuberculosis Blastomyces dermatitidis Leptospira spp. Brucella spp.

Terreni per lisolamento degli anaerobi da campioni patologici (1 di 2)


Terreno Agar sangue (AS) Agar cioccolato (AC) Scopo Terreno in piastra non selettivo di uso generale Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-

Agar MacConkey (MAC) Agar sangue feniletil alcool (PEA)

Terreni per lisolamento degli anaerobi da campioni patologici (2 di 2)


Terreno Agar sangue kanamicinavancomicina (KV) Terreno al tioglicolato (BBL-0135C) + emina + vitamina K1 (THIO) Terreno di Thayer-Martin modificato (MT) Scopo Isolamento selettivo di bacilli anaerobi GramBrodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione scarso Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis

Anaerobiosi
Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi

Figure 6.5

Carbossifilia

(5% O2, 10% CO2, 85% N2)

Giara con candela

Sistemi per generazione di carbossifilia (CO2-packet)

Figure 6.7

Identificazione dei microrganismi


1. 2.

Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Caratteristiche macroscopiche (colturali)


Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

3. 4. 5. 6.

Caratteristiche biochimiche Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Tipizzazione fagica Identificazione genotipica

tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilit), etc. crescita su terreni selettivi

Aspetto macroscopico delle colonie


Forma
puntiforme
circolare filamentosa rizoide irregolare
irregolare, a filo intrecciato irregolare, ramificata d < 1 mm

ID dei microrganismi
(1 di 2)

Rilievo
effuso
piatto sopraelevato convesso umbonato

sottile, allungato

Aspetto macroscopico delle colonie


Superficie Margine
intero
ondulata

ID dei microrganismi
(2 di 2)

liscia
rilevata radiata concentrica rugosa
anelli concentrici raggrinzita

ondulato eroso filamentos o arricciato

Aspetti macroscopici (emolisi)

ID dei microrganismi

Streptococcus spp Staphylococcus spp

Aspetti macroscopici (fermentazione)

ID dei microrganismi

Staphylococcus spp

Aspetti macroscopici (sciamaggio)

ID dei microrganismi

Proteus mirabilis

Caratteristiche biochimiche
Enterobacteriaceae, in particolare:
capacit di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio
acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)

ID dei microrganismi

presenza di particolari enzimi


ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi, ureasi

produzione di specifici prodotti metabolici terminali capacit di fermentare particolari zuccheri (O-F test)
1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan (produzione di gas) H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)

Caratteristiche biochimiche

ID dei microrganismi

API (bioMrieux) Identification System

ID dei microrganismi
Caratteristiche antigeniche
Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante inoculazione di microrganismi nella cavia Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione
colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico

reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi

Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)

Agglutinazione

Ag Ag

Ag Ag

Ag

Ab

ID dei microrganismi
Tipizzazione fagica Una singola specie pu comprendere ceppi diversi (sottospecie o tipi) Impiego di batteriofagi a fini identificativi
esempio: tipizzazione di S. aureus
estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi virulenti (litici) sensibilit non uniforme (stipite-specifica) individuazione di tipi fagici

Utile ai fini epidemiologici (studio delle modalit di diffusione dellinfezione)

Tipizzazione fagica

ID dei microrganismi
Identificazione molecolare

Polymerase Chain Reaction


amplificazione di sequenze bersaglio, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico elevata sensibilit (necessit di poche copie del target di partenza) e specificit. sequenziamento genico (genotipizzazione)

RNA ribosomale
grandi quantit di rRNA altamente conservate in specie differenti; presenza di sequenze di rRNA specifiche per specie e tipo. Lamplitudo della differenza nellrRNA di due batteri rivela quanto filogeneticamente vicini essi siano: piccole differenze in rRNA sono suggestive per una vicinanza tra le specie, mentre grandi differenze indicano che le specie sono pi distanti tra loro. Lindividuazione di un pattern in rRNA che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

ID dei microrganismi
Identificazione molecolare