Tecniche di

arricchimento e
isolamento delle
colture batteriche
 Come si studiano i microrganismi isolati
dall’ambiente

 Isolare in coltura pura i vari microrganismi presenti

nella comunità microbica ed identificarli.

 Studiare l’influenza, sulla crescita del microrganismo,

di diversi fattori ambientali (calore, pH, pressione
idrostatica, radiazioni, pressione d’ossigeno, altri
organismi), modificando in laboratorio una variabile per volta.

E’ molto importante indagare il rapporto che ogni specie

microbica ha con il suo habitat fisico, chimico e biologico
(ecologia microbica), per controllare i microrganismi in campo
bio-medico (terapia), ambientale (biorisanamento) e industriale
(alimenti e fermentazioni).
Schema generale della procedura di arricchimento,
isolamento e identificazione delle colture batteriche

Ia FASE. Arricchimento e isolamento

FONTE (ARRICCHIMENTO) ISOLAMENTO PER

PIASTRAMENTO
Scelta e possibili Di solito selettivo. Di solito selettivo o
pretrattamenti selettivo-differenziale

IIa FASE. Lavoro con colture pure

COLTURE CARATTERIZZAZIONE
STOCK E IDENTIFICAZIONE
 La scelta della fonte

Per individuare e isolare particolari

microrganismi dall’ambiente sfruttiamo
le nostre conoscenze riguardo le loro
caratteristiche nutrizionali, esigenze di
temperatura, produzione di particolari
metaboliti, etc.
Fonti preferenziali di particolari microrganismi

Le conoscenze delle caratteristiche ecologiche,

fisiologiche e metaboliche dei microrganismi ci
permettono di individuare alcune fonti preferenziali,
per alcuni di essi.

 dal latte andato a male si può isolare

facilmente lo Streptococcus lactis,
 dal formaggio svizzero il Propionibacterium,
 dalla frutta l’Acetobacter,
 dalle feci lo Streptococcus fecalis,
 dal mosto in fermentazione o dal vino il lievito
Saccharomyces cerevisiae.

Questi ambienti sono equivalenti a terreni di

arricchimento.
Perché continuiamo ad isolare gli stessi
microrganismi, spesso dalla stessa fonte?

Indagare e sfruttare la biodiversità microbica,

anche quella intraspecifica.

La scelta del terreno di coltura

Più informazioni si hanno sulle

proprietà di un microrganismo,
maggiore è la probabilità di arrivare a
definire un terreno di coltura adatto al
suo isolamento e mantenimento in
laboratorio.
 Selezione per arricchimento

L’isolamento di specifici tipi microbici è

facilitato dall’utilizzo di colture di
arricchimento (o colture selettive).
Le colture di arricchimento utilizzano
combinazioni di nutrienti e condizioni
fisiche che soddisfano particolari esigenze
nutrizionali o fisiche (temperatura, pH,
disponibilità di ossigeno, pressione
osmotica) del tipo microbico d’interesse.
 L’origine storica delle colture di arricchimento:
Beijerinck
Isolamento del batterio azoto-fissatore aerobico Azotobacter.

Terreno selettivo
privo di fonti
di azoto

Terreno non
selettivo
 L’origine storica delle colture di arricchimento:
Winogradsky
Alla fine del XIX secolo, Winogradsky notò che, applicando
condizioni di crescita equivalenti a campioni diversi di suolo o acqua,
si evidenziava una tendenza a produrre la crescita, fra tutti i
microrganismi presenti, di alcuni specifici tipi batterici,
fisiologicamente simili.
La tecnica utilizzata da Winogradsky

Cambiando la fonte di carbonio, cambiano i tipi microbici.

 La colonna di Winogradsky
Una colonna di vetro riempita con fango ricco di sostanza organica e solfuri, a cui
vengono aggiunti substrati carboniosi diversi.
La scelta dei substrati determina quali microrganismi prevarranno.
Il cilindro viene riempito con acqua (lago, stagno, fossato, mare), coperto e lasciato
indisturbato alla luce per diverse settimane per permettere la crescita dei
microrganismi presenti nel materiale utilizzato.

Foglio di alluminio

Acqua Alghe e cianobatteri

Batteri purpurei non sulfurei

Fango con
Crescite di batteri
nutrienti purpurei e sulfurei verdi
organici e
Decomposizione anossica
CaSO4 e riduzione del solfato
 Isolamento di attinomiceti

Negli anni ’50 vennero isolati migliaia di

attinomiceti produttori di agenti
antibatterici, antivirali e antitumorali.

Campioni di suolo, concime organico, acque

dolci o atmosfera venivano inoculati in
terreni solidi a basso contenuto di
zuccheri per limitare la crescita di generi
mobili a crescita rapida e facilitare la
formazione di colonie di organismi a
crescita lenta come gli attinomiceti.
I limiti delle colture di arricchimento

L’organismo più adatto al particolare insieme

di condizioni di coltura che sono state scelte
prende il sopravvento sugli altri membri della
comunità e diventa l’organismo dominante.

Questo microrganismo potrebbe essere solo

un membro minoritario e di rilevanza
ecologica ridotta dell’ecosistema microbico in
esame.

Spesso, per eliminare componenti microbiche

minoritarie ma a crescita rapida, il campione
ambientale viene diluito prima dell’inoculo in
terreno arricchito.
Procedura generale di arricchimento
in batteri aerobi o anaerobi

Bisogna individuare una nicchia

ambientale le cui condizioni sono
favorevoli al microrganismo ricercato, per
esempio:

- suolo per gli aerobi

- fango per gli anaerobi

 Arricchimento aerobico
Isolamento di microrganismi capaci di crescere aerobicamente su benzoato come
unica fonte di C e di energia.
Senza arricchimento Campione Con arricchimento
(acqua o suolo)
1 ml
o
1 ml
o
inoculo in
1g 1g
terreno
Diluizione + benzoato
in acqua

isolamento
piastramento
0,1 ml 0,1 ml

+ benzoato + benzoato
Risospensione
colonie isolate Piastra da
procedura di
arricchimento

isolamento
Piastra con
materiale non
arricchito
 Arricchimento anaerobico
Isolamento, dal fango di uno stagno poco profondo, di microrganismi fotosintetici
anaerobi resistenti a brevi esposizioni a bassi livelli di ossigeno.
fango Sviluppo colore Inoculo in 9 ml di
luce porpora terreno riducente
(anaerobiosi)
con agar liquefatto
Bottiglia con
terreno di coltura
con sali inorganici Serie di
e glicerolo, 1 ml
diluizioni 1:10
chiusa con tappo nello stesso terreno
di vetro e in agar liquefatto

NaHCO3 CO2
Glicerolo accettore di elettroni

Provette sigillate con cera

Crescita a e esposte alla luce
colonie
Metodi selettivi di arricchimento per specifici
tipi metabolici

Per ottenere l’isolamento di

microrganismi di un particolare
tipo metabolico:

 chemioeterotrofi
 chemioautotrofi
 fototrofi

è necessario creare condizioni più

restrittive/selettive.
Tecnica di arricchimento per l’isolamento di
termofili anaerobi

Se, tra i molti microrganismi presenti

nel suolo, cerchiamo termofili
anaerobi, possiamo incubare del
terriccio a 60°C in condizioni
anaerobiche.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento
di microrganismi azotofissatori anaerobi

L’eliminazione di prodotti azotati da un

terreno di coltura, rende impossibile lo
sviluppo di tutti i microrganismi tranne
gli azotofissatori.

L’esclusione di ossigeno dall’ambiente

di coltura impedisce la crescita di
microbi aerobi.

Con l’esclusione di ossigeno e composti

azotati, si svilupperanno solo i batteri
azotofissatori anaerobi.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento
di microrganismi acido-tolleranti

Una selezione per arricchimento in

microrganismi acido-tolleranti
può essere fatta portando il pH del
terreno a 4; si impedisce così la
crescita della maggior parte dei
batteri e nel contempo si favorisce lo
sviluppo di una flora microbica
acido tollerante composta per lo più
da lieviti e muffe.
 La tecnica di arricchimento per
l’isolamento di microrganismi produttori
di enzimi idrolitici

Piastra contenente 1 % amido

La tecnica di arricchimento per l’isolamento
di batteri di interesse caseario

Se un terreno preparato con

lattato di sodio come unica
fonte di carbonio e di energia,
si avrà lo sviluppo preferenziale
di microrganismi come
Propionibacterium (formaggio
Emmenthal).
 Altri metodi di selezione batterica

 Selezione per inibizione

 Selezione differenziale

Le procedure di selezione per arricchimento,

per inibizione e differenziale possono anche
essere combinate tra loro per facilitare
l’isolamento dei tipi microbici d’interesse.
 Selezione per inibizione

Se aggiungiamo al terreno di
coltura sostanze chimiche selettive,
che possano eliminare
microrganismi che interferiscono
con la crescita del microrganismo
di interesse, si parla di selezione da
inibizione.
 Isolamento di batteri acido-lattici
mediante selezione per inibizione

L’azide è un inibitore della crescita batterica in

quanto agendo sulla citocromo c ossidasi inibisce la
respirazione.

Introducendo azide in un terreno di coltura nutritivo

che contiene un carboidrato fermentabile come fonte
di energia si arricchisce in batteri acido lattici che non
possiedono citocromi e sono quindi insensibili
all’azide.
 Selezione per inibizione

Il feniletanolo è un batteriostatico specifico per i batteri Gram-

negativi.
Il terreno di coltura Feniletanolo Agar può essere usato per isolare
selettivamente batteri Gram-positivi.

E. coli Proteus mirabilis

Streptococcus pneumoniae Staphilococcus aureus

Enterococcus faecalis

Feniletanolo Agar
 Selezione differenziale

Un microbo può essere isolato

semplicemente rendendolo più
facilmente riconoscibile, una procedura
che viene detta differenziale.
La selezione differenziale utilizza
spesso molecole indicatore.
La presenza nel terreno solido di
particolari indicatori facilita
l’identificazione e isolamento del
microrganismo di interesse.
 Microrganismi utilizzatori di urea

Per isolare un microrganismo in grado di

idrolizzare l’urea possiamo utilizzare piastre di
terreno solido contenenti urea e un indicatore di
pH. Tra le colonie che si svilupperanno, quelle
che formano ammoniaca dall’idrolisi dell’urea
saranno individuate da un cambiamento di
colore dell’indicatore.
Microrganismi che fermentano il cellobiosio

Batteri cellobioso-fermentanti cresciuti

su piastre con cellobiosio come unica
fonte di carbonio in un terreno
agarificato contenente un indicatore di
pH, verranno identificati grazie alla
variazione di colore determinata dalla
produzione acida durante la loro
crescita.
 Selezione per inibizione e differenziale: EMB
Il terreno Eosina Metilene Blue (EMB) agar è un terreno sia selettivo che differenziale.
Infatti, i coloranti eosina e blue di metilene inibiscono la crescita dei batteri gram-positivi con
selezione dei gram-negativi; allo stesso tempo, la presenza di lattosio permette la
differenziazione dei gram-negativi in base alla loro capacità di fermentare questo zucchero.

1: 1 Escherichia coli, gram-negativo, non è

inhibito. Il colore metallico verde brillante
indica la capacità di E. coli di fermentare
il lattosio producendo acidi forti.
2: 2 Pseudomonas aeruginosa, gram-negativo,
non è inhibito. L’assenza di colorazione
indica che P. aeruginosa non è capace di
fermentare il lattosio.
3: 3 Enterobacter aerogenes, gram-negativo,
non è inhibito. Il colore rosa indica che E.
aerogenes è capace di fermentare il
lattasio producendo acidi deboli.
4: 4 Staphylococcus aureus, gram-positivo, è
inibito da eosina e blue di metilene.
 Selezione per inibizione e differenziale: MSA

Cosa è il terreno MSA.

Il mannitolo salt agar (MSA), è un terreno
selettivo e differenziale.  MSA è selettivo
perché contiene una concentrazione di sale
(7.5%) che promuove la crescita di alcuni
organismi mentre scoraggia quella di altri.  MSA
è differenziale perché contiene lo zucchero
mannitolo e l’indicatore di pH rosso fenolo.

Come funziona il terreno MSA.

I microrganismi che fermentano il mannitolo
producono cataboliti acidi, che causano un
viraggio di colore.  Infatti, il rosso fenolo è
rosso ciliegia sopra pH 8.5, giallo-rosso tra pH
6.9 e 8.5, e giallo brillante a pH 6.9 o più basso. 

Come viene utilizzato il terreno MSA.

MSA viene utilizzato per distinguere il batterio patogeno Staphylococcus aureus da
quello non-patogeno S. epidermidis. Infatti, sebbene entrambi possono tollerare l’alta
concentrazione salina del terreno MSA, solo S. aureus può fermentare il mannitolo,
causando il viraggio dell’indicatore da rosso a giallo.
Keen.mht