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12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario

Determinazione dei batteri lattici nei prodotti


lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche

Angiolella Lombardi
Veneto Agricoltura
Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari

MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012

Il ruolo positivo dei batteri lattici


nella produzione di latti fermentati

 Acidificazione (fermentazione lattica)

 Produzione di acetaldeide
 Produzione di polisaccaridi

- Batteri lattici con caratteristiche probiotiche

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Il ruolo positivo dei batteri lattici
nella produzione di formaggi
• Acidificazione (fermentazione lattica)

• Produzione di enzimi che agiscono su:

 Proteine-peptidi-aminoacidi
 (lipidi) Maturazione prodotto,
 Altre componenti caratteristiche
organolettiche -
(es. citrato)
nutrizionali

Batteri lattici Batteri lattici


starter non starter
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Aspetti negativi legati allo sviluppo di batteri lattici


nei formaggi

 Produzione di gas (batteri lattici eterofermentanti,


occhiatura eccessiva, gonfiori)

 Produzione di amine biogene (tiramina, istamina)

 Produzione di sapori anomali (peptidi amari)

 Acidificazione eccessiva-gessatura

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BATTERI LATTICI
Caratteristiche generali
 Batteri Gram positivi
 Ubiquitari
 Morfologia differente: bacilli/cocchi
 Non sporigeni
 Acido tolleranti e talvolta acidofili
 Temperatura ottimale di crescita: ampio range (termofili/ mesofili)
 Catalasi negativi (eccetto alcune specie genere Pediococcus )
 Molto esigenti nutrizionalmente
 Non patogeni (gruppo 1, tranne L. rhamnosus ed enterococchi che
rientrano in gruppo 2)
 Anaerobi (aerotolleranti)
 Metabolismo fermentativo (omofermentanti, eterofermentanti)

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Principali generi/specie di batteri lattici settore lattiero-caseario


Microrganismo Morfologia Fermentazione Temperatura Applicazioni

Streptococcus Cocchi Omolattica Termofili Formaggi, latti


thermophilus fermentati

Lactococcus Cocchi Omolattica Mesofili Formaggi, burro


lactis

Enterococchi Cocchi Omolattica Mesofili, Formaggi* (no QPS)


termodurici

Pediococchi Cocchi a Vegetali fermentati,


tetradi Omolattica Termofili insaccati,
maturazione
formaggi
Leuconostoc Cocchi Eterolattica Mesofili Burro, vegetali
fermentati, paste
acide
Lactobacilli Bastoncini Omolattica Mesofili. Formaggi, latti
Eterolattica termofili ferm., insaccati,
paste acide, vegetali
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Perchè cercare i batteri lattici nei prodotti lattiero
caseari?
 Requisiti di prodotto (es S. thermophilus,
L. delbrueckii subsp. bulgaricus yogurt)
 Requisiti certificazioni ( es. Mozzarella
STG)
 Controllo qualità colture starter (inclusi
sieroinnesti/lattoinnesti)
 Monitoraggio probiotici (L. acidophilus, L.
rhamnosus, L casei/paracasei,
Bifidobacterium*)
 Conteggio LAB responsabili difetti (es
eterofermentanti obbligati, enterococchi)

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Conteggio batteri lattici – Metodi normati

Microrganismo Metodo Campo


applicazione
S. thermophilus ISO 7889-IDF117: Yogurt
2003

Lactobacillus ISO 7889-IDF117: Yogurt


delbrueckii subsp. 2003
bulgaricus

Lactobacillus ISO 20128-IDF292: Latti fermentati e non


acidophilus 2006 fermentati, latte in
polvere
Batteri lattici mesofili ISO 27205-IDF149: Colture starter per
e termofili (diverse 2010 prodotti fermentati a
specie e generi) base di latte (no
probiotici)

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Conteggio batteri lattici – Metodi normati

Microrganismo Metodo Campo


applicazione
Enterococchi CCFRA Met. Alimenti , inclusi prodotti
2.2.1:2007 lattiero caseari , mangimi

Bifidobatteri (NB non ISO 29981- Latti fermentati e non


LAB) IDF220: 2010 fermentati, latte in
polvere, formulazioni per
l’infanzia,colture starter
Leuconostoc (FIL149A:1997) Colture starter

Batteri lattici citrato ISO17792-IDF Colture starter e


fermentanti 180 : 2006 prodotti lattiero caseari
(Leuconostoc, Lc.lactis in cui sono presenti
cit+) lattici citrato ferm.

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Streptococcus thermophilus
Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003
Norma titolo Yogurt - Enumeration of characteristic
microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di Streptococcus thermophilus
Mezzo di coltura M 17, pH 6.8 dopo sterilizzazione (consigliabile
aggiungere il lattosio dopo sterilizzazione)
Inoculo inclusione
Atmosfera aerobiosi
incubazione
Incubazione 37+/-1°C x 48 h
Lettura colonie colonie lenticolari del diametro di 1-2 mm.
Conferma colorazione gram (+, forma coccica del diametro
di 0.7-0.9 micron in coppia o a catena) e catalasi
(neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)
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Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003


Norma titolo Yogurt- Enumeration of characteristic
microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Mezzo di coltura MRS acid. pH 5.4 con acido acetico
Inoculo inclusione
Atmosfera anaerobiosi
incubazione
Incubazione 37+/-1°C x 72 h
Lettura colonie colonie lenticolari, spesso a forma laminare del
diametro di 1-3 mm
Conferma colorazione gram (+, bastoncini, generalmente
corti) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)

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ISO 20128-IDF192:2006
Milk Products – Enumeration of presumptive Lactobacillus
acidophilus on a selective medium-Colony count technique at 37°C

Conteggio di Lactobacillus acidophilus


Mezzo di coltura MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin

Inoculo spatolamento
Atmosfera incubazione anaerobiosi
Incubazione 37°C x 72 +/-3 h
Lettura colonie colonie piatte opache
grigio biancastre
bordi irregolari

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ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products – Bacterial
starter cultures – standard of identity

Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattiero


caseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri)

Microrganismo Metodo
L.delbrueckii subsp. MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003
bulgaricus
L. acidophilus MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292:
2006

S. thermophilus M17 pH6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003

Lattococchi M17pH7,2, come da ISO 7889 incubato in


aerobiosi a 30 °C per 72 ore
Colture miste S. S.thermophilus : M17pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h
thermophilus - Lattococchi M17pH7,2 20 °C aerobiosi 5 g
lattococchi
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CCFRA Method 2.7.1:2007


Enumeration of presumptive Enterococcus
species:colony count technique
Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchi
negli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,-
esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB)

KAA inoculo per spreading,


37 °C per 24 h ± 4 h

Necessaria conferma

Sodio azide e kanamicina


agenti selettivi

Esculina agente differenziale


Colonie bianche o grigie circondate
da un alone nero da confermare
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ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of
presumptive bifidobacteria-Colony count technique at 37 °C

TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) e


galatto-oligosaccaridi (TOS)
 Inoculo per inclusione, incubazione 37 ° C per 72 h in anerobiosi

Litio e mupirocina inibiscono


crescita S. thermophilus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus, L.
acidophilus, L. casei, L.
rhamnosus, Lactococcus lactis,

Galatto-oligosaccaridi (TOS)
favoriscono sviluppo dei
bifidobatteri

Colonie bianche piccole da


confermare
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FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures


de bactéries lactiques. Norme de composition
Leuconostoc
MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker),
 Inoculo per spreading, incubazione a 22 °C per 4-5 g in aerobiosi
.

Sodio azide del terreno


inibisce batteri Gram - e
lattococchi

Saccarosio favorisce
formazione destrani.

L. mesenteroides dextranicum forma


colonie mucose, gelatinose, altri
Leuconostoc formano colonie piccole
incolori
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ISO17792-IDF180:2006
Milk, milk products and mesophilic starter cultures –
Enumeration of citrate fermenting bacteria.Colony
count technique at 25 °C
Microrganismi interessati:
 Lactococcus lactis subsp. lactis cit + Terreno di Nickels e
 Leuconostoc mesenteroides subsp. Leesment, contenente citrato
mesenteroides, cremoris, e calcio lattato, incubato a 25
dextranicum °C in aerobiosi per 72 h. Dopo
incubazione viene aggiunto X-
 Leuconostoc lactis
gal, ulteriore incubazione per
24 ore

Citrato fermentanti presentano Lactococcus colonie bianche


alone attorno alla colonia
Leuconostoc colonie blu

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Altri batteri lattici


L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarum
NSLAB formaggi Latti fermentati, probiotici

MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml)


Incubazione 30 °C , anaerobiosi, 72 h.

In questo terreno possono sviluppare


anche pediococchi e Leuconostoc

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Batteri lattici eterofermentanti
Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo ed
eterofermentanti in base alla differente acidificazione del
fruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo.

Dopo incubazione 30 °C per 72 h i batteri omofermentanti


crescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti con
colonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggio
del verde bromocresolo)

In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti:


MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo di
colonie
Leuconostoc: MSE 22°C per 4-5 g

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Metodi di controllo sieroinnesti-Criticità


-2-8 x 108 ufc/ml
-dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversi
biotipi Caratteristiche
-L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis sieroinnesti
-L. fermentum (eterofermentante)
-Talora presenza di S. thermophilus

MRS acidificato?
MRS + casaminoacids?
Agar siero?

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Metodi controllo lattoinnesti naturali-criticità
Microrganismo Metodo Campo Terreno
applicazione

S. thermophilus ISO 7889- Yogurt M17 agar, aerobiosi a 37


IDF 117: °C per 48 ore
2003
Colture miste S. ISO 27205 Colture S.thermophilus : M17
thermophilus - - IDF starter pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h
lattococchi 149:2003 termofile

Risultati molto variabili in funzione di:

Brand commerciale terreno


Modalità di aggiunta del lattosio
Temperatura di incubazione
Aggiunta di ulteriori “ingredienti” (latte peptonizzato)

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E i probiotici?
Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L.
acidophilus, Bifidobacterium lactis
S. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003
B. lactis ISO 29981- IDF 220: 2010
L. acidophilus ISO 20128-IDF 292: 2006

L. delbrueckii subsp. bulgaricus ?


ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale
L. bulgaricus-L. acidophilus
Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie?
Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146?
Conferma mediante PCR?

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Conclusioni
 Sono disponibili diversi metodi per il conteggio di
batteri lattici.
 Tuttavia, data la complessità di questo gruppo
microbico e la presenza in uno stesso alimento di più
generi/specie permangono delle criticità
 Adattamento del metodo in funzione del prodotto
 Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali
 Sviluppo di metodi che consentano di individuare
gruppi di batteri lattici con attività potenzialmente
negative (es. proteolitici,, eterofermentanti
obbligati)?

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