TERRENI DI COLTURA

• I primi tenta+vi di coltura delle cellule sono sta+ esegui+ in terreni naturali
basa+ su estra5 di tessuto e fluidi corporei, come estra8o di embrioni di
pollo, plasma, siero e linfa
• Problemi di ripe++vità
 TERRENI DI COLTURA
• Con l'introduzione di linee cellulari propagate (HeLa ecc.) e la
diffusione del loro uso tra molti laboratori, la richiesta di quantità
maggiori di un mezzo di qualità più coerente ha portato
all'introduzione di mezzi basati su media chimicamente definiti
attraverso analisi dei fluidi corporei e biochimica nutrizionale

• Tendenze attuali:
• terreni selettivi per le colture specializzate
• terreni per la produzione di biofarmaci (senza siero)
• alternative al siero
Il mercato della coltura cellulare è stato valutato a ~17 miliardi di dollari nel
2019 e si prevede che raggiungerà i ~35 miliardi di dollari entro il 2027,
crescendo a un CAGR del ~10% dal 2020 al 2027.

CAGR dall'acronimo anglosassone Compounded Average Growth Rate (Il tasso annuo di crescita composto)
A seconda dell'utente finale, il segmento delle aziende farmaceu,che e
biotecnologiche è il principale azionista nel mercato delle colture cellulari (a
causa dell'espansione delle principali aziende farmaceu+che, delle crescen+
approvazioni norma+ve per la produzione di vaccini basa+ su colture
cellulari)
 Fabbisogni nutrizionali e ambientali
• Terreni
• Componen+ aggiun+vi
• Siero
• pH
• Temperatura
• Umidità rela+va
• O2, %CO2
 TERRENI DI COLTURA
• Il terreno basale di Eagle [Eagle 1955] e, successivamente, il terreno
minimo essenziale di Eagle (MEM) [Eagle 1959] furono ampiamente
adottati, variamente integrati con siero di vitello, umano o di cavallo,
idrolizzati proteici ed estratto di embrione.
• Questi terreni erano perfettamente adeguati per la maggior parte di
linee cellulari continue
• la maggior parte degli sviluppi successivi mirava a sostituire il siero
ottimizzando i terreni per diversi tipi di cellule (RPMI 1640 per linee
cellulari linfoblastoidi), o modificando per condizioni specifiche (ad es.
Leibovitz L15 per eliminare la necessità di aggiungere CO2 e NaHCO3)
 Terreni di coltura: Complete Media
• Il termine terreno di coltura completo implica un terreno a cui sono
sta+ aggiun+ tu5 i suoi cos+tuen+ e supplemen+ ed è sufficiente per
la coltura. Di solito è cos+tuito da un componente medio definito, i
cui cos+tuen+ instabili, come la glutammina e vari integratori, come
siero, fa8ori di crescita o ormoni, possono essere aggiun+ appena
prima dell'uso.
• Le concentrazioni di nutrien+ sono, nel complesso, basse in F12 (che è
stato o5mizzato mediante clonazione) e alte nella modifica di
Dulbecco del MEM di Eagle (DMEM) [Dulbecco 1959], o5mizzato per
la crescita a densità cellulari più elevate per la propagazione virale.
 TERRENI DI COLTURA

I terreni base disponibili in commercio contengono tu5 i componen+

nutri+vi necessari alla crescita delle cellule

I più comuni terreni base di coltura

MEM Minimum Essen+al Medium (Eagle)

DMEM Dulbecco’s modifica+on of MEM
RPMI Roswell Park Memorial Ins+tute
 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
«Dobbiamo a Dulbecco la strategia della ricerca contro i tumori che si sta perseguendo in tuIo il mondo -
disse Pier Paolo Pandolfi, direIore del centro di geneMca del cancro dell'università di Harvard - e anche il
nostro principale strumento di lavoro, il Dulbecco-medium, il terreno di coltura che mise a punto per far
vivere e molMplicare in laboratorio sia cellule normali che tumorali»
Renato Dulbecco nacque a Catanzaro nel 1914

1975 il premio Nobel per la medicina e la

fisiologia “Per le sue scoperte in materia di
interazione tra virus tumorali e materiale
Misurare, misurare, misurare: il mantra di Renato Dulbecco genetico della cellula”
 Terreni di coltura più usaF
• Eagle’s Basal Medium (BME, EMEM)
• Minimum Essen3al Medium (MEM)
• Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
• Nutrient Mixture F-10 (HAM’s F-10) e Nutrient Mixture F-12 (HAM’s F-12)
• DMEM/HAM’s F-12
• Medium 199
• NCTC Medium
• RPMI 1630 Medium
• RPMI 1640 Medium

• Ques3 terreni differiscono tra loro per il contenuto in aminoacidi e sali e

per la concentrazione di glucosio
 Terreni di coltura
Sali inorganici
Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche
come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti
del catabolismo

▪ Cloruro di calcio
▪ Solfato di magnesio
▪ Cloruro di potassio
▪ Nitrato di potassio
▪ Cloruro di sodio
▪ Fosfato di sodio bibasico
▪ Bicarbonato di sodio
 Terreni di coltura
Vitamine
Agiscono come catalizzatori o come substra@ per facilitare o controllare
alcune funzioni metaboliche
• Bio@na (Vitamina B8)
• Acido pantotenico (Vitamina B5)
• Acido folico
• Inositolo
• Nico@namide
• Piridossina (Vitamina B6)
• Riboflavina (Vitamina B2)
• Tiamina
• Vitamina B12
 Terreni di coltura
Amminoacidi
Alanina Leucina
Arginina Lisina
Asparagina Metionina
Acido aspartico Fenilalanina
Cisteina Prolina
Glutamina Serina
Acido glutamico Treonina
Glicina Triptofano
Istidina Tirosina
Isoleucina Valina

Necessari per la sintesi delle proteine

 Terreni di coltura

Glucosio

Rappresentano la principale fonte di energia e di carbonio

per le biosintesi
 Terreni di coltura

• Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere u+lizzato,

viene complementato con:

• Glutammina (aa essenziale molto labile)

• Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)
• An+bio+ci (penicillina/streptomicina)
 Glutammina

La glutammina è instabile nel terreno di coltura con un'emivita di 3-5 giorni a 37 ° C

e genera ammoniaca, che può essere tossica
 SIERO
Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in
vitro della maggior parte delle cellule

I fattori essenziali nel siero includono

• fattori di adesione, come la fibronectina e vitronectina
• ormoni peptidici e fattori di crescita, come insulina, fattori di crescita simili
all'insulina (IGF) PDGF e TGF-b, che regolano la crescita e la differenziazione
• nutrienti essenziali, come minerali, vitamine, acidi grassi e metaboliti
intermedi
• ormoni, come insulina, idrocortisone, estrogeni e triiodotironina, che
regolano il trasporto di membrana, la differenziazione e la costituzione
della superficie cellulare.
 SIERO
• Miscela complessa di proteine ed elemen3 fondamentali per
la crescita in vitro della maggior parte delle cellule
• FaXori di crescita PDGF, EGF, IGF
• FaXori di adesione fibronec3na, vitronec3na
• Altri elemen3 trasferrina, albumina, colesterolo,
acidi grassi e glucor3coidi,
minerali

• Aumenta la capacità tampone

• Protegge dai danni meccanici
• Facilita l’adesione

Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

 SIERO
• Bovino (FBS, FCS, NCS), Cavallo (DHS)
• Prima del suo u+lizzo, il siero viene disa5vato in stufa a 56°C per 30’
allo scopo di eliminare il Sistema del Complemento, che potrebbe
interferire con la vitalità delle cellule
 Sistema del Complemento
Il sistema del complemento è una cascata enzima9ca che partecipa al processo di difesa contro le
infezioni (sistema di difesa filogene9camente più an9co). Molte proteine del complemento sono
presen9 nel siero come precursori enzima9ci inaBvi (zimogeni); altre si trovano sulla superficie delle
cellule.
COMPLESSO DI ATTACCO ALLA MEMBRANA è il principale responsabile della citotossicità mediata dal
complemento
• Lisi dei baPeri
• Clearance delle cellule alterate e apopto9che

membrane attack complex (MAC)

SIERO

Il siero può essere contaminato (virus, mycoplasma)

 Proprietà Fisicochimiche: pH
• la maggior parte delle linee cellulari cresce bene a pH 7,4
• il pH o5male per la crescita cellulare vari rela+vamente poco tra i
diversi ceppi cellulari
• alcune normali linee di fibroblas@ funzionano meglio a pH 7,4-7,7
• le cellule trasformate possono fare meglio a pH 7,0-7,4 (Eagle 1973]
• è stato riportato che le cellule epidermiche potrebbero essere mantenute
anche a pH 5,5 [Eisinger et al. 1979]
• In casi speciali può rivelarsi vantaggioso fare un breve esperimento di
crescita
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• Indipendentemente dal pH o5male, è importante che il pH rimanga il
più vicino possibile all'o5male durante tu8o il ciclo di crescita.
• La crescita cellulare è diminuita al di sopra del pH 7,7 e al di so8o del
pH 6,5 per la maggior parte delle cellule
• la vitalità viene rapidamente persa al di sopra del pH 7,8 e al di so8o
del pH 6,0.
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• si può incorporare nel terreno un colorante sensibile al pH per avere
un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita
• Il rosso fenolo è comunemente usato come indicatore di pH
• rosso-arancione a pH 7,4
• arancione a pH 7,0
• giallo a pH 6,5
• giallo limone sotto pH 6,5

• più rosa a pH 7,6

• viola a pH 7,8

valutazione del colore è altamente soggettiva

 Proprietà Fisicochimiche: pH
• Preparare flaconi di vetro o prove8e per campioni con una serie di
campioni sterili di terreno o BSS regola+ su un intervallo di pH
compreso tra 6,5 e 7,8.

• Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa

dell’acidificazione prodo8a dalla CO2 proveniente dal metabolismo
cellulare.
• Il colore viola indica che le cellule non sono metabolicamente a5ve o
che la regolazione della CO2 è errata.
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• L'anidride carbonica è presente nell'atmosfera intorno allo 0,04%
• le colture (in contenitori aper+) devono essere incubate in atmosfera
di CO2, la cui concentrazione è in equilibrio con il bicarbonato di sodio
nel terreno
• negli incubatori, CO2 è tra il 2% e il 10% (solitamente il 5%)
• l'anidride carbonica in fase gassosa, sia essa atmosferica o elevata, si
dissolve nel mezzo e abbassa il pH
• L'incubatore manMene le condizioni
ambientali oRmali per le colture
• temperatura
• umidità
• tensione dei gas all'interno
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• Ogni mezzo ha una concentrazione di bicarbonato e una tensione di CO2 consigliate per
ottenere il pH e l'osmolalità corretti
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• I terreni di coltura devono essere tampona+ in due serie di condizioni:

• piastre aperte, in cui l'evoluzione di CO2 provoca l'aumento del pH

• sovrapproduzione di CO2 e la\ato in linee cellulari trasformate ad alte
concentrazioni cellulari, quando il pH scende.

• Un tampone può essere incorporato nel terreno per stabilizzare il pH, ma

nella condizione con piastre aperte, alcune linee cellulari possono ancora
richiedere CO2 esogena, in par@colare a basse concentrazioni cellulari, per
prevenire la perdita totale di CO2 e bicarbonato disciol@, dal terreno.
• Nonostante la sua scarsa capacità tampone a pH fisiologico, il
tampone bicarbonato è ancora usato più frequentemente di qualsiasi
altro tampone, a causa della sua:
• bassa tossicità
• basso costo
• beneficio nutrizionale per la coltura
• HEPES, a 10-20 mM, è un tampone molto più forte nell'intervallo di
pH 7,2-7,6
• L’Hepes é una molecola sinte+ca con forte
potere tamponante
• Considerata la fototossicità di HEPES
(produzione di perossido di idrogeno se
esposto alla luce ambientale) è necessario
mantenere al buio le soluzioni di tale
tampone; questo anche per o8enere la
massima ripe+bilità degli esperimen+.
 Proprietà Fisicochimiche: pH
• L’effetto stitolazione con acido sulla
variazione del pH in presenza di
HEPES o bicarbonato di sodio

• pH è tamponato in modo più

efficace nell'intervallo fisiologico
(barra orizzontale verde)
dall'HEPES rispetto al bicarbonato.
Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere
costante il pH

Il pH del terreno dipende generalmente dalla %CO2 nell’incubatore

La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in funzione del

contenuto di NaHCO3 nel terreno u+lizzato e del pH desiderato

La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule
corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessu+ (35-45 mmHg,
equivalgono al 4.6- 5.9% di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente
le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.
 Ossigeno
• L'altro importante cos+tuente significa+vo della fase gassosa è
l'ossigeno.
• La maggior parte delle colture cellulari disperse preferisce tensioni di
ossigeno inferiori
• cellule tumorali umane
• fibroblas@ polmonari embrionali umani
• cellule staminali mesenchimali
• cellule staminali epiteliali
• cellule staminali emopoie@che
preferiscono condizioni ipossiche
 Ossigeno Come colKvare le cellule in concentrazioni
ipossiche o ridoLe di O2?

• L'opzione più semplice è u3lizzare una camera

per ipossia. Si tra9a di piccole "scatole"
autonome e sigillate proge9ate per ada9arsi a
qualsiasi incubatore di coltura cellulare da
laboratorio standard a temperatura controllata

• L'alternaMva è usare un incubatore trigas.

Richiedono un apporto di CO2 e N2; l'N2 viene
uMlizzato per spostare i livelli di O2 all'interno
della camera dell'incubatore, consentendo così
il raggiungimento e il mantenimento di
concentrazioni di O2 fino all'1-2%
 Temperatura
• La temperatura ottimale per la coltura cellulare varia in base a:
• la temperatura corporea dell'animale da cui sono state ottenute le cellule
• variazione anatomica della temperatura (ad esempio, la temperatura della
pelle e dei testicoli può essere inferiore a quella del resto del corpo)
• Pertanto, la temperatura consigliata per la maggior parte delle linee
cellulari umane e animali a sangue caldo è di 37°C, vicina al calore
corporeo ma impostata un po' più in basso per motivi di sicurezza,
poiché l’ipertermia è un problema più serio del l’ipotermia.
• Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37°C,
per certi tipi di cellule l’incubatore deve poter essere regolato in
modo preciso anche a 30°C o 34°C
 Temperatura e crescita
• Le cellule di mammifero col+vate tollereranno considerevoli cali di
temperatura, possono sopravvivere diversi giorni a 4°C e possono
essere congelate e raffreddate fino a -196°C, ma non possono
tollerare più di circa 2°C sopra il normale (39,5 °C) per più di poche
ore e morirà abbastanza rapidamente a ≥40°C.
 Temperatura
• Oltre al suo effe8o sulla crescita cellulare, la temperatura influenzerà
anche il pH, a causa dell'aumentata solubilità della CO2 a temperatura
più basse
• Il pH deve essere regolato a 0,2 unità in meno a temperatura
ambiente rispe8o a 37°C poiché aumenterà durante l'incubazione
• Nella preparazione di un terreno per la prima volta, per controllare il
pH, è meglio preparare il terreno completo e incubare per una no8e a
37°C so8o la corre8a tensione del gas
 Temperatura
• La temperatura deve essere mantenuta entro ±0,5°C per garan+re
risulta+ riproducibili
• Le porte delle incubatrici non devono essere lasciate aperte più a
lungo del necessario
• Anche la distribuzione spaziale della temperatura all'interno
dell'incubatrice o della camera calda deve essere uniforme: non
dovrebbero esserci pun+ freddi e l'aria dovrebbe circolare
liberamente. Ciò significa che un gran numero di piastre non deve
essere impilato insieme quando viene posizionato per la prima volta
nell'incubatrice; deve essere lasciato uno spazio tra di loro affinché
l'aria possa circolare.
 Umidità
• L’umidità rela@va (RH) è un parametro che è portato ad un
livello elevato (RH>98%) senza necessariamente essere
controllato
• L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la
temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio
per portare il livello di umidità rela@va alla giusta percentuale
• L’obieevo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta
nei terreni di coltura per non provocare un aumento della
pressione osmo@ca
 SIERO

• La proteina del siero aumenta anche la viscosità del mezzo, riducendo lo stress da frizione (shear
stress) durante il pipeIaggio e l'agitazione e può aumentare la capacità tampone del terreno.
terreni privi di siero
• la necessità di rimuovere le proteine animali dalla produzione in vitro
di biofarmaci ha generato una serie di formulazioni per linee cellulari
con+nue come
• CHO [Keen & Rapson 1995]
• HEK-293 [Cervera et al. 2013]
• ibridomi [Froud 1999; Ikonomo et al. 2003; Shah 1999]
terreni privi di siero
• ADVANTAGES OF SERUM-FREE MEDIA
• Poiché vengono u+lizza+ componen+ puri, la formulazione del mezzo
può essere standardizzata
• terreno sele5vo per un par+colare +po di cellula
• regolamentazione della proliferazione e differenziazione.
Examples of Serum-Free Media
 Conservazione dei terreni
• Le opinioni divergono sulla durata di conservazione dei diversi media.
In linea di massima, i terreni prepara+ senza glutammina dovrebbero
durare 6-9 mesi a 4°C.
• Una volta aggiun+ glutammina, siero o an+bio+ci, il tempo di
conservazione si riduce a 2-3 se5mane. Pertanto, i terreni che
contengono cos+tuen+ labili devono essere u+lizza+ entro 3
se5mane dalla preparazione o conserva+ a –20°C
Curva di crescita
 Tempo di duplicazione

La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il

numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione

Il tempo impiegato per ogni duplicazione è cara8eris+co di

ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-
30 ore per le cellule umane
 Confluenza

In coltura cellulare questo termine è comunemente usato per

descrivere la densità delle cellule aderenK ed è usato come misura
della loro proliferazione
 Confluenza

Le cellule a bassa densità (10-20%) di solito crescono più lentamente del 50% delle cellule confluenK.
Se la piastra è completamente cresciuta dalle cellule, tendono a crescere di nuovo molto più
lentamente.
 Distacco delle cellule in adesione
Soluzione di EDTA e tripsina
EDTA
• chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l’adesione
Tripsina
• enzima proteoli+co, derivato da pancreas porcino
• degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule
aderen+ al substrato
 Protocollo di tripsinizzazione

• lavare le cellule (2x) con PBS (phosphate buffered saline)

• aggiungere un volume adeguato di tripsina (pre-riscaldata)

• incubare a 37°C per almeno 3 minu+

• neutralizzare la tripsina con medium completo di FBS (che

con+ene inibitori della tripsina)
 Protocollo di tripsinizzazione

• trasferire la sospensione ina prove8a e centrifugare 5 min

per 900-1000 RPM
• aspirare il sovranatante
• aggiungere il terreno fresco e separare le cellule
• distribuire nelle nuove piastre

TuIe le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule fuori
dall’incubatore il minor tempo possibile

Le cellule staccate devono essere riseminate in numero adeguato: non crescono in modo
efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di soIo di una certa densità (regola
generale: densità > 104 cellule/cm2)
 Determinazione del numero di cellule
La quan+ficazione in coltura cellulare è necessaria per:

• cara8erizzazione delle proprietà di crescita di diverse linee cellulari

• sperimen+ quan+ta+vi
• stabilire condizioni di coltura riproducibili
• consistenza della coltura primaria
• mantenimento delle linee cellulari
 Determinazione del numero di cellule

• cellule vengano contate prima e

dopo, e preferibilmente durante,
ogni esperimento

• modi per determinare il numero di

cellule
• direZ
• indireZ
 Conta Cellulare
• lo stadio di crescita di una coltura possa essere s+mato dal
suo aspe8o al microscopio (confluenza)

• la concentrazione di una sospensione cellulare può essere

determinata al microscopio ponendo le cellule in un vetrino
a camera, noto come emocitometro o la camera di Bürker

• un metodo semplice ed economico

 La camera di Bürker
• la camera è cosMtuita da un vetro in cui è ricavata una
camera capillare

• la parte superiore della camera è cosMtuita da un vetrino

• Viene contato il numero di cellule all'interno di un'area

definita di profondità nota (cioè all'interno di un volume
definito) e la concentrazione di cellule è derivata dal
conteggio
 La camera di Bürker
• preparare la sospensione cellulare (tripsinizzare una coltura
monostrato o campionare una coltura in sospensione)
• preparare un vetrino
• trasferire una piccola quan+tà di sospensione cellulare nella
camera del vetrino, perme8endo il riempimento per
capillarità
• contare le cellule (nel quadrato centrale e nei qua8ro
quadra+ agli angoli; ciascun quadrato ha un volume di 0.1
mm3)
 Sezione longitudinale del vetrino, che mostra la
posizione del campione in una camera profonda
0,1 mm
• vetrino emocitometrico e coprioggeIo prima dell'uso
• premere il coprioggeIo verso il basso sul vetrino
• aggiungere di una sospensione cellulare a un vetrino assemblato
• mescolare bene la sospensione!
 La camera di Bürker

• pulire la superficie del vetrino con il 70% di alcol, facendo a8enzione

a non graffiare rives+mento «argentato»
• pulire il copriogge8o e, bagnando leggermente i bordi, premere con i
bordi del copriogge8o che si estendono oltre le scanalature più
esterne.
• la comparsa di schemi di interferenza ("anelli di Newton" - colori
dell'arcobaleno tra il copriogge8o e il vetrino, come gli anelli forma+
dall'olio sull'acqua) indica che il copriogge8o è fissato corre8amente
La camera di Bürker

• 2 aree reIangolari e 2 reMcoli di conta

• Ogni reMcolo di conta è cosMtuito da 9 quadraM delimitaM
da linee triple
• Ciascuno dei 9 quadraM è cosMtuito da 16 quadraM minori
separaM da doppie linee
• Si contano almeno 3 quadraM delimitaM da linee triple
• Si effeIua una media aritmeMca delle cellule contate
 La camera di Bürker

• Contare le cellule del riquadro considerando tuIe quelle completamente all’interno di

tale area e quelle a cavallo di due laM conMgui dei quaIro laM totali. Ad esempio il lato a
sinistra e il lato in alto

• Una volta effeIuata la conta fare la media delle cellule contate con il totale delle aree.
numero totale di cellule / numero di riquadri = valore medio di cellule
• Poichè la superficie del riquadro era di 1 mm2 , questo è il numero di di cellule per mm2
• Poiché lo spessore del liquido nella camera è di 1/10 di mm (dato di fabbrica) per
oIenere il numero di cellule per mm3 :
numero di cellule per mm2 X 10 = numero di cellule per mm3
• Cellule per mm3 = cellule ricavate dalla conta X faIore di diluizione
Se il campione non è stato diluito si consideri faIore di diluizione=1

1ml=1cm3=1000mm3
Conta Cellulare
 Test di vitalità cellulare
Saggio con il Trypan Blue

Il Blu Tripano è un colorante u@lizzato nel test di determinazione della vitalità

cellulare. Questo colorante perme\e di discriminare tra le cellule vitali e quelle
morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte.
 Test di vitalità cellulare
Saggio con il Trypan Blue

danno di membrana cellulare

 Test di vitalità cellulare
Saggio con il Trypan Blue

• un’adeguata accuratezza della misura si o5ene contando

almeno 100 cellule
• il Trypan blue è tossico ed è un potenziale cancerogeno
• le cellule devono essere ben dis+nte e uniformemente
distribuite
• evitare la presenza di bolle e detri+
• non riempire eccessivamente la camera
• se le cellule sono poche: nuova centrifugazione e
risospendere in meno terrreno
 Saggio con MTT
• Il saggio MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione
dell'a5vità degli enzimi che riducono l‘MTT (bromuro di 3-
[4,5dime+l+azol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) a formazano
• L'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (redu8asi), è a5vo
infa5 soltanto nelle cellule vive e la sua funzione consiste nel tagliare
l'anello di tetrazolio dell‘ MTT (sostanza di colore giallo) con la
formazione, di conseguenza, di formazano (blu).
 Saggio con MTT
• Tale reazione è valutata e misurata mediante la le8ura
spe8rofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm.
• Ciò accade prevalentemente nei mitocondri; questo saggio può essere
u+lizzato per determinare la citotossicità di farmaci o altri +pi di
sostanze chimicamente a5ve e potenzialmente tossiche.
Banca cellulare e criopreservazione
 Store the cryogenic vials in an isopropanol-containing cryo-
freezing container such as Nalgene® Mr. Frosty or an isopropanol-
free container such as Corning® CoolCell® and place them
overnight in a -80°C freezer.

This will allow the cells to freeze at approximately -1°C/minute,

which is ideal for freezing most cell types.

controlled rate freezer