ADITIVI SI SUPLIMENTE

ALIMENTARE
Antioxidanti
Arome
Agenti de colorare
Polizaharide
Indulcitori
Vitamine
Aminoacizi
Acizi organici
Sinteza chimica
Sinteza biologica
Aditivi si suplimente alimentare
NUTRACEUTICE
produse care cumuleaza activitati farmacodinamice si nutritive;
substante antioxidante, vitamine, flavonoizi, uleiuri comestibile cu continut
scazut de colesterol si/sau ridicat de acizi grasi polinesaturati, dar si unele
fructe (tomate, banane etc), considerate ca potrivite pentru producerea de
vaccinuri comestibile (antihepatitic, antiholeric sau antidizenteric)
(Dictionar de Microbiologie generala si Biologie moleculara, G. Zarnea si
O.V.Popescu, Ed Academiei Romane, 2011)
Aditiv alimentar
functie:
Exemple de produse comerciale
(organism producator)
Acidulanti/
conservare
Acid citric (Aspergillus niger, Candida guilliermondii, Candida
lipolytica)
Acid lactic (Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus)
Acid malic (Brevibacterium flavum)
Aminoacizi Acid glutamic (Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium
flavum)
Lizina (Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum)
Triptofan (Klebsiella aerogenes)
Agenti
antimicrobieni
Nisina (Lactococcus lactis)
Natamicina (E235) (Streptomyces natalensis, Streptomyces
chattanoogensis)
Antioxidanti Acid ascorbic (Acetobacter suboxydans)
Agenti de
colorare
Beta-caroten (Blakeslea trispora, Dunaliella salina)
Licopen (Blakeslea trispora, Streptomyces chrestomyceticus)
Zeaxantina (Flavobacterium sp)
Luteina (Spongiococcus excentricum, Chlorella pyrenoidosa)
Cantaxantina (Cantharellus cinnabarinus, Rhodococcus maris)
Astaxantina (Haematococcus pluvialis)
Aditivi alimentari de origine microbiana
Aditivi alimentari de origine microbiana
Aditiv alimentar
functie:
Exemple de produse comerciale
(microorganism producator)
Emulsificatori Diferite polizaharide (Candida utilis)
Glicolipide (Rhodococcus erythropolis)
Enzime Alfa-amilaze (Aspergillus flavus, A. oryzae)
Amiloglucozidaza (A. niger, Rhizopus niveus)
Catalaza (Micrococcus lysodeikticus)
Celulaza (A. niger, Trichoderma viridae)
Alfa-galactozidaza (Mortierella vinacea)
Glucozoizomeraza (Actinoplanes missouriensis, Streptomyces
olivaceus, Bacillus coagulans)
Glucozo oxidaza (A. niger, Penicillium chrysogenum)
Invertaza (Saccharomyces cerevisiae)
Lactaza (Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces lactis)
Lipaza (A. oryzae)
Nucleaza (P. citrinum)
Pectinaza (A. niger)
Proteaza (B. licheniformis, B. subtilis, A. niger)
Renina (B. cereus, Endothia parasitica, Rhizomucor miehei)
Ureaza (Lactobacillus fermentum)

Aditivi alimentari de origine microbiana

Aditiv alimentar
functie:
Exemple de produse comerciale
(organism producator)
Arome si
potentiatori de
arome
Vanilina (Streptomyces sp)
Nucleozide (Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenus)
Monoglutamat de sodiu (Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium flavum)
Indulcitori Thaumatin (Thaumatococcus danielli)
Stabilizatori si
agenti de
ingrosare
Glican (Saccharomyces cerevisiae)
Pululan (Aureobasidium pullulans)
Xanthan (Xanthomonas campestris)
Vitamine Acid ascorbic (C) (Acetobacter suboxydans)
Cianocobalamina (B
12
) (Propionibacteria sp., Pseudomonas
denitrificans, Streptomyces griseus)
Riboflavina (B
2
) (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii,
Bacillus subtilis - recombinant)
Arome
vin, otet, bere, legume fermentate, lapte, soia si carnea au
fost conservate, modificate si aromate cu ajutorul tulpinilor
microbiene.

Microorganisme
producerea de compusi aromatici (aditivi alimentari)
in situ ca parte a proceselor de fermentatie.
Arome
din piata mondiala a aditivilor
naturale, sintetice
procedee de bioconversie

Categorie de
compusi
Arome si microorganism producator
Aldehide Anason si migdale - Trametes suavoelens
Diacetil Unt Streptococcus diacetylactis
Esteri Etil-butirat - Fructe Lactobacillus casei
Metil butirat- Anason - Trametes suavoelens
Lactone Gama-decalactona piersica Ceratocystis variospora
Nuca/nuca de cocos pentil alfa-pirona Trichoderma reesei
Mentol Menta Schizophyllum sp
Pirazine Prajit tulpini mutante de Corynebacterium si Bacillus popcorn,
nuci, potentarea cafelei
Terpene Citronelol, linalool si geraniol caracteristici florale si de fructe
obtinute cu ajutorul levurilor si fungilor filamentosi ex.
Kluyveromyces lactis citronelol aromarea bauturilor racoritoare
din fructe
Conservanti alimentari naturali

Bauturi racoritoare si alcoolice, sosuri salate, produse de
panificatie, gemuri, jeleuri, inghetata, brazeturi procesate

Esentiali pentru industria alimentara actiune de conservare
si aromare a produselor alimentare


acid acetic - Acetobacter
acidul lactic - Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus
acid citric Aspergillus niger
acid malic Brevibacterium flavum
acid tartaric si
acid gluconic Aspergillus niger
Acizi organici:
Acid gluconic
Industria farmaceutica vehicul pentru administrarea de metale.
Gluconat de Ca solubilitate si toleranta fiziologica.
Gluconat de Na laminarea metalelor, tabacirea pieilor, mordansarea tesaturilor,
vopsitorie.
Lactona acidului gluconic catalizator in productia de rasini sintetice, sau in
industria alimentara prafuri de copt.
Conservanti alimentari naturali
Peptide microbiene
Rolul acestora in natura:
reglatori ai cresterii,
molecule de semnalizare/comunicare intercelulara, avantaj
selectiv in ocuparea unor nise ecologice si valorificarea
nutrietilor de la acest nivel
sunt active la pH scazut
bacteriile lactice
Conservanti alimentari naturali
Peptide microbiene

Natamicina (piramicina, E235) Nisina (E234)
Agent antifungic, o poliena
Produsa de Streptomyces sp.,
Agent antimicotic de suprafata pentru alimente taiata si feliate ex branzeturi
Tratamentul keratitei fungice si infectii ale corneei Aspergillus si Fusarium

Produsa de Lactococcus lactis, 3500 Da
Metabolit primar,
Desi descoperit inca din 1928, nisina nu a fost utilizata in industria
alimentara pana in anul 1951 cand Hirsch et al. au demonstrat
capacitatea culturilor microbiene producatoare de nisina de a preveni
alterarea alimentelor (Staphylococcus sp., Clostridium, Bacillus, Listeria
monocytogenes).
WHO, 1969 aporbare de utilizare in industria alimentara, in prezent
este reglemetata pentru utilizare in 47 de state
FDA, 1988 substanta GRAS, pentru utilizare in branzeturile procesate
Controlul alterarii alimentelor procesate, acide (branzeturi tartinabile,
produse pe baza de oua, sosuri, conserve)
Conservanti alimentari naturali
Nisina (E234)
Genuri bacteriene Caracteristici
Alicyclobacillus Gram pozitiv, aerob, sporogen
Bacillus Gram pozitiv, aerob si facultativ anaerob, sporogen
Clostridium Gram pozitiv, obligat anaerob, sporogen
Desulfotomaculum Gram-variabil, obligat anaerob, sporogen
Enterococcus Gram pozitiv, aerob sau anerob, nesporogen
Lactobacillus Gram pozitiv, aerob sau anaerob, nesporogen, capacitate de
crestere la pH scazut
Leuconostoc Aerob si anerob, nesporogen
Listeria Gram pozitiv, aerob si anaerob, nesporogen
Micrococcus Gram pozitiv, aerob, nesporogen
Pediococcus Gram pozitiv, aerob si anaerob, nesporogen
Staphylococcocus Gram pozitiv, aerob si anaerob, nesporogen
Sporolactobacillus Gram pozitiv, aerob si anaerob, sporogen, capacitate de crestere la
pH scazut
Asocierea nisinei cu agenti de chelatare (EDTA) si/sau surfactanti Triton
X-100 si Tween 20 eficienta in combaterea a numeroase bacterii Gram-
negative (Salmonella typhimurium si E. coli) (Blackburn et al., 1989).
Conservanti alimentari naturali
Nisina (E234)
Nisina (E234)
Alte aplicatii:
Antiseptic tratament mastita bovina
Controlul bacteriilor orale responsabile pentru halena, placa
dentara si gingivita
Preparate cutanate topice S. aureus si S. pyogenes
Tratamentul infectiei mucoase gastrice cu Helicobacter
pylori
Conservanti alimentari naturali
Nisina (E234)
serina
treonina
+ cisteina
dehidrobutirina
dehidroalanina
lantionina
beta-metil lantionina
Prenisina, 57 aa
Nisina, 34 aa
Genele codificatoare organizate in operon
transpozon cromosomal, 70kb
Mecanism de actiune: alterarea permeabilitatii
membranei plasmatice, peptidele de nisina se
localizeaza la nivelul acesteia (coagregare) generand
pori membranari pierderi de electroliti
Conservanti alimentari naturali
Nisina (E234)
Produsa prin procese de fermentatie L. lactis
Mediu cu lapte, pH = 2
Extractie cu solventi si cromatografie de afinitate eficiente
Procese industriale concentrata si separata printr-un proces
de spumare (introducerea de N sub forma de bule sau de aer
printr-o coloana in mediul de fermentatie).

Conservanti alimentari naturali
Peptide microbiene
pediocina PA1, produsa de Pediococcus acidilactici PAC1.0
activa fata de Listeria monocytogenes, microorganism ce nu
este sensibil la nisina.
Microgard - produs lactat degresat fermentat de
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.
Inhiba fungii filamentosi, speciile bacteriene Gram negative, si
bacteriile lactice heterofermentative, este utilizata in aproximativ
30% din branza de vaci produsa in SUA.
Un peptid de 700 Da a fost implicat in activitatea Microguard
insa nu s-a demonstrat pana in prezent ca ingredientul activ este
o bacteriocina.

Nucleozide, nucleotide
Aditivi alimentari
Precursori ai unor agenti terapeutici

5guanozin monofosfat (GMP) si
5-inozin monofosfat
Potentiatori de arome, produsi prin
hidroliza enzimatica a ARN de
drojdie
adenozina, adenina
Precursori ai unor agenti terapeutici
Bacillus ammoniagenes, B. subtilis
Vitamine
Tiamina (vitamina B
1
)
Riboflavina (vitamina B
2
)
Piridoxina (vitamina B
6
)
Cobalamina (vitamina B
12
)
Biotina
Acid folic
Acid L- ascorbic
Beta-caroten (provitamina A)
Ergosterol (provitamina D
2
)
Acid pantotenic

Drojdia de panificatie, drojdia de bere (S. cerevisiae)
surse de vitamine grup B.
Procese de fermentatie
Procese de bioconversie
Procese ce imbina etape chimice
cu etape biologice
Productia industriala de vitamine
Metoda de productie Productia globala (tone)
Biotech Chemica Extractie 1980 1990 2000 2010
Tiamina (B1) + 1700 4200 3700
Riboflavina + 2000 2400 4400
Niacina + + 8500 22000 2800
Acid pantotenic + + 5000 7000
Piridoxina + 1600 2550 3800
Biotina + + 2.7 2.5 88 112
Acid folic + 100 400 534
Vitamina B12 + + 2 10 25 175
Vitamina C + 40000 60000 10700
Vitamina A + + 16800 2500 2700
Vitamina D + + 5000
Tocoferol (E) + + + 6800 22000 30000

Vitamina K + 500
Vitamine
Acidul L-ascorbic (Vitamina C)
Un metabolit important pentru majoritatea organismelor vii
Organisme superioare
roluri esentiale in diferite procese fiziologice
In mod conventional este produs prin procesul Reichstein
(variatii ale acestui proces)
sinteza colagenului,
mentienrea ionilor metalici in forma lor redusa,
antioxidant rol de aditiv alimentar
Vitamine
Acidul ascorbic (Vitamina C)
D-glucoza D-sorbitol
L-sorboza
Acid L-ascorbic
(vitamina C)
Conditiile de desfasurare a procesului de bioconversie:
glucoza, extract de drojdie/corn steep liquor
exces de carbonat de Ca
D-sorbitol,15 30%
30C, aerob
L sorboza este recuperata din mediu dupa filtrarea si concentrarea filtratului, acest
zahar cristalizeaza la racire si aproximativ 65% este recuperat.
Vitamine
Acidul ascorbic (Vitamina C)
Dihidroxiacetona
dihidroxiacetona glicerol
Acetobacter suboxydans
Gluconobacter melanogenus
Vitamine
Riboflavina (Vitamina B
2
)
6,7 dimetil - 9 - (1 - D - ribitil) - izoaloxazina
Clostridium acetobutylicum
Ashbya gossypii
Eremothecium ashbyii
Bacillus subtilis -
Precursor al coenzimelor:
- Flavin adenin dinucleotide (FAD)
- Flavin mononucleotide
Deficienta afectiuni cutanate si metabolice
Aplicatii: aditiv alimentar om si animale (UK - 1977)
Productie anuala: 600 tone
Vitamin B12 este denumirea generica a unui grup de compusi ce contin
un nucleu tetrapirolic,
atom de Co in centru
radical legat de atomul de Co
CN = cianocobalamin (CNCbl)
OH=hidroxocobalamin (OHCbl)
-CH
3
=metillcobalamin (MeCbl)

Vitamine
Cobalamina (Vitamine B
12
)
factorul anti-pernicios
Vitamine
Cobalamina (Vitamine B
12
)
factorul anti-pernicios
Pseudomonas denitrificans 1 etapa randament mai mare (60 mg/L)

Propionibacterium freudenreichii
Propionibacterium shermanii
2 etape: anaeroba 2-4 zile
5- dezoxiadenozilcobinamida
aeroba 3-4 zile 5- dezoxiadenozilcobalamina
(coenzima B12)
Conditii de desfasurare a procesului industrial:
- Mediul de cultura: glucoza sau zaharoza ca sursa de carbon; sursa de azot:
faina de peste, corn-steep sau reziduuri de la distilarea alcoolului
Aplicatii
- Aditiv alimentar hrana omului si animalelor (pasari si porci), creste
valoarea nutritionala a nutreturilor
- Productia anuala 175 tone
Carotenoizi
Pigmenti galbeni, portocalii, rosii, ubicuitari in natura
Aplicatii: precursori ai vitaminei A, antioxidanti, agenti de colorare: unt,
inghetata, hrana animalelor intensificarea culorii pielii si galbenusului de ou,
hranirea pestilor colorarea carnii


Agenti de
colorare
Beta-caroten (Blakeslea trispora, Dunaliella salina)
Licopen (Blakeslea trispora, Streptomyces chrestomyceticus)
Zeaxantina (Flavobacterium sp)
Luteina (Spongiococcus excentricum, Chlorella pyrenoidosa)
Cantaxantina (Cantharellus cinnabarinus, Rhodococcus maris)
Astaxantina (Mycobacterium lacticola, Xanthophyllomyces sp.)
METABOLITI PRIMARI
AMINOACIZI
AMINOACIZII
Aminoacizi esentiali:
lizina,
treonina,
valina,
metionina,
triptofanul,
fenilalanina,
leucina si
izoleucina.
Aminoacizi partial esentiali
histidina si
arginina,
Acid glutamic - industria
farmaceutica si alimentara
Marirea valorii nutritive a alimentelor vegetale, sarace in
aminoacizi esentiali
Faina de porumb lipseste Lys si Trp
Gliadina graului Lys in cantitate insuficienta
Utilizari
alimentatia omului 66%,
furajele animalelor 31%,
medicina,
cosmetica si
industria chimica
Se bazeaza:
valoarea nutritionala
gust
activitate fiziologica
caracteristici chimice
Cai de Obtinere
1. hidroliza proteinelor animale si mai ales vegetale
2. sinteza chimica
3. biosinteza microbiologica
4. pe cale enzimatica.
Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, Corynebacterium,
Brevibacterium.
alanina, acidul glutamic si acidul aspartic, glicina. serina, valina si leucina
1 - 2 mg/ml.

Productia microbiana de aminoacizi
CONDITII:
stimularea patrunderii in celula a substratului nutritiv utilizat in sinteza
diferitilor aminoacizi

stoparea reactiilor secundare

stimularea sintezei si activitatii enzimelor implicate in biosinteza
aminoacidului respectiv

inhibarea sau reducerea activitatii enzimelor care produc degradarea
aminoacidului respectiv

stimularea excretiei aminoacidului respectiv in mediul exterior.



Productia microbiana de aminoacizi
CONDITII:
Realizarea acestor deziderate s-a facut pe doua cai corelate
intre ele:
Tehnici de mutageneza mutante auxotrofe, in special de
aminoacizi
Cunoasterea mecanismelor de reglare metabolica la nivel
molecular si modalitati de perturbare a acestora.
Productia microbiana de aminoacizi
tulpini salbatice (prototrofe): acid L-glutamic, L-valina, D-L-
alanina, L-glutamina, L prolina ;

mutante auxotrofe de aminoacizi: L-lizina. L-treonina, L-
leucina. L-prolina, L-ornitina, Lvalina. L-citrulina, acid L-
aspartic ;

mutante reglatoare: L-lizina. L-treonina. L-arginina, L-
metionina ;


Factorii care influenteaza producerea
microbiologica de aminoacizi
Cultura microbiana


Sursa de C,
Sursa de N
Valoare pH
Temperatura
Aerarea

mutante auxotrofe
mutante reglatoare
ACIDUL GLUTAMIC
glutamat monosodic (MSG) drept condiment, sau corector de gust in industria
alimentara (0,1% - 0,3%)

in medicina - tratamentul schizofreniei, epilepsiei, al urmarilor meningitei,
encefalitei si poliomielitei;

microorganisme producatoare specii Gram pozitive, biotin dependente, imobile:
Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium (Corynebacterium
glutamicum), Brevibacterium (B. flavum si B. lactofermentum)
Microbacterium si Micrococcus.

Biosinteza si acumularea de acid glutamic
marirea activitatii enzimelor
anabolice
eliminarea mecanismelor de
reglare metabolica pentru
indepartarea mecanismelor de
control prin feedback
blocarea cailor metabolice ce
conduc la produsi secundari
blocarea cailor metabolice ce
conduc la degradarea produsului
tinta acid L-glutamic
Biosinteza si acumularea de acid glutamic
limitarea capacitatii de preluare a
precursorului intermediar al acidului L-
glutamic (acid oxoglutaric) in urmatorul
intermediar al ciclului TCA, succinil-CoA;
adica mutante ce nu contin acid
oxoglutaric dehidrogenaza. In cursul
fazei de crestere acesti mutanti produc
metaboliti intermediari esentiali de la
izocitrat prin ciclul glioxilat
cresterea permeabilitatii eliminarea
acidului glutamic limitare de biotina,
adaugare de surfactanti (Tween 40) si
penicilina
Producerea industriala de acid glutamic
Mediul de cultura:
sursa de C (glucoza 5-20%): melase
reducerea cantitatii de biotina prin adaos de acizi grasi saturati, penicilina
sau surfactanti
sursa de N saruri de amoniu, uree, corn-steep,
hidrolizat de faina de soia
Saruri de Fe, Zn, Mn, Co urme
Biotina - deficienta

Valoare pH: 6,0 8,0 (hidroxid de amoniu)
Temperatura: 27-30
Aerare
3540 h in mediu acid glutamic 80 g/L.
Corynebacterium microorganisme fastidioase nutritional si pot necesita
alte vitamine, aminoacizi, purine si pirimidine
Producerea industriala de acid glutamic
Separare si purificare cristalizare prin scaderea valorii pH la 3.2
cu acid clorhidric
Cristalele de acid L-glutamic sunt apoi filtrate si spalate.
L-Lizina
Aminoacid esential
Preluat prin dieta produse alimentare si furaje suplimentate
Productia anuala - 380 000 tone, 90 000 tone procese
microbiologice, restul prin sinteza chimica dezavantaj:
producerea de izomeri optic activi in amestec (D si L)
L-Lizina
L-Lizina
Tulpinile producatoare de C. glutamicum selectate pentru productia de lizina
dereglarea mecanismelor de control prin feedback :
Nu prezinta homoserin dehidrogenaza (auxotrofe pentru homoserina);
aceste mutante auxotrofe convertesc intreaga cantitate de semialdehida
aspartat la lizina,
Nu sintetizeaza treonina nu exista mecanism de control prin feed-back
Insa, trebuie adaugate cantitati determinate de metionina si izoleucina in
mediu de cultura pentru a permite cresterea mutantelor auxotrofe
L-Lizina
Procese discontinue bioreactoare cu agitare mecanica
Surse de carbon: melase, acid acetic sau etanol suplimentate cu hidrolizate
de soia
Temperatura - 28C si pH neutru (amoniac, uree si sursa de azot)
Concentratia de biotina control foarte important, deoarece < 30mg/L
acid glutamic
Faza lag este redusa prin utilizarea unui inocul dens
Productia faza exponentiala + faza stationara
60h, randament 4045 g/L l-lizina melase (200 g/L) cu 100 g/L zaharoza
Separare indepartarea celulelor bacteriene, acidifierea mediul de cultura
la pH 2.0 cu acid clorhidric iar apoi lizina este adsorbita pe rasini
schimbatoare de ioni, urmata de elutie
METABOLITI
SECUNDARI
ANTIBIOTICE
ALCALOIZII DIN ERGOT
MICOTOXINE

HORMONII STEROIZI
VACCINURI
VITAMINE
PROBIOTICE
PROTEINE CU VALOARE TERAPEUTICA
REACTIVI DE DIAGNOSTIC
PRODUSE MICROBIENE CU ROL BENEFIC ASUPRA
SANATATII UMANE
Antibiotice
8000
50 aprobate pentru uz in practica medicala

Conditii:
absenta de toxicitate
selectivitate/mecanism de actiune
stabilitate
absenta compusilor pirogeni si celor histaminici
o buna toleranta

Sa se dezvolte relativ rapid , de
preferinta, pe medii de cultura ieftine
Sa fie relativ usor modificate genetic,
cu scopul maririi potentialului lor
biosintetic
Sa nu fie patogene si sa nu produca
metaboliti toxici
Biosinteza antibioticelor la nivel industrial se realizeaza
in cadrul unor procese aerobe in bioreactoare industriale
Pentru a fi utilizate la nivel
industrial, microorganismele
producatoare de antibiotice
trebuie sa indeplineasca
urmatoarele conditii
ANTIBIOTICE
Clasa de antibiotice Exemple de antibiotice Specii microbiene
Beta-lactamice Peniciline
Cefalosporine
Carbapeneme
Penicillium crysogenum
Cephalosporium
acremonium
Streptomyces clavuligenes
Streptomyces cattleya
Polipeptide ciclice Bacitracina

Gramicidina
Polimixine
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus brevis
Bacillus polymixa
Aminoglicozide Streptomicina
Kanamicina
Gentamicina
Neomicina
Tobramicina
Vancomicina
Streptomyces griseus
Streptomyces
kanamyceticus
Micromonospora purpurea
Streptomyces spectabilis
Lactone macrociclice Eritromicina
Rifamicina
Nistatin
Amfotericina B
Streptomyces erytheus
Nocardia sp.
Streptomyces sp.
Streptomyces
Chinone Tetraciclina Streptomyces aureofaciens
Nucleu aromatic Cloramfenicol
Griseofulvina
Novobiocina
Streptomyces
Penicillium
Streptomyces
Compusi quinolonici Acid nalidixic
Norfloxacin
Streptomyces
Streptomyces
Compusi alifatici ciclici cicloheximide Streptomyces griseus

Compusi steroidici Acid fusidic Fusinium coccineum
Antibiotice
Beta-lactamice (peniciline si cefalosporine)






Aminoglicozide streptomicina
Tetracicline


Waksman, 1943
A. Fleming, 1928
Streptomyces
Alte aplicatii ale antibioticelor
agenti antitumorali: actinomicin si mitomicin, produse de
Streptomyces peucetius si S. caepitosus,
controlul bolilor microbiene la plantele de cultura
cercetarile biochimice si moleculare
promotori de crestere - furajele animalelor.

REZISTENTA LA ANTIBIOTICE
comisia UE a interzis utilizarea bacitracinei, spiromicinei,
tilomicinei si virginiamicinei ca promotori de crestere in 1999
Antibiotice beta-lactamice
>100, peniciline si cefalosporine
din ATB produse la nivel global
avantaj: nu sunt toxice pentru organismul uman si animal
selectivitate inalta
Antibiotice beta-lactamice
Penicilina G
Penicillium notatum 1mg/L, cultivare in suprafata

Corn steep liquor

Penicillium crysogenum, cultivare submersa 5g/L (>50000)
A. Fleming, 1928
Structura comuna
penicilinelor, cefalosporinelor si cefamicinelor
Tehnici clasice de imbunatatire a tulpinii
producatoare
Penicilina G (benizil penicilina) si
Penicilina V (fenoximetil penicilna)
Spectru mai larg de activitate
Adaugarea de lanturi laterale precursoare in mediul de cultura
Penicilinele naturale pot fi modificate chimic
In prezent, majaritatea sunt semisintetice obtinute cu ajutorul
tulpinilor de P. crysogenum

Meticilina
Carbenicilina
Ampicilina
Peniciline semisintetice
Rezistenta la pH acid gastric a permis administrarea orala
Rezistenta la penicilinaza
Extinderea spectrului de activitate tulpini bacteriene Gram
negative

Producerea industriala
Procese submerse, semicontinue
Bioreactoare 40.000 200.000L
Etape: - crestere vegetativa
- producerea antibioticului
Aerare
Temperatura: 25 - 27C
pH 6.5 7.7
Producerea industriala
Mediul de cultura
diferite surse de C glucoza, lactoza, zaharoza, etanol, uleiuri vegetale
65% - mentenanta celulara,
25% - crestere
10% - productia de penicilina
corn steep liquior sursa de N si factori de crestere
pH acid carbonat de Ca si tampon fosfat
amoniac, saruri minerale,
precursori lanturi laterale specifice ex.: acid fenil acetic sau acid
fenoxiacetic, adaugate la continuu la conc subinhibitorii
Inocul: spori liofilizati 5x103 spori/ml
Producerea industriala
2 etape:
Producere biomasa (pellets) 2 zile
Producerea de penicilina 6 8 zile,
sursa de C la o conc <
Penicilina este eliminata in mediu si recuperata la sfarsitul procesului
Indepartarea miceliului prin filtrare
Spalarea miceliului pentru recuperarea
penicilinei reziduale
Extractia
extractia cu solvent 90%
2 etape de extractie la 0-3C cu amil acetat, butil
acetat
(protejarea penicilinei la pH scazut)
rasini schimbatoare ioni

Producerea
industriala
Alcaloizi ergot
Alcaloizii = grup divers de compusi organici ce contin azot,
produsi de plante si microorganisme

Claviceps purpurea
(cornul secarei)
Structura - ergoline
Procedee de cultivare in suprafata
Procedee de cultivare submerse

Clasa de compusi Metabolit Microorganism producator
Alcaloizi Agroclavin
Ergometrin
Acid lisergic
Ergocristin
Ergozin
Ergotamin
Claviceps fusiformis
Claviceps fusiformis
Claviceps paspali
Claviceps purpurea
Claviceps purpurea
Claviceps purpurea
Antibiotice Cefalosporine
Fusidin
Griseofulvina
Peniciline
Acremonium (Cephalosporium)
Fusidium coccineum
Penicillium griseofulvum
Penicillium
Agent antitumoral Lentinan Lentinus edodes
Agent antiviral Funiculosin Penicillium funiculosum
Inhibitor al colesterolului Acid zaragozic Sporomiella intermedia
Enzime Lactaza Kluyveromyces
Agent hipotensiv Acid fusaric Fusarium sp.
Imunoreglatori Ciclosporine Cylindrocarpon lucidum
Tolypocladium inflatum
Trichoderma polysporum
Gliotoxin Aspergillus fumigatus
Alcaloizii ergot
2 categorii
alcaloizi clavin, nu contin resturi peptidice
produsi si de Aspergillus si Penicillium
acid lisergic, tripeptid/ aminoalcool alcaloizi clavin, nu contin
resturi peptidice
produsi numai de Claviceps

ergocristin
ergozin
ergotamin analog structural al serotoninei

proprietati terapeutice: tratamentul migrenei, halucinogene,
obstretica contractia musculaturii netede a uterului

Obtinere - culturi de cereale infectate (secara)/chimica
- procese microbiologice in suprafata/submerse
Claviceps fusiformis, C. paspali or C. purpurea
Alcaloizii ergot
Mediul de cultura: carbohidrati + acid organic al TCA
(zaharoza + citrat)
Biotransformari ale steroizilor
Utilizarea microorganismelor in reactii de biotransformare a compusilor
utilizata cu succes in producerea de steroizi cu valoare terapeutica:
alergii,
procese inflamatorii,
afectiuni ale pielii precum si drept
contraceptive orale
Steroizi:
androgeni: testosteron
corticosteroizi: cortizon, hidrocortizon, prednison si
dexametazon
estrogeni: estradiol si estron
gestageni: progesteron
Biotransformari ale steroizilor
Initial obtinute prin extractie din tesuturi animale sau
procese chimice complexe, ambele foarte costisitoare.
In prezent numerosi steroizi sunt obtinuti in cadrul unor
procese ce imbina etape chimice si transformari microbiene
ce folosesc substraturi (steroli) cu pret de cost mic:



diosgenina - Dioscorea composita.
stigmasterol un produs secundar al fabricarii uleiului de soia
Biotransformari ale steroizilor
Fungi filamentosi: Rhizopus, Curvularia, Fusarium, Aspergillus
si micobacterii
Realizeaza etape/reactii cheie modificare a structurii de
baza a unui steroid ciclopentanoperhidrofenantren:
Hidroxilari in pozitiile 11 si 17
Clivari ale lanturilor laterale
Reactii de hidrogenare si dehidrogenare
Structura tetraciclica a unei
ciclopentanoperhidrofenantren
Biotransformari ale steroizilor
Biotransformare Substrat Produs Organism
1-dehidrogenare hidrocortizon prednisolon Arthrobacter simplex
11 alfa-hidroxilare progesteron 11 alfa-
hidroxiprogesteron
Rhizopus nigricans
11 beta-hidroxilare Compus S
Reichstein
hidrocortizon Curvularia lunata
Clivarea lantului
lateral
Beta-sitosterol androstadiendiona Mycobacterium
Dehidrogenarea nucleului A
prednizon, prednizolon, triamcinolon
Vaccinuri bacteriene
Culturi de bacterii inactivate termic/formaldehida

2 categorii:
ADN recombinant
- component celular (Ag perete celular,
Ag capsular)/
- component metabolic (toxine, anatoxine),
vaccinuri vii tulpini viabile atenuate
vaccinuri inactivate celule, component celular/metabolic
Michael J. Waites, Industrial Microbiology:
An Introduction, 2001
Exemple de vaccinuri utilizate in
practica medicala si de uz veterinar
Sanofi-Pasteur (25 % du march)
GlaxoSmithKline (23 %)
Pfizer ex-Wyeth (13 %)
Merck & Co. (11 %)
Novartis ex-Chiron Corporation (5 %)
Vaccinuri bacteriene
bioreactoare de dimensiuni mici - 1000 L
norme de bune practici, reglementari stricte
celule bacteriene
maximizarea productiei de biomasa
inactivarea celulelor termic/formaldehida
separare prin centrifugare
liofilizate
toxine sau antigene de suprafata
conditii de crestere optime pentru obtinerea de antigene celulare
specifice
toxine prelucrate termic Clostridium botulinum
Purificare precipitari cu sulfat de amoniu/cromatografie de afinitate
AMC
Adsorbtia adjuvant (saruri minerale hidroxid de Al, emulsii)

Vaccinuri virale
Cultivare animale, culturi de celule si tesuturi
Tehnicile de inginerie genetica producerea de vaccinuri virale recombinante
prin clonarea genelor virale intr-o celula microbiana adecvata

ex. factor virulenta hepatita B E.coli
Bacteriile lactice gazde pentru expresia unor Ag apartinand unor specii
bacteriene inalt patogene (toxina tetanica, toxina difterica) cu
administrare orala.
Proteine recombinante cu valoare terapeutica
cantitati reduse
pret de cost ridicat
efecte secundare nedorite
contaminare virusuri, prioni




Tesuturi animale/lichide
Tehnologia ADN recombinant > 400 de peptide si
proteine umane cu diferite aplicatii medicale 10%
FDA

Lipsite de antigenitate
Bioreactoare 2000 5000L
Michael J. Waites, Industrial Microbiology:
An Introduction, 2001
Hormon de crestere (somatotropina) hGH
Sintetizat in glanda pituitara controleaza cresterea
Preparatele hGH tratamentul naninismului hipofizar la copii
(boala congenitala)
1958 extras din glanda pituitara cadavre
Animale bovine, porcine ineficiente
1970 Kabivittrum (Suedia) si Genentech (SUA) dezvoltarea
de produse recombinante hGH E.coli
1985 - Protropina
Insulina
Hormon polipeptidic, 5808 Da, produs in pancreas
(insulele Langerhans)
Rol: reglarea glicemiei, metabolismul carbohidratilor,
lipidelor
Insulina pancreas bovin/porcin terapia diabet insulino-
dependent
Genentech Humulin 1981 (FDA)
E. coli, S. cerevisiae
Interleukine
citokine, IL1-IL15
1992 Chiron Corporation (Novartis) FDA preparat
IL2 recombinat (Proleukin) tratamentulul carcinomului
renal

Colagen
Pichia angusta si Pichia pastoris
Bacteriofagi
strategie alternativa la chemoterapia cu antibiotice
absenta mecanismelor de rezistenta si inalta specificitate
terapia holera, dizenterie, meningita, septicemie, tuberculoza si
infectii produse de S. aureus, Campylobacter si Pseudomonas


Enzime microbiene

polimeri insolubili precum celuloza, amidonul









Bacillus, Streptomyces
Saccharomyces cerevisiae ,
S. carlsbergensis ,S. fragillis
Aspergillus, Penicillium,
Mucor , Rhizopus.
Enzime de origine microbiana
Producerea enzimelor microbiene este determinata genetic

adaugarea de inductori si indepartarea represorilor
tehnici de mutageneza
tehnici de inginerie genetica


Producerea unei enzime - depinde de conditiile de mediu, pH,
temperatura, aerare si agitare.

Producerea industriala a enzimelor microbiene
separarea si purificarea
din mediul de cultura
selectarea microorganismelor
bune producatoare de enzime,
stabilirea conditiilor optime
pentru obtinerea enzimei,
producerea industriala
propriu-zisa,
Tehnici de screening
microorgansime producatoare de noi enzime
noi tulpini cu potential ridicat de productie a unei enzime
cunoscute


cultivarea in placi Petri
pe mediu solidificat cu agar
continand substratul specific
selectarea coloniilor bune producatoare
de enzime se face dupa diametrul zonei
de actiune asupra substratului.
cultivarea in mediu lichid a tulpinilor
selectate, cu scopul determinarii
cantitative a activitatii enzimatice si a
selectarii pe aceasta baza a celor cu
activitatea cea mai mare a enzimei dorite.

Principalele preparate enzimatice microbiene si
aplicatiile lor practice

Hidrolaze Glicozidaze - Oligozidaze
- Poliozidaze
Proteaze
Amidaze
Oxidoreductaze Glucozoxidaza si Catalaza
Izomeraze Glucozoizomeraza






Hidrolazele






Glicozidaze
a) Oligozidaze: beta-fructozidaza (invertaza)
Saccharomyces cerevisiae ,S. carlsbergensis

Utilizari: ca adaos la formula de preparare a miezului moale al
bomboanelor imbracate in ciocolata, obtinerea zaharului invertit destinat
bauturilor nealcoolice, lichiorurilor, inghetatei, diverselor concentrate
alimentare.
Zaharul invertit spre deosebire de zaharoza este mai dulce si avand o
solubilitate mai mare nu cristalizeaza.

b) Poliozidaze cele mai importante sunt amilazele, celulazele si
enzimele pectolitice.



amiloza amilopectina
Granule de amidon colorate cu
iod, observate la microscopul
optic
Structura moleculei de amidon
Microorganismele folosite pentru producerea de amilaze
sunt bacteriile si mucegaiurile.

Bacillus ca : B. subtilis, B. polymyxa, B.
amiloliquefaciens, B. macerans, B. strearothermophillus,
ale genului Streptomyces si genului Clostridium.

Aspergillus ca : A. niger, A. oryzae, A. wentii, A.
awamori, ale genului Rhizopus ca : R. tonkinensis, R.
delemar si unele specii ale genului Mucor.


ENZIME MICROBIENE
Enzime microbiene
Amidonul
asigurarea texturii a numeroase alimente
industrii ca agent de ingrosare, stabilizator coloidal,
agent de gelificare.
hidrolizate de amidon, sirop de glucoza, fructoza, derivate de
maltodextrina sau ciclodextrine.
obtinerea de etanol.
cele mai importante surse de amidon din punct de vedere
industrial sunt porumbul, tapioca, cartoful si graul.

Enzime microbiene
Amilaze
Siropul de fructoza se obtine prin conversia amidonului din porumb prin
trei reactii fiecare catalizate de o enzima microbiana:
1. alfa-amilaza actioneaza asupra lanturilor polizaharidice de amidon
scurtandu-le si reducand vascozitatea polimerului. Aceasta etapa
poarta numele de reactie de subtiere (lichefiere)
2. glucoamilaza produce monomeri de glucoza din lanturile de
oligozaharide rezultate din etapa anterioara proces numit zaharificare.
3. glucozo-izomeraza realizeaza conversia finala a glucozei la
fructoza, proces numit izomerizare.

amidon
amilazele si
glucoamilazele
sirop de glucoza fructoza
glucozo-
izomeraza
industria alimentara - productia de bauturi racoritoare
ENZIME MICROBIENE
-amilaza
-amilaza
maltoza si dextrina
Glucoamilaza
legaturile 1-4- -glicozidice de la capetele reducatoare
legaturile 1-4--glicozidice din amiloza si
amilopectina de la capetele nereducatoare
Aspergillus sp., Rhizopus sp
glucoza, dextrin si
izomaltoza
dextrina
legaturile 1-4- -glicozidice
AMILAZE
dextrinaza limita
hidroliza legaturilor 1-6-glicozidice
(dextrin limita si din izomaltoza)
glucoza
mucegaiuri
Izoamilaza
hidroliza legaturilor 1-6-glicozidice
fragmente mai mici si maltotrioza

Utilizari practice

Industrie Sursa Aplicatii
Bacillus
sp.
Aspergillus
sp.
Industria amidonului + - Lichefierea amidonului pentru producerea de
glucoza, maltoza
Morarit si panificatie - + Ameliorarea fainurilor deficiente in -amilaza
Industria spirtului si a
berii
+ + Zaharificarea materiilor prime, amidonoase,
inlocuind partial, sau total maltul de orz
Industria hartiei + - Lichefierea amidonului fara producerea de zahar,
pentru dimensionarea hartiei
Industria textila + - Dezancolarea fibrelor
Industria alimentara + - Ameliorarea utilizarilor furajelor tratate enzimatic
pentru cresterea pasarilor si viteilor
Industria zaharului + - Ameliorarea filtrabilitatii sucului de sfecla de zahar
prin degradarea amidonului din suc
Industria detergentilor + - Cresterea puterii de curatire a detergentilor
Aplicatii industriale
Conversia amidonului
B. amyloliquefaciens, B. stearotermophilus sau B.
licheniformis

Industria detergentilor
mareste capacitatea detergentilor de a indeparta pete dificile
II tip de enzime utilizate in prepararea detergentilor, 90% din
detergentii lichizi continand aceste enzime.
tulpini de Bacillus sau Aspergillus.
Aplicatii industriale
Producerea de biocombustibil
etanolul este cel mai utilizat biocombustibil lichid. Pentru producerea de
etanol, amidonul este cel mai utilizat substrat datorita pretului scazut si
disponibilitatiii ca material brut in majoritatea regiunilor din lume.

amidonul - solubilizat si apoi supus la doua etape enzimatice pentru
obtinerea de zaharuri fermentescibile.

bioconversia amidonului la etanol implica lichefierea si zaharificarea in care
amidonului este convertit la zaharuri folosind un microorganism amilolitic
sau enzime precum alfa-amilaze, urmata de fermentatie, in urma careia
zaharurile sunt convertite la etanol folosind un microorganism cum ar fi
Saccharomyces cerevisiae.

fuziunea de protoplasti a fost realizata intre o levura amilolitica S. fibuligera
si S. cerevisiae. In cursul primei etape a hidrolizei suspensiilor de amidon
sunt folosite alfa-amilaze obtinuta cu ajutorul bacterii termorezistente
precum B. licheniformis sau tulpini modificate de E. coli sau B. subtilis.
Aplicatii industriale
Industria alimentara
industria de procesare a a produselor alimentare in panificatie, fabricarea
berii, a prajiturilor, sucurilor din fructe si siropului de amidon.

Alfa-amilazele au fost intens utilizate in industria de panificatie. Aceste
enzime pot fi adaugate aluatului de paine pentru a degrada amidonul din
faina in dextrine mai mici care mai departe sunt fermentate de drojdii.

Adaugarea de alfa-amilaze aluatului conduce la crestearea ratei de
fermentatie si la reducerea vascozitatii aluatului conducand la imbunatatiri
ale volumului si texturii produsului. Mai mult, genereaza zaharuri aditionale in
aluat care imbunatatesc gustul, culoarea crustei si calitatilor de prajire a
painii. In plus generand compusi de fermentatie alfa-amilazele au un efect
anti-blocare in producerea painii creascand durata de valabilitate. In prezent
o amilaza maltogenica produsa de B. stearothermophilus este utilizata
comercial in panificatie. Amilazele sunt de asemenea folosite in limpezirea
berii sau sucurilor din fructe sau ca pretratament al furajelor pentru animale
pentru imbunatatirea digestibilitatii fibrei.

Aplicatii industriale
Industria textila
procesul de descleiere.
agenti de intarire precum amidonul sunt aplicati pentru preveni
ruperea firelor de tesut inainte de procesul de fabricatie pentru a
asigura un proces rapid si sigur.
amidonul este foarte atractiv pentru ca este ieftin, disponibil pe
piata in majoritatea regiunilor lumii si poate fi indepartat foarte
usor.
descleierea implica indepartarea amidonului din tesatura care
serveste ca agent de intarire. Alfa-amilazele indeparteaza in mod
selective amidonul si nu ataca fibra textila. Amilazele produse de
tulpinile de Bacillus sunt fost utilizate in industria textila.

POLIZAHARIDE EXTRACELULARE
MICROBIENE
agenti pentru ingrosarea si stabilizarea alimentelor,
medicamentelor si produselor industriale.
polimeri in procesele de recuperare tertiara a titeiului
din zacamintele uzate.
Principalele polizaharide microbiene de importanta
comerciala si microorganismele producatoare.
Curdlanul
Alcaligenes faecalis var. myxogenes succinoglucan
proprietatile generale ale gelului de curdlan sunt intermediare intre
cele ale gelatinei (un gel elastic) si cele ale agarului (un gel fragil).
in industria alimentara sau ca suport de imobilizare a enzimelor sau
ca agent de legare.
Scleroglucanul
Sclerotium glucanicum, S. delphnii, S. rolfsii
substraturi lignocelulozice
vascozitatea, stabilitate la temperaturi ridicate, intr-un domeniu larg de
valori de pH si in prezenta electrolitilor.
utilizat ca agent de suspendare, gelificare sau de acoperire in diferite
industrii - farmaceutica.

Pullulanul
Aureobasidium (Pullularia) pullulans
capacitatea de a forma filme (membrane). Filmele formate prin aplicarea unei
solutii de 5 - 20% polizaharid pe o suprafata neteda au o permeabilitate mica
fata de oxigen, comparativ cu alte materiale utilizate precum celofanul sau
polipropilena.

Azotobacter vinelandii si Pseudomonas aeruginosa.
Alginatul are numeroase utilizari in industria alimentara, precum si in alte
industrii nealimentare.
Heteropolizaharide
Alginatul
Utilizarile exopolizaharidelor
microbiene
Cu exceptia dextranului, folosit in scopuri farmaceutice,
dintre celelalte polizaharide microbiene, cele mai multe
utilizari le au, in prezent xantanul si alginatul.