DISBIOSI, INFIAMMAZIONE E CANCEROGENESI

Un altro aspetto ampiamente studiate che ci permette di parlare di un’eventuale relazione tra l’insorgenza
del processo cancerogenetico e un’eventuale alterazione della flora batterica intestinale, e quindi l’istaurarsi
di una condizione di disbiosi, lo possiamo evidenziare nel coinvolgimento del microbiota nel processo di
cancerogenesi in tre parti.
In ciascuna delle tre parti possiamo evidenziare come un’alterazione della flora batterica intestinale possa
essere responsabile della cancerogenesi e del sostentamento di un tumore già in atto.
Nella prima parte riscontriamo un’alterazione della flora batterica e un ruolo importante è l’istaurarsi di uno
stato di infiammazione cronica che porta al sopravvento di specie che producono molecole associate alla
loro presenza, che sono dei partner molecolari che vengono riconosciuti dal nostro sistema immunitario, che
hanno un’origine microbica e generano l’attivazione del sistema immunitario che inizierà a generare delle
sostanze, tra cui le citochine infiammatorie, che sostengono in un processo tumorale determinati meccanismi
tra cui la proliferazione tumorale inibendo anche i processi di morte cellulare programmata detta apoptosi.

Nella seconda parte, ad un’alterazione del microbiota viene attribuito l’inizio del processo tumorale.
Alcune molecole prodotte da alcuni batteri patogeni e alcune modifiche che questi batteri, o delle sostanze,
che possono indurre nella cellula ospite sono delle lesioni primarie che inducono la trasformazione di una
cellula normale in cellula tumorale.
Un esempio può essere considerato la produzione di tossine come la colibactina o alcune specie batteriche
gram negativi i quali sono dei potenziali patogeni per la mucosa intestinale.
Questi batteri sono responsabili dell’istaurarsi di stress ossidativo causato dalla produzione di radicali liberi,
producendo dei danni alla molecola di DNA.
L’azione cancerogena è data dunque da un effetto genotossico causando rotture a doppio e a singolo
filamento o l’ossidazione di basi.

Nella terza parte: Un altro meccanismo che associa l’istaurarsi di un tumore all’alterazione del microbiota è
legata agli effetti negativi che alcune specie di batteri possono avere.
Molto spesso dei batteri patogeni possono essere responsabili di reazioni come la conversione dell’etanolo in
acetaldeide, o l’attivazione di molecole tossiche per il nostro organismo.
Questi batteri potrebbero anche aumentare la produzione degli acidi biliari, i quali possono essere
responsabili dell’incremento dei ROS.

Ad oggi abbiamo diverse evidenze che legano il preponderare di alcune specie batteriche all’insorgenza di
alcuni tipi di tumore.
Per esempio, un’insorgenza di Helicobacter pylori causa l'adenocarcinoma esofageo, l'adenocarcinoma
gastrico, il linfoma gastrico, il carcinoma colorettale.
Una preponderanza di specie come la salmonella enterica typhi causa il carcinoma alla vescica o ancora il
bacteroides fragilis causa il cancro del colon retto, così come l'helicobacter hepaticus causa il cancro epatico.

Dunque, come abbiamo visto, viene data una notevole importanza all’insorgenza di disbiosi, che si traduce
nell’istaurarsi di condizioni infiammatorie che causa un’iperstimolazione del nostro sistema immunitario.
È quindi fondamentale monitorare la presenza di una disbiosi; questo è possibile in tre modi:
 1. L’analisi della calprotectina la calprotectina è una calcio/zinco proteina che normalmente è
presente all’interno dei neutrofili e la sua presenza, nelle feci, è dovuta alla migrazione dei neutrofili
nel tessuto gastrointestinale con l’insorgenza di un processo infiammatorio.
2. Il test di permeabilità intestinale, (test lattulosio/mannitolo urine)  questo test si basa sulla
somministrazione di due carboidrati a peso molecolare differente.
Di solito un monosaccaride e un disaccaride che, in generale, non devono subire idrolisi o essere
trasportati attivamente a livello della mucosa intestinale.
Questo perché la concentrazione dei due zuccheri o dei derivati degli zuccheri, viene misurata al
livello renale, ed in particolar modo nelle urine.
Dunque, se gli zuccheri vengono idrolizzati non possono essere riscontrati nelle urine e, d’altra parte
non può essere trasportato attivamente perché se così fosse la concentrazione risulterebbe variata.
Di fatti, la concentrazione dello zucchero deve essere in funzione di un passaggio che avviene o per
via para-cellulare o trans-cellulare, in modo tale da avere informazione sulle cellule della mucosa
epiteliale. Se lo zucchero passa nelle urine vuol dire che c’è una “Rottura” nelle giunzioni occludenti
delle cellule della mucosa.
3. Il breath test dell’“overgrowth batterico” (LO RITROVI NELLE PROSSIME LEZIONI)
Per esempio, tramite l’analisi delle urine è possibile riscontrare la presenza dello scatolo che funge da
marcatore presente nell’intestino crasso e dell’indacano (indicatore di disbiosi dell’intestino tenue).
Questi due sono dei derivati dell’aminoacido triptofano e indicano la presenza di putrefazione e
fermentazione a livello intestinale dato da alcuni batteri.

Abbiamo dei metodi per valutare permeabilità intestinale e l’integrità epiteliale

Anche il microbiota si può misurare ottenendo delle informazioni inerenti alle specie batteriche presenti in
un dato momento nell’intestino del soggetto preso in esame.
In caso di disbiosi si possono andare a somministrare dei probiotici andando a correggere il microbiota se
alterato; inoltre, siamo già nella fase del trapianto del microbioma.
METODI MISURAZIONE MICROBIOTA
Abbiamo potuto evidenziare come nel corso del tempo i metodi d’indagine del microbiota si sono evoluti.
La svolta delle indagini del microbiota si è avuta nell’800 quando si è arrivati alla scoperta che i batteri, ma i
microrganismi in generali, potevano essere messi in coltura e fatti crescere sui terreni sintetici in delle
piastre.
Questo ci ha permesso di evidenziare diversi ceppi batteriche, analizzare in che modo crescono, a quali
temperature etc.
Questo però ha un grande limite che è non tutte le specie batteriche potevano essere coltivate poiché non vi
sono dei terreni in grado di accoglierli nel giusto modo, o ancora, non si riescono ad isolare direttamente.
Questo limite è stato superano nel 1990 grazie allo sviluppo di tecnologie come il sequenziamento del DNA
massiccio, che ha permesso di poter analizzare direttamente tutte le specie batteriche presenti nel mio
campione.
Questi metodi prendono il nome di colture indipendenti in cui si va ad analizzare il materiale genetico dei
microrganismi che popolano un ecosistema, un’ambiente etc.
Dunque, i metodi di analisi sono due:
-si può evidenziare il loro DNA (culture-independant methods)
-l’RNA ribosomale batterico è il miglior marcatore batterico
Ad oggi, con le nuove tecnologie, ho la possibilità di analizzare direttamente il materiale genetico del
microrganismo e, successivamente, fare le indagini di mio interesse.
Ad oggi, dunque, parliamo di scienze omiche, ossia lo studio in contemporanea e massiccio di tutto quello
che riguarda la comunità microbica.
Posso dunque condurre un’analisi filogenetica che mi andrà a determinare quali tipi di batteri sono presenti,
un’analisi meta genomica che mi andrà ad evidenziare qual è il potenziale genetico del microbiota,
un’analisi meta proteomica, nel caso delle proteine e metabolomica, nel caso dei metaboliti che mi vanno ad
indicare quali attività i microrganismi stanno svolgendo.

L’aver introdotto le scienze omiche anche nello studio del mondo dei microrganismi ha permesso la
Rivoluzione Metagenomica in quanto abbiamo la possibilità di analizzare contemporaneamente il genoma
di tutti gli organismi che sono contenuti in un ecosistema, nell’intestino o, in generale, in un’ambiente.
Quindi, mentre la messa in coltura mi limitava l’analisi delle specie microbiche, con la genomica ho uno
spettro più ampio di analisi.

C’è stato anche uno studio che è andato a ricercare il microbioma umano che colonizza i vari distretti, in
particolare l’intestino, con l’obiettivo di trovare delle risposte sul fatto che si pensava che ci fosse un
microbioma comune fra gli individui della stessa specie, comprendere cosa potrebbe causare un’alterazione
del microbioma etc.

Normalmente si seguono delle fasi quando si deve fare il sequenziamento di tutto il genoma che proviene da
una popolazione batterica.
Come prima cosa devo capire cosa e quali informazioni si vogliono ottenere da questo studio.
Per esempio, se io voglio sapere, dal punto di vista qualitativo, quali specie batteriche popolano un’ambiente
e quali sono assenti, dovrò condurre un’analisi di sequenziamento massiccio definita targhettizzata.
Questa la faccio utilizzando solamente le sequenze che mi permettono di fare filogenetica.
Al contrario se io voglio ottenere delle informazioni più ampie ed approfondite dovrò condurre un’analisi
che indaga su tutto il DNA di quella specie, e non in piccole parti.
Il mio campione può essere prelevato da qualsiasi campione di origine biologica umana o ambientale.
Il passaggio fondamentale è l’estrazione del materiale genetico attraverso delle procedure o automatizzate,
tramite gli estrattori, o manuali ad opera dell’operatore.
Abbiamo diverse tecniche che mi permettono di sequenziare il DNA conoscendo, in tal modo, l’ordine delle
basi.
Otterrò un output, ossia tutte le sequenze del DNA contenuto nel mio campione che appartiene a tutti i
batteri.
Di conseguenza devo, tramite l’analisi dei dati, assemblare la sequenza mettendo insieme tutte le sequenze
del DNA trovate, si vanno a confrontare le sequenze trovate con quelle che sono riportate nei database in
modo tale da identificare a chi appartiene una determinata sequenza e, una volta ottenuta la mia mappa
“nominata”, posso fare delle analisi statistiche per confrontare i risultati che vengono dal mio campione con
un altro campione evidenziando analogie e differenze.

Per quanto riguarda la Metagenomica basata sullo studio della subunità 16S del RNA ribosomiale ha dei
vantaggi come il fatto che è ben standardizzata poiché non è necessario sequenziare tutte le subunità 16S
dell’rRNA poiché potrei selezionare alcune specie di mio interesse poiché si base su metodiche precisi; i
costi del sequenziamento sono molto bassi poiché sequenzi pochi frammenti e amplifichi solo la parte di tuo
interesse non avendo contaminazione dell’ospite come cellule epiteliali della mucosa intestinale etc.
Ovviamente abbiamo anche degli aspetti peculiari di questa tecnica come il fatto che la scelta dei primer può
influenzare i risultati verso determinati organismi, non identifica i virus, sono necessari dei primer differenti
per archei ed eucarioti.

La Metagenomica shotgun che si basa sull’analisi dei frammenti del materiale genetico nel quale non c’è
l’utilizzo dei primer, può dunque identificare tutti i microbi (euks, virus, ecc.), fornisce informazioni
funzionali ("Cosa stanno facendo?").
Questo meccanismo è più costoso poiché si sequenziano milioni di sequenze; ci potrebbe essere la
contaminazione dell'host/del sito che può essere significativa, potrebbe non essere in grado di sequenza
microbi rari poiché nei database non sono presenti.

Delle tecniche di studio del microbioma sono:

-la Next Generation Sequencing caratterizza la flora batterica intestinale, fornendo indicazioni sullo stato di
salute generale dell’individuo, del suo intestino e importanti spunti di approfondimento di tutte quelle che
sono le correlazioni fisiopatologiche tra la popolazione microbica intestinale e i diversi organi e sistemi che
con l’intestino comunicano costantemente.
-il microbalance test: questa tecnica richiede diversi step tra cui richiesta dei kit per la raccolta e il trasporto
del campione biologico; raccolta del campione biologico invio del kit al laboratorio per l'analisi; una volta
che il kit e arrivato al laboratorio di analisi avviene l'estrazione del DNA batterico; segue una preparazione
della libreria di DNA ribosomiale 16 S; abbiamo poi un sequenziamento del DNA ribosomiale 16 S
mediante NGS con l’analisi bioinformatica; infine abbiamo l'elaborazione del report con commenti e
suggerimenti del medico specialista.
-Al Gemelli di Roma, un test al momento unico in Europa, valido sia per i bambini che per gli adulti,
analizza l'ecosistema intestinale composto da trilioni di batteri. NGS + Spettrometria di massa : mappa
genetica e biochimica.
-Il Test Genetico Microbiota: fornisce l’indice di disbiosi del microbiota intestinale, cioè il grado di
alterazione quali-quantitativa (assenza o presenza) delle varie specie batteriche dell’intestino.
-LIFE DNA Test Microbiota Plus: equilibrio quali-quantitativo delle specie batteriche del microbiota
intestinale e la sua correlazione con stati infiammatori (Calprotectina fecale) o di alterata permeabilità
(zonulina fecale).

Per quanto riguarda l’ FMT trapianto di microbiota fecale è un trattamento medico non farmacologico in
fase sperimentale.
Lo scopo di questa innovativa terapia e quello di ripristinare l'ecologia microbica e l'omeostasi del colon,
reintroducendo un microbiota umano sano derivante dalle feci di un donatore, in un paziente affetto da
patologia socia te con l'alterazione della flora batterica intestinale.
La procedura che si esegue è la seguente:
-Screening infettivologico del donatore
-Produzione della mappa del microbiota del donatore
-Raccolta di feci del donatore
-emulsione feci del donatore in soluzione fisiologica
-filtrazione dell'emulsione per eliminare detriti macroscopici
-introduzione per via rettale in sede endoscopica nel paziente ricevente

si prosegue con una valutazione clinica dell’effetto benefico sul ricevente in follow up, vi sarà la valutazione
del ripristino del microbiota sano nel ricevente mediante le mappe di microbiota in follow up e la
valutazione per un successivo FMT .