Le moderne

biotecnologie
Biotecnologie cellulari:
colture cellulari (o in vitro)

Strumenti per effettuarle:

-Cappa di sicurezza biologica a
flusso laminare, per la sicurezza
dell’operatore;
-Stufe a secco e autoclavi, per
sterilizzare la vetreria e i terreni
di coltura;
-Incubatore, per garantire
condizioni ambientali ottimali
alle colture;
-Centrifuga da laboratorio, per
separare corpi di diversa
densità;
-Microscopio a contrasto di fase,
per osservare le cellule.
Colture cellulari vegetali (o micropropagazione)
Servono per:
-Produrre piante omogenee;
-Produrre un elevato numero di piante;
-Eseguire manipolazioni genetiche;
-Approfondire le conoscenze scientifiche;
-Migliorare la ricerca fitopatologica.

Constano di tre fasi:

-Fase di prelievo;
-Fase di moltiplicazione;
-Fase di ambientamento.

Si classificano in:
-Colture organizzate;
-Colture non organizzate;
-Coltura organizzata o non-organizzata.
Colture cellulari vegetali (o micropropagazione)
Ne esistono di vari tipi:
-Coltura di protoplasti, che consente
di far crescere in vitro cellule derivate
da vari organi della pianta;
-Coltura di piante intatte, per quelle
piante che in natura trovano difficoltà
nel riprodursi, come le orchidee;
-Coltura di embrioni, adottata per
superare il grave problema
dell’impoverimento del germoplasma
delle specie coltivate;
-Coltura di meristemi, eseguita per
fini di prevenzione fitosanitaria,
consente di ottenere piante sane
partendo da una affetta da virosi;
-Coltura di antere e di ovari, per
poter meglio sfruttare le mutazioni di
alcuni geni o cromosomi;
-Semi artificiali, possono essere
spostati nel tempo e nello spazio.
Colture cellulari animali
La loro creazione trova numerose
applicazioni in: medicina,
oncologia, genetica cellulare e
farmacologia.
L’allestimento delle colture prevede:
-Frammentazione del tessuto e dissociazione
delle cellule mediante digestione con
tripsina;
-Semina delle cellule in uno specifico terreno
di coltura e loro crescita condizioni fisiche
controllate;
-Distacco delle cellule e allestimento di
nuove colture.
Le cellule animali si possono inoltre
classificare in:
-Fusiformi o poligonali;
-Aderenti o non aderenti.
Colture cellulari animali:
le cellule staminali
In quasi tutti i campi della scienza legata
alla medicina, sono di particolar interesse
le cellule staminali, particolari cellule non
specializzate (o indifferenziate).

Le cellule staminali si distinguono

in:
-Unipotenti, che riproducono solo le cellule
del tessuto a cui appartengono;
-Multipotenti, che possono evolvere una
cerchia ristretta di cellule;
-Pluripotenti, che possono differenziarsi in
quasi tutti i tipi di cellule specializzate;
-Totipotenti, che si differenziano in tutti i
tipi di cellule, in quanto sono presenti
nell’embrione.
Colture cellulari animali:
la clonazione animale

La clonazione animale consente di avere una

copia identica di un animale di interesse
zootecnico o biomedico.

Ne esistono di tre tipi:

-La clonazione embrionale, tecnica che consiste
nell’effettuare una fecondazione in vitro e
separare le cellule che si formano dalla divisione
dello zigote, ciascuna delle quali si svilupperà
dando origine ad una serie di embrioni gemelli
che vengono trasferiti in utero;
-La clonazione riproduttiva, che si verifica
quando la fecondazione è sostituita
dall’inserimento di un nucleo prelevato da una
cellula somatica dell’individuo da clonare in un
ovulo denucleato(come il caso della pecora
Dolly);
-Clonazione terapeutica, che fa riferimento ai
blastomeri, le cellule che formano l’embrione nei
suoi stadi iniziali.
Gli ibridomi
Gli ibridomi sono cellule miste con
caratteristiche diverse da quelle delle linee
parentali.
Nei vegetali la tecnica consiste:
-Nella rimozione della parete per ottenere i
protoplasti;
-Nella fusione dei protoplasti che formano gli
ibridomi;
-Nella moltiplicazione e sviluppo degli ibridomi
fino ad ottenere delle piante.
Ne è un esempio il pomato, un ibrido con
caratteristiche della patata nella parte ipogea
e del pomodoro nella parte epigea.
 Gli ibridomi:
gli anticorpi monoclonali

Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati per

eseguire test ormonali, per fare la diagnosi
di malattie virali o la diagnosi precoce di
tumori.
La tecnica della produzione di anticorpi
monoclonali è distinta in tre fasi:
-Immunizzazione: vengono isolati i linfociti B
e miscelati con cellule tumorali di mieloma
per ottenere ibridomi possedenti il materiale
genetico delle due cellule;
-Coltura selettiva: le cellule sono poste in un
terreno di coltura selettivo. Qui restano solo
le cellule di ibridoma che sono immortali;
-Produzione di anticorpi: gli ibridomi ottenuti
producono tutti gli anticorpi possibili in
relazione alle caratteristiche degli antigeni.
Le biotecnologie molecolari:
la reazione a catena della polimerasi
Per gli studi di biologia molecolare le
strumentazioni attuali non riescono a
identificare e a utilizzare soltanto poche
molecole di DNA, pertanto è stata messa a
punto la tecnica della PCR che consente di
avere una grande quantità di copie di una
molecola dell’acido nucleico. Il processo di
ampliazione del DNA avviene in natura per
azione di enzimi speciali chiamati DNA
polimerasi.
La tecnica prevede tre fasi:
-Denaturazione del DNA;
-L’appaiamento di tratti complementari della
catena aperta con brevi sequenze dette
primer;
-L’estensione, che consiste nella replicazione
di tratti dei filamenti per mezzo dell’enzima
polimerasi in presenza di nucleotidi.
Le biotecnologie molecolari:
sequenziamento

Il sequenziamento è una tecnica che

serve a stabilire con precisione l’ordine
delle basi in un frammento di DNA.

La tecnica si compone di diverse fasi:

-Preparazione del DNA stampo e
sequenziamento con marcatura;
-Separazione usando elettroforesi su
gel o capillare;
-Rilevazione di frammenti di DNA;
-Lettura della sequenza usando
l’autoradiografia o la reazione con i
fluorocromi.
L’ingegneria genetica

Questa tecnica comprende più fasi:

-L’identificazione del gene che
produce una determinata proteina
(negli eucarioti si ricorre ad un
enzima, la trascrittasi inversa);
-L’isolamento, che avviene grazie a
particolari forbici molecolari, gli
enzimi di restrizione
(endonucleasi);
-Il trasferimento di frammenti di
DNA estraneo nelle cellule
batteriche, che avviene per mezzo
di un vettore.
L’ingegneria genetica:
i vettori genici
I vettori genici sono sequenze di DNA nelle
quali è possibile inserire altre sequenze
nucleotidiche in grado di integrarsi con il
DNA-bersaglio e di introdurvi il gene
esogeno.

I vettori possono essere di diversa natura:

-Vettori virali, utilizzati soprattutto per
introdurre geni esogeni nei batteri e nelle
cellule eucariote animali sfruttando la capacità
dei virus di integrare il loro DNA con il genoma
cellulare che infettano;
-Plasmidi, utilizzati soprattutto se il DNA da
inserire non è di grandi dimensioni;
-Cosmidi, vettori artificiali capaci di trasportare
inserti di DNA di grandi dimensioni;
-Vettori navetta, compatibili con diverse
cellule, ad esempio batteri/lieviti o
batteri/animali;
-Cromosomi artificiali, con i quali è possibile
utilizzare i batteri per clonare pezzi grossi di
DNA.
 L’ingegneria genetica:
trasferimento

I metodi per il trasferimento delle

macromolecole di DNA nelle cellule sono:
-L’elettroporazione, dove le cellule sono
immesse in una soluzione contenente DNA
e sottoposte a un breve impulso elettrico
che permette al DNA di entrare nel
citoplasma;
-Gene gun, dove ci sono pistole che
sparano ad altissima velocità nei tessuti
particelle di oro rivestite del gene che
interessa in grado di attraversare la
membrana;
-Microiniezione, dove si usano sottilissimi
aghi di vetro, con i quali il DNA estraneo
viene iniettato nelle cellule.
L’ingegneria genetica:
DNA e RNA antisenso

Il metodo consiste nel costruire in

laboratorio dei frammenti di DNA
costituiti da una piccolo numero di
nucleotidi, detti oligonucleotidi
antisenso che, introdotti nella cellula,
catturano l’mRNA e formano zone dette
duplex artificiale
Gli oligonucleotidi antisenso
possono essere utilizzati per
fabbricare nuovi farmaci con azione:
-Antivirale, quando la proteina
bersaglio è quella del virus
essenziale alla sua moltiplicazione;
-Antitumorale, quando la proteina
bersaglio è quella essenziale alla
crescita delle cellule tumorali.
 La terapia genica
La terapia genica consente di curare
una malattia fornendo all’organismo
i geni di cui è privo o sostituendo
quelli malati.
La tecnica consiste nel trasferire
geni di un organismo in un altro
per attivare in modo
permanente la funzione che era
venuta a mancare.
Il gene inserito nel patrimonio
genetico della cellula viene
definito transgene. Per
veicolare il transgene si
utilizzano i vettori genici, che
possono essere virali o non
virali.
 La terapia genica

Le vie per l’introduzione dei vettori sono

due:

-In vivo: questo metodo, ancora in via di

sviluppo, consiste nell’introduzione di
geni per mezzo di vettori “ intelligenti”
che raggiungono le cellule bersaglio in
cui deve essere sostituito il gene;
-Ex vivo: si rimuovono alcune cellule del
paziente e le si mettono in contatto con il
vettore contenente il nuovo gene
affinché avvenga l’inserzione; le cellule
vengono così corrette e reintrodotte nel
paziente.
 Grazie per
l’attenzione

Mansueto Alessandro
3^A