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Enrique Iáñez

(Adaptado de una conferencia dentro de los Cursos de


Verano del Centro Mediterráneo de la Universidad de Granada. Motril,
septiembre de 1997)

Índice:
1. INTRODUCCIÓN
2. MÉTODOS DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
3. TIPOS DE MANIPULACIONES EN PLANTAS
4. ALGUNOS RASGOS MANIPULADOS
5. EXPECTATIVAS DE FUTURO
6. LAS PLANTAS COMO BIORREACTORES

1. INTRODUCCIÓN
Desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel la mejora de las plantas de
cultivo dejó de ser meramente empírica y se convirtió en científica.. Las
variedades se seleccionan por ciclos de polinización cruzada (hibridación) y
selección. Se han ido creando variedades selectas que han terminado
desplazando a las antiguas. Por ejemplo, el trigo de invierno es prácticamente
la única variedad empleada en Occidente para la fabricación del pan.
Luego vino la introducción de la mecanización en la agricultura, junto con la
aplicación de productos químicos (fertilizantes, plaguicidas, herbicidas).
La Revolución Verde (años 60), con sus nuevas variedades híbridas y sus
prácticas intensivas con abonos y pesticidas llevaron a grandes aumentos de
producción en muchos países que antes tenían graves problemas de suministros
de alimentos (China, India, partes de Latinoamérica).
Estamos entrando en una nueva era de la agricultura, de la mano de las nuevas
biotecnologías (BT), con un papel central de la genética molecular. Ello se ha
debido a un auge espectacular de los conocimientos básicos de biología vegetal
y a la aplicación de las técnicas de Ingeniería Genética (I.G.).

A partir de ahora, la "revolución" agrícola va a depender menos de


innovaciones mecánicas o químicas, y va a estar basada en un uso
intensivo de saber científico y de técnicas moleculares y celulares.

Aunque la BT agropecuaria ha tardado en arrancar (ya estaba en marcha


la I.G. aplicada a la producción de fármacos), su desarrollo está siendo
espectacular, y se esperan grandes innovaciones con repercusiones
comerciales en los próximos lustros.

Promesas de la BT agrícola:

aumentar productividad y reducir costes


innovaciones y mejoras en los alimentos
prácticas agrícolas más "ecológicas".

Pero además la manipulación genética de plantas tendrá un impacto en


otros sectores productivos:

floricultura y jardinería
industria química
industria farmacéutica

La punta de lanza y parte más espectacular de esta BT es la I.G. de


plantas: la creación de plantas transgénicas a las que hemos introducido
establemente ADN foráneo que puede ser no sólo de origen vegetal, sino
de animales o de microorganismos.

Pero no podemos olvidar que la BT vegetal es más amplia, incluyendo


otras técnicas, pero todos estos nuevos métodos a su vez sirven para
que los programas tradicionales de mejora genética se realicen más
racionalmente, con más efectividad y en menor tiempo.

Algunos de los avances de la BT vegetal:

Proyectos genoma de arroz (como modelo de monocotiledóneas) y


de Arabidospis thaliana (modelo de dicotiledóneas). Se están obteniendo datos
moleculares y genéticos sobre procesos básicos de las plantas. (por ejemplo,
biología del desarrollo y diferenciación de órganos). Identificación de genes
responsables de rasgos complejos, muchos de ellos de importancia agronómica.
Clonación (aislamiento) de genes, que luego servirán para hacer I.G.,
introduciéndolos en otras plantas.
La mejora tradicional se ha basado (y lo seguirá haciendo) en la obtención,
evaluación y selección de alelos valiosos. Lo que aporta la BT es, p. ej.,
marcadores moleculares que permiten rastrear la segregación de estos alelos
de una forma más rápida, racional y efectiva, por lo que los programas de
mejora tradicional se ven potenciados.
Juegos de marcadores moleculares, repartidos por el genoma, y para los que se
suele recurrir a la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
RFLP
RAPD (ADN polimórficos amplificados aleatoriamente)
AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados)

Esto ya se está haciendo en muchas especies, incluso en leñosas


(árboles). Conforme estos métodos se vayan automatizando, los
programas serán más rápidos.

Además, su uso está aportando datos evolutivos valiosos: p. ej., la


mayor parte los genomas de cereales poseen sintenia (colinearidad de
su organización genómica), con claros indicios de eventos de
reordenaciones. Lo que se descubra en una especie (p. ej., arroz) podrá
investigarse fácilmente en otra. Incluso puede que cuando entendamos
mejor la base genético-evolutiva de las diferencias adaptativas de los
diferentes cereales, podamos los humanos hacer "evolución artificial",
creando nuevas especies adaptadas a nuestros intereses.

La obtención de plantas transgénicas (manipuladas por I.G.) depende de


la introducción (normalmente en cultivos de tejidos) de ADN foráneo en
su genoma, seguido de la regeneración de la planta completa y la
subsiguiente expresión de los genes introducidos (transgenes).

Normalmente, para que un gen pueda funcionar en la planta, hay que


hacer in vitro una "construcción genética artificial": para ello se suele
colocar delante de la parte codificadora que nos interesa una porción de
ADN que permite esa expresión (promotores, intensificadores de la
transcripción).

Podemos incluso escoger nuestros promotores: algunos inducen la


expresión en casi todos los tejidos de la planta, de forma continua
(constitutiva); en cambio, otros logran que el transgén se exprese sólo
en determinados órganos o tejidos, o bajo el efecto inductor de alguna
sustancia química.

El florecimiento de la IG vegetal se debe principalmente a dos grandes


avances de la década de los 80:

protocolos experimentales para la regeneración de plantas completas fértiles a partir


de cultivos de células o tejidos in vitro;
métodos para introducir el ADN exógeno, bien sea de modo directo o indirecto,
seguido de su inserción en el genoma y su expresión.
Regeneración de plantas a partir de cultivos

En principio se intentó a partir de protoplastos, pero es laborioso y no funciona con


muchas plantas
A partir de discos foliares

Pero en los últimos 10 años hemos aprendido a hacerlo mejor: la clave del éxito
consiste en extraer porciones de tejidos inmaduros (explantes), que siguen
conservando su potencial morfogenético (totipotencia) y cultivarlos en medios
nutritivos suplementados con mezclas de dos tipos de hormonas vegetales: auxinas
(que tienden a inducir crecimiento de raíces) y citoquininas (inducen caulogénesis). Lo
que se obtiene en principio es un cultivo embriogénico que forma el llamado embrión
somático. Éste retiene el potencial morfogenético durante mucho tiempo. De este
embrión se puede a su vez regenerar plantas completas normales y fértiles.

Esto ha permitido que actualmente se puedan regenerar casi todas las


plantas de interés agrícola: cereales, leguminosas, hierbas forrajeras,
caña de azúcar, papaya, plátano, etc.

Métodos de transformación genética


Perlitas microscópicas de oro o tungsteno se recubren del ADN de
interés, y se disparan a gran velocidad con una pistola especial. Las
células en la línea directa del proyectil pueden morir, pero a su
alrededor muchas células captan el ADN sin daños.

Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema.

Sirve para plantas que son más difíciles de cultivarse sus tejidos
(cereales, leguminosas), aunque tiene el inconveniente de que el ADN
puede insertarse en copias, y puede ser inestable.

El ADN se mezcla con protoplastos, y se aplican corrientes elevadas, lo


que provoca la entrada de aquél.

Microbalística (biolística)
Electroporación
Co-cultivo de células o tejidos con Agrobacterium tumefaciens

La biología de esta bacteria


Agrobacterium tumefaciens del suelo que lleva haciendo ingeniería genética
por su cuenta con las plantas desde hace millones de años. Nosotros hemos
aprendido a aprovechar sus extraordinarias habilidades.
La bacteria es un patógeno de plantas, induciéndoles una malformación
llamada tumor de la agalla. Establece con la planta una especie de
"colonización genética" que obliga a la planta a fabricar una sustancia de la
que sólo se puede nutrir esta bacteria. El tumor es una especie de fábrica de
esas sustancias, para el solo beneficio de Agrobacterium.
La bacteria es atraída por sustancias que la planta excreta en sus zonas
abiertas por pequeñas heridas. Por allí se introduce, quedando en los espacios
intercelulares, y es entonces cuando transfiere a la célula vegetal un trozo de
su material genético: una porción de un plásmido (ADN circular
extracromosómico bacteriano), que se integrará en alguna zona del genoma de
la planta.

Descripción del plásmido Ti:

ADN-T, que es lo único que se transfiere. Posee borde izquierdo, borde derecho, gen
de biosíntesis de hormona vegetal, gen de síntesis de opina.
genes vir que provocan la transferencia del trozo T.

genes de catabolismo de opinas (que permiten que la bacteria se nutra de estas


sustancias).
El ADN-T entra al núcleo y se inserta al azar en algún sitio del genoma. Allí se
expresan sus dos genes: el de las hormonas provoca crecimiento descontrolado de las
células vegetales (de ahí el tumor); el otro obliga a esas células a fabricar grandes
cantidades de opinas, una sustancia que la planta no puede aprovechar; y la excreta.
Así pues, las bacterias se encuentran con un nicho ideal para nutrirse y multiplicarse:
la planta se ha convertido en una especie de esclava metabólica que mantiene el
crecimiento de la bacteria en el seno del tumor de la agalla.

Vectores a partir del plásmido Ti

Suelen ser de uno de dos posibles tipos:

vectores binarios
vectores recombinativos (cointegrativos)

En esencia, hemos "vaciado" el interior del ADN-T, dejando de él sólo los


bordes (imprescindibles), y lo hemos sustituido por dos genes: uno es un
marcador para localizar o seleccionar las células que se hayan
transformado; el otro es el gen que queremos poner a trabajar en la
planta.

Ahora introducimos nuestro vector (con la correspondiente construcción


genética) en una cepa de Agrobacterium a la que hemos "desarmado" su
plásmido Ti (con objeto aprovechar sus funciones de transferencia del
ADN-T, pero inactivándole sus funciones patógenas).

Ejemplo de uso: introducción del gen Bt que determina la toxina


antiiinsecticida de la bacteria Bacillus thuringiensis.

Recientes progresos con vectores de Agrobacterium

Hasta hace muy poco este sistema no se podía aplicar a monocotiledóneas. Pero
recientemente, se ha logrado en:

arroz (aunque de una variedad -Japonica- que no es tan interesante como la Indica)

maíz

Esto es importante, porque las monocotiledóneas son esenciales, sobre


todo en países en desarrollo, y porque este sistema es más fiable que
otros (más estable, una sola copia del transgén). Si en el futuro esto se
amplía a trigo, cebada, etc., se habría dado un gran paso en la mejora
de cereales.

Método para transformar la planta entera (no hay que recurrir al más tedioso sistema
de cultivo in vitro):

Las semillas de la planta se mezclan con la bacteria y se procede a la germinación y


crecimiento del vegetal: parece que quedan bacterias retenidas hasta que al llegar la
floración transmiten el ADN-T al zigoto.
Otro método consiste en sumergir plantas a punto de florecer en un cultivo fresco
de Agrobacterium, y aplicar vacío.
En ambos casos se espera a tener las semillas, se germinan, crecen, se autofecundan,
y producen nuevas semillas, a partir de las cuales se pueden buscar los
genotipos/fenotipos de interés.

3. TIPOS DE MANIPULACIONES
Aditivas: el gen introducido codifica una nueva función.
Sustractivas: el ADN introducido bloquea a un gen de la planta.
antisentido
interruptor a distancia (transwitch)

Durante los primeros años, la IG de plantas era aditiva: añadía uno o dos
genes concretos. Pero tiene la limitación de que existen pocos genes
individuales que logren mejoras por sí solos (resistencia a virus, a larvas
de insectos, a ciertos herbicidas...)

Desde mediados de los 80 se comenzó la estrategia sustractiva: el ADN


que se introduce inhibe o bloquea de alguna manera la expresión de un
gen de la planta (p. ej. anular algún gen de algún rasgo no deseado).

Tecnología antisentido

Ejemplo: Inhibición gen de la poligalacturonasa en tomate: retrasa la


maduración.

Insertamos un gen en orientación opuesta a la normal, lo que determina un


ARN (antisentido) que se empareja con el ARN del gen homólogo normal de la
planta. Ello parece que dificulta la traducción de este ARNm por los ribosomas,
y favorece su degradación. De esta manera se puede anular o inhibir el
fenotipo dependiente del gen que se quiere controlar.

Tecnología del interruptor a distancia (transwitch)

Ejemplo: supresión del gen CHS en petunia, lo que produce flores


blancas o variegadas.

Introducir trozos del gen a bloquear, pero en su orientación normal, lo cual


interfiere con el procesamiento del ARN del gen homólogo completo de la
planta.
Estas técnicas de silenciamiento génico permiten obtener gamas desde
casi total anulación de la expresión hasta valores intermedios,
dependiendo de la posición del transgén.

Veamos ejemplo de estas manipulaciones sustractivas para retrasar la


maduración excesiva de los frutos.

1. Inhibiendo la poligalacturonasa (PG)

Estrategia de Calgene para su Tomate FlavrSavr ™, que ya se


vende en los EEUU.

Gen antisentido bloquea al gen endógeno de PG. En ausencia de


PG no hay degradación de las cadenas de poligalacturónico de la
piel del tomate, por lo que sigue conservando su aspecto fresco
varias semanas después de cosecharlo. Los demás aspectos de la
maduración (los positivos) no se modifican. Se puede dejar el
tomate en la mata más tiempo sin miedo a que se estropee luego,
y ello permite que pasen más sustancias que confieren sabor y
hacen el fruto más apetecible.

La empresa Zeneca ha hecho algo parecido, pero con técnica


transwitch.

2. Controlando la ruta biosintética del etileno

El etileno es una hormona vegetal gaseosa que controla muchos


procesos (germinación, senescencia y caída de hojas y flores,
respuesta al estrés, etc.). En cierto tipo de frutos (climatéricos)
controla, además su maduración: al inicio de ésta el aumento de
etileno induce cambios en color, textura, aroma y sabor, que
hacen que el fruto sea apetecible.

El problema: frutos que se estropean y hay que tirarlos porque no aguantan lo


suficiente hasta llegar al consumidor (En el tercer mundo esto supone 50%
pérdidas) Esto actualmente se resuelve cortándolos de la mata cuando aún
están verdes. Pero con ello se pierde sabor y otras cualidades valiosas.
En tomate se ha logrado retrasar la maduración regulando dos procesos
distintos:
Control por bloqueo del gen de la ACC sintasa o de la ACC oxidasa). Cuando se
inhibe el 95% de la ACC oxidasa, el fruto madura sólo sus cualidades positivas,
pero se evita el reblandecimiento y estropeado. El fruto se recoge y se
mantiene más tiempo. Si queremos darle su aspecto normal, antes de venderlo
lo gaseamos con etileno.
Esto mismo se ha logrado este año con el melón de raza Canteloupe (piel
amarilla): el melón lo podemos dejar en la mata sin absición, madurando más
lentamente, con lo que mejora su sabor. Se puede recoger con la corteza
verde, pero si queremos venderlo con su aspecto amarillo, lo gaseamos con
etileno. Aguanta más tiempo una vez recolectado: lo podemos guardar en buen
estado más tiempo, y permite transportarlo a mayores distancias.

Tolerancia a herbicidas:
a glifosato

a fosfinotricina

a bromoxinilo

Resistencia a plagas
Frente a larvas de insectos (coleópteros, lepidópteros, dípteros...):con gen Bt:, que
codifica insecticida natural de especies de Bacillus.
Frente a hongos (e insectos), usando genes vegetales que codifican enzimas
hidrolíticas como quitinasa, glucanasa, etc.
Los genes de inhibidores de proteasas o de alfa-amilasas son muy interesantes, porque
afectan al comportamiento alimentario y reproductivo de muchos insectos. Cuando se
colocan bajo el control de promotores específicos de semillas permiten protegerlas
durante su almacenamiento. No suponen una excesiva presión selectiva, por lo que es
menos probable la selección de mutaciones de insectos resistentes.
Cualidades del producto
Evitar que se estropee por procesos fisiológicos

Los ya citados ejemplos de control de la maduración

En patatas, evitar la aparición de manchas negras cuando se golpean. Hasta ahora se


recurre a añadir sulfitos, pero los consumidores cada vez piden menos aditivos. Por
I.G. se ha logrado, con estrategias antisentido, bloquear el gen de la PPO, con lo
que disminuye la producción de las melaninas que confieren el color oscuro tras los
golpes.
Modificaciones útiles para la industria de elaboración
Aumento del contenido en sólidos del tomate: disminuye los costes de fabricación de
salsas y baja el precio de transporte.
Recientemente se ha abierto la posibilidad de manipular los genes de las gluteninas,
lo que permitirá lograr masas especiales en la elaboración del pan y derivados.
Mejora de las propiedades nutritivas
Muchos granos y semillas usados en alimentación humana y animal son deficientes en
alguno(s) de los 10 aminoácidos esenciales. El grano de maíz tiene bajo contenido en
lisina, por lo que hay que suplementar la dieta del ganado con alguna leguminosa o
con lisina cristalina de fermentación microbiana.
Ya existen experimentos en los que se manipula una ruta metabólica para evitar la
retroinhibición de la lisina sobre las enzimas clave, con lo que aumenta el contenido
en este aminoácido en el grano.
En Australia se ha logrado un trébol transgénico que posee alto contenido en aa
azufrados, lo que hace que las ovejas que se alimentan de él den más y mejor lana.

El gluten es un complejo de proteínas (gluteninas) de reserva para suministras


aminoácidos en la germinación del grano. Cuando se muelen los granos de trigo
y luego se añade agua, se forma la masa, cuyas propiedades dependen del gluten:
red proteica continua con notables propiedades: elasticidad combinada con
extensibilidad. Luego se añade la levadura, que genera CO2, quedando las
burbujas atrapadas en la masa, y luego inmovilizadas con el horneado (estructura
porosa).

Plantas resistentes a hongos y bacterias


Resistencia a sequías, a frío, etc.
Genes bajo el control de promotores inducibles por sustancias químicas: lograr que el
rasgo se manifieste cuando queramos.
Manipulación de los genes de pigmentos, del desarrollo de la flor o de las hojas:
obtención de nuevas variedades de flores y plantas ornamentales.
Mejoras de rendimientos manipulando la respuesta a la luz:
Cuando las plantas crecen muy juntas, el reflejo de la luz actúa sobre uno de los
fitocromos, provocando un mayor crecimiento del tallo a expensas de partes más
provechosas para el agricultor, como las hojas, frutos, etc. En agosto de 1996 se ha
logrado, por sobreexpresión del gen phyA, suprimir esta respuesta en el tabaco: se
acumula más biomasa en las hojas. Esto en un futuro puede hacer menos necesario el
empleo de fertilizantes químicos.
Manipulación genética de los microorganismos de la rizosfera y de
las plantas, para favorecer la nutrición mineral, sus mecanismos
de defensa frente a hongos y nematodos, y quizá lograr nuevas
especies fijadoras de nitrógeno.

No sólo podemos hacer I.G. para fines agrícolas, sino que también
podemos transferir genes que hagan que las plantas fabriquen
sustancias valiosas en la industria farmacéutica o química: plantas
transgénicas convertidas en fábricas vivas (biorreactores) de sustancias
de alto valor añadido.

El atractivo de esto es enorme, ya que podemos disponer de campos de


tabaco, girasol, tomate, colza, etc., produciendo enormes cantidades
de sustancias difíciles o caras de obtener por otros medios. Además, a
diferencia de las fermentaciones industriales, aquí no hacen falta
grandes inversiones ni trabajadores especializados. Ya hay ensayos a
pequeña escala de plantas productoras de medicamentos:

encefalina

seroalbúmina humana

interferón humano

vacunas comestibles (p. ej., tomate-vacuna antirrábica para animales)

Sin embargo, quizá lo más espectacular ha sido comprobar que las


plantas pueden fabricar anticuerpos monoclonales funcionales. Incluso
son capaces de ensamblar correctamente la IgA dimérica, con su cadena
J y su componente secretor. Esto es muy interesante, ya que no es fácil
de obtener. Por otros métodos. Se han hecho pruebas con éxito que
demuestra que confieren protección mucosal pasiva en boca (contra
caries), tracto intestinal, etc.

Posibilidad de protegernos comiendo fruta fresca transgénica (!)

Primeros ensayos de producción en plantas (colza, soja) de plásticos


totalmente biodegradables (PHA, polihidroxialcanoatos a partir de genes
bacterianos)