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APPENDICE

Organismi modello
Batterio, Escherichia coli

Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae

Muffa del pane, Neurospora crassa

Nematode, Caenorhabditis elegans

Arabetta comune, Arabidopsis thaliana

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster

Topo domestico, Mus musculus

Gli uomini si distinguono dagli altri organismi per le più sul cancro e sono disponibili più terapie. La mag-
loro capacità cognitive e per lo stupore nei confronti di gior parte di queste scoperte e progressi deriva dallo
ciò che li circonda, ed è questa curiosità che ci porta a studio degli organismi modello.
studiare la vita. Come siamo fatti? Come funzioniamo?
Per comprendere gli uomini e le altre creature viventi, i  Pochi organismi costituiscono dei modelli
ricercatori hanno studiato una grande varietà di organi- per la comprensione dei processi vitali comuni
smi viventi. Questi studi hanno portato a molte scoper-
te, comprese alcune incredibili caratteristiche univer- Gli scienziati studiano vari organismi. Quando una
sali condivise da tutti gli esseri viventi. Tutti gli organi- specie particolare viene scelta da molti laboratori per
smi usano gli stessi amminoacidi, gli stessi nucleotidi e ricerche intense viene definita organismo modello.
praticamente lo stesso codice genetico. Questo interesse per una specie da parte di molti la-
Nella biologia molecolare c’è qualcosa di più del boratori permette di ottenere una grande quantità di
desiderio di soddisfare la nostra curiosità sul funzio- informazioni che ci forniscono conoscenze approfon-
namento della vita. Cerchiamo anche di comprende- dite sulle funzioni di quell’organismo vivente. L’orga-
re le cause delle malattie e di applicare le nostre co- nismo è considerato un modello perché i ricercatori
noscenze alla medicina, all’agricoltura e alla tecnolo- ipotizzano che quello che hanno appreso su di esso
gia. In questo libro diverse volte abbiamo riportato sarà vero anche per organismi affini. Lo specifico or-
parecchi esempi di come abbiamo acquisito informa- ganismo selezionato per uno studio dipende dal pro-
zioni sulle malattie umane, le loro cause e talvolta su blema in esame. In questo libro, abbiamo visto il con-
come affrontarle, curarle o prevenirle. Gli scienziati tributo degli organismi modello alla nostra conoscen-
hanno scoperto gli antibiotici per curare la maggior za di biologia molecolare e molti degli organismi uti-
parte delle infezioni batteriche, sviluppato vaccini lizzati più frequentemente vengono passati in rasse-
per molti tipi d’infezioni virali e oggi sanno molto di gna in questa Appendice.

M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore
2 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9

Dobbiamo osservare, però, che a volte, un orga- anche gli organismi unicellulari sono idonei per stu-
nismo che si trova “fuori dal cammino tracciato” vie- di fondamentali sui geni e sul metabolismo cellula-
ne studiato solamente da pochi laboratori, semplice- re. Negli anni Quaranta, microrganismi come Esche-
mente per curiosità e anche questi studi possono ave- richia coli, il lievito e Neurospora crassa sono diventati
re un grande impatto sulla ricerca. Per esempio, Ther- i modelli più utili per la comprensione della chimica
mus aquaticus ci ha fornito la Taq polimerasi per la di base della vita. Forniscono anche un materiale di
reazione a catena della polimerasi (PCR; vedi Capito- partenza migliore per i biochimici rispetto ai tessuti
lo 7 Come è stato scoperto). Lo studio di Tetrahymena animali, perché gli organismi unicellulari sono una
thermophila ha portato a scoprire gli RNA cataliz- popolazione di cellule identiche, mentre i tessuti so-
zatori (come i ribozimi; vedi Capitolo 16). E gli stu- no costituiti da tipi cellulari diversi.
di di alcuni virus poco noti degli insetti, i baculovi- Nessun organismo modello può fornire le risposte
rus, hanno dato origine a sistemi di espressione del- a tutte le domande sulla vita. Gli organismi unicellu-
le proteine ricombinanti oggi ampiamente utilizzati lari continuano a dirci molto sugli aspetti centrali dei
(vedi Capitolo 7). processi fondamentali della vita, come la replicazio-
Focalizzare l’attenzione su pochi organismi diversi ne cromosomica, la riparazione del DNA, la ricombi-
è importante a livello pratico perché ci sono molte più nazione, l’espressione genica, le vie di trasduzione del
specie che scienziati. In effetti, fare di un organismo segnale e il controllo del ciclo cellulare. Ma gli organi-
uno strumento scientifico per la ricerca non è sempli- smi unicellulari non sono sufficienti per rispondere a
ce. Sono necessari molti anni di studio per compren- domande sullo sviluppo degli organismi pluricellulari
dere l’organismo e acquistare familiarità con il suo ci- e sulla maggior parte delle malattie. Per questo vengo-
clo vitale, la sua corretta alimentazione, la sua crescita no molto utilizzati il verme nematode e il moscerino
ottimale e le condizioni di conservazione. Particolar- della frutta, per scoprire come sono organizzati gli or-
mente dispendioso in termini di tempo è lo sviluppo ganismi pluricellulari e per i fondamenti di base di co-
di tecniche genetiche per la manipolazione del geno- me è determinato il piano di sviluppo corporeo anima-
ma dell’organismo. Non ci sono “procedure standard” le. Questi organismi ci forniscono anche informazioni
per questo; le tecniche genetiche sono per lo più spe- su molti tipi di malattie. Allo stesso modo, Arabidopsis
cifiche per quell’organismo e spesso vengono trovate thaliana è stata scelta come organismo modello per lo
per tentativi ed errori. Questa è la ragione per cui è im- sviluppo delle piante.
portante che molti laboratori lavorino sullo stesso or- Fra tutti, il modello più utile per lo studio delle ma-
ganismo e condividano le loro conoscenze. Una massa lattie umane è il topo. Questo non è però il più sempli-
critica d’interesse per un organismo modello porta al- ce tra gli organismi modello. Per facilità di allevamento
la fine a congressi internazionali, banche dati online, e e manipolazione del DNA, il topo crea molte più diffi-
alla formazione di centri di stoccaggio che mantengo- coltà degli altri organismi modello. Ottenere ceppi di
no e distribuiscono i ceppi. topo geneticamente alterati è costoso e lungo. Ma uno
Perché fra tutti gli organismi esistenti al mondo ne dei grandi vantaggi del topo è che il 99% dei suoi geni
sono stati scelti proprio alcuni? Le scelte sono spesso ha degli omologhi nell’uomo, e tra questi ci sono anche
state fatte con una buona dose di casualità. Tuttavia, geni associati a malattie umane. Quindi, nonostante le
alcune caratteristiche comuni sottolineano l’utilità di difficoltà, il topo è un modello interessante per studia-
un organismo come modello. Gli organismi modello re le malattie che ci colpiscono.
devono avere un ciclo di vita rapido. Devono dar vita a In questa Appendice presentiamo una breve pa-
un’ampia progenie, così che i ricercatori possano trova- noramica dei diversi organismi modello oggi in uso,
re e studiare eventi genetici rari. Anche la dimensione spiegando anche come hanno contribuito e continua-
è importante, perché gli organismi grandi e la loro am- no a contribuire alla nostra comprensione della vita.
pia progenie esaurirebbero velocemente lo spazio di un Come abbiamo notato, anche molti altri organismi
laboratorio. Gli organismi modello dovrebbero poter- hanno contribuito significativamente alla nostra com-
si propagare velocemente usando una fonte alimenta- prensione dei processi viventi, tra cui i batteriofagi e
re semplice ed economica. Ci dovrebbe essere un mo- altri virus, Tetrahymena thermophila (un protozoo),
do conveniente per una conservazione a lungo termi- Schizosaccharomyces pombe (un lievito che si divide
ne in modo da poter accumulare i ceppi per studi suc- per scissione), Xenopus laevis (un rospo), e Brachyda-
cessivi. La Tabella A.1 riassume alcune caratteristiche nio rerio (pesce zebra). Prima di entrare nei dettagli
degli organismi modello qui descritti. di particolari organismi modello, descriviamo breve-
Gli studi di genetica e delle vie metaboliche dei mente alcuni episodi di come, studiando gli organi-
primi anni del Novecento utilizzarono organismi plu- smi modello e utilizzando la genomica e le tecniche
ricellulari complessi come le piante, i moscerini della di coltura cellulare, abbiamo ampliato le nostre co-
frutta, i ratti e i topi. Poi i ricercatori si accorsero che noscenze sulle malattie umane.

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TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni
E. coli S. cerevisiae N. crassa C. elegans A. thaliana D. melanogaster M. musculus
Caratteristiche di base
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Tipo di organismo Batterio unicellulare Eucariote, fungo Eucariote, fungo Eucariote, verme Eucariote, pianta Eucariote, insetto Eucariote,
ascomicete ascomicete nematode angiosperma mammifero
unicellulare filamentoso
multinucleato
Habitat naturale Intestino Superficie delle Vegetazione morta Suolo Clima temperato Frutta marcia Abitazioni, campi
dell’animale piante globale
Dimensione 1-2 μm 4-6 μm Irregolare 1 mm 10-20 cm 2,5 mm 17 cm
Riproduzione Fissione asessuata; Asessuata, Asessuata, Sessuata, auto- e Sessuata, auto- e Sessuata, Sessuata,
a volte gemmazione formazione cross-fecondazione; cross-fecondazione accoppiamento accoppiamento
coniugazione (mitosi); sessuata, di filamenti; alcuni asessuati
sporulazione asessuata,
(meiosi) sporulazione
Tempo 20 minuti 70-90 minuti 3-4 settimane 50 ore 6 settimane 12 giorni 9 settimane
di generazione (per riproduzione
sessuata)
Condizioni Capsule Petri Capsule Petri Capsule Petri, Capsule Petri Capsule Petri Bottiglie o provette Gabbie
di crescita o colture liquide o colture liquide provette graduate o colture liquide o piccoli vassoi
o coltura liquida orticoli
Fonte alimentare Estratto di lievito Estratto di lievito, Mezzi completi o Batteri Luce, acqua, Lievito e melassa, Sostanze vegetali

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e brodo di triptoni; peptone; definiti (zuccheri, (E. coli) fonte di azoto frutta
si possono usare si possono usare sali inorganici, e altri minerali
terreni definiti terreni definiti biotina e azoto) (per esempio
fertilizzanti)
Conservazione Stock congelati Stock congelati Spore Congelati a –80 °C Semi Propagazione vitale Embrioni congelati
in glicerolo; in glicerolo; congelate-anidre
cellule liofilizzate cellule liofilizzate
(segue)
APPENDICE Organismi modello 3
TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni (continua)
E. coli S. cerevisiae N. crassa C. elegans A. thaliana D. melanogaster M. musculus
Statistica genetica
Dimensione 4 639 675 bp 12 070 898 bp 42 900 000 bp 100 269 917 bp 119 186 997 bp 166 600 000 bp 2 729 273 687 bp
del genoma
Numero 1 (aploide) 16 (aploide); 32 7 (aploide); 14 11 (diploide, 10 (diploide) 8 (diploide) 40 (diploide)
di cromosomi (diploide) (diploide) maschio), 12
(diploide,
ermafrodita)
4 APPENDICE Organismi modello

Numero di geni 4410 6000 11 000 21 035 25 540 14 065 29 083


Geni simili all’uomo 8% 30% 6% 25% 18% 50% 99%
Nomenclatura dnaA GCN4 arg fem-3 AAO ry Cdc20
genica
convenzionale
Nomenclatura DnaA Gcn4 arg FEM-3 AAO RY Cdc20
proteica
convenzionale
Sito web www.ecocyc.org www.yeastgenome.  ww.broadinstitute. www.wormbook.org
w www.arabidopsis.org www.flybase.org www.jax.org
del genoma org org/annotation/
genome/
neurospora/

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 Per studiare le malattie umane si usano sempre più velocemente. La conoscenza della genetica
tre metodi coinvolta nella trasmissione di una malattia può aiutare
le coppie a pianificare le loro famiglie e ad affrontare le
Che cosa determina un infarto, il diabete, le malattie possibili malattie che possono essere trasmesse ai figli
neurodegenerative o il cancro? Come possono queste o alle figlie. Per i ricercatori, la conoscenza di un gene
o altre malattie essere prevenute, trattate o curate? Lo responsabile di una malattia può aiutare a sviluppare
studio degli organismi modello è in genere il primo pas- un trattamento o una cura.
so per comprendere i processi cellulari che possono es- Un terzo modo con cui studiamo noi stessi è me-
sere modificati nelle malattie umane. Usando un omo- diante la coltivazione di specifiche cellule umane in
logo, possiamo studiare una mutazione che porta a una vitro. Le cellule primarie, prese direttamente dal cor-
malattia umana in un organismo modello e capire co- po e poi cresciute in coltura, muoiono di norma in 40
me la mutazione alteri processi molecolari, cellulari o (o meno) generazioni. Ma le cellule ottenute dal tes-
dell’organismo. Inoltre, i modelli murini sono spesso suto tumorale hanno un controllo della crescita al-
usati per valutare approcci terapeutici per le malattie, terato e spesso possono essere fatte crescere per un
come primo passaggio nello sviluppo di un farmaco. indefinito numero di generazioni; sono dette, quin-
Gli organismi modello sono spesso il primo passo per di, “immortalizzate”. A volte le cellule possono esse-
la comprensione delle malattie umane, ma la genomica re perfino rimosse dal tessuto normale e poi immor-
umana e le colture cellulari possono fornire una com- talizzate in coltura mediante l’infezione con partico-
prensione ancora più profonda. lari virus. Con questi e altri mezzi, vengono cresciu-
La disponibilità della sequenza del genoma umano ti e mantenuti in coltura molti tipi diversi di cellule
completa è stata di enorme aiuto sia per la comprensio- di tessuti umani, tra cui gli epatociti (fegato), le cel-
ne a livello molecolare dei geni coinvolti nelle malattie lule renali (rene), i fibroblasti (pelle), le cellule gliali
umane, che per gli studi bioinformatici sull’evoluzione (tessuto nervoso), i linfociti (sangue) e i miociti (mu-
umana e sulle migrazioni (vedi Capitolo 8). Importanti scoli). Analizzando le cellule cancerose e gli agenti
sono stati i progressi nella comprensione della genetica di trasformazione, abbiamo anche imparato molto
delle malattie umane. In particolare, le persone cerca- sui geni coinvolti nel cancro (vedi Approfondimento
no attivamente opinioni mediche e scientifiche su una 12.1). Gli studi di colture cellulari di cellule umane
malattia e spesso possono costruire un albero genealo- e di altri primati hanno fornito importanti informa-
gico familiare andando indietro per generazioni, che zioni sui recettori di superficie, sul traffico proteico,
può fornire informazioni sulla modalità di trasmissio- sull’infezione virale e sulla riproduzione cellulare. Le
ne della malattia. In questo testo vi sono esempi di tut- cellule umane possono anche essere fatte crescere in
to ciò, come l’emofilia nella famiglia reale (vedi Figura quantità idonee agli studi biochimici (vedi Capitolo
2.27), l’anemia falciforme (vedi Approfondimento 2.1) 7). Gli studi recenti nel campo della ricerca sulle cel-
e l’Alzheimer a esordio rapido (vedi Figura 8.11). L’i- lule staminali sono promettenti per il trattamento di
dentificazione dei geni coinvolti nelle malattie umane è molte malattie e per lo sviluppo di tessuti sostitutivi
un compito difficile ma importante e si sta realizzando (vedi Capitolo 22).

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Batterio, Escherichia coli

Escherichia coli è un batterio del fago T2 (vedi Capitolo 2, Come è stato scoperto). Nel
unicellulare, che risiede nor- 1958, Matthew Meselson e Frank Stahl selezionarono E.
malmente nell’intestino ani- coli per i loro studi, per dimostrare che la replicazione
male e in genere non è danno- del DNA avviene con un meccanismo semiconservativo
so, anche se esistono rare va- (vedi Figura 11.1). Nello stesso anno, Arthur Kornberg e
rietà tossiche. E coli è piccolo i suoi collaboratori pubblicarono i risultati sulla purifi-
Janice Haney Carr/CDC
(microscopico), si riproduce cazione e la caratterizzazione della prima DNA polime-
velocemente per scissione, for- rasi scoperta (vedi Capitolo 11, Come è stato scoperto).
mando colonie di cloni sulle piastre di agar, producendo Francis Crick e Sydney Brenner usarono la genetica
decine di milioni di cellule in un giorno e può crescere di E. coli per stabilire la tripla natura del codice genetico
anche sui mezzi liquidi, producendo un numero incre- nel 1961. Nel 1966 il codice genetico era stato descritto da
dibile di cellule figlie, una caratteristica importante per Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei, Gobind Khorana
studi di eventi genetici rari. E. coli ha un solo cromoso- e i loro collaboratori, usando oligonucleotidi sintetici ed
ma circolare, e studiare i mutanti è molto più facile in un estratti di E. coli (vedi Capitolo 17). Il lavoro di François
organismo aploide che diploide, perché non ci sono ge- Jacob e Jacques Monod con gli studi dettagliati dell’ope-
ni dominanti a mascherare la mutazione. Fenotipi mu- rone lac aveva aperto un’era completamente nuova della
tanti comuni sono la resistenza ai batteriofagi, la capa- ricerca sulla regolazione genica (vedi Capitolo 20 e Capi-
cità di crescere su alcune fonti di carbonio, la resisten- tolo 5, Come è stato scoperto). L’identificazione di plasmi-
za agli antibiotici e la dimensione e forma della colonia. di in E. coli e delle tecniche per maneggiarli ci ha portato
E. coli fornisce anche una ricca e uniforme fonte di ma- nell’era della tecnologia del DNA ricombinante. I plasmi-
teriale di partenza per studi biochimici. Quindi, lo stu- di continuano a essere degli strumenti meravigliosi per le
dio di E. coli combina la forza della genetica con il pote- biotecnologie, dal valore ancora incommensurabile (ve-
re della biochimica per comprendere i processi vitali a di Capitolo 7).
livello molecolare.
E. coli non è un eucariote e quindi ha poca omologia  Ciclo vitale
con gli uomini. Questo limita la sua utilità nello studio di
tutti i processi tranne di quelli cellulari di base. Per esem- Come la maggior parte dei batteri, E. coli si riproduce
pio, E. coli è privo di nucleosomi e nella maggior parte le per scissione binaria (Figura A.1). Man mano che la cel-
sue proteine non sono modificate. Le proteine eucarioti- lula cresce, percepisce quando ha raggiunto la dimen-
che espresse in E. coli trasformato a volte non funzionano, sione giusta per iniziare la replicazione. I cromosomi
perché richiedono modificazioni post-traduzionali che il duplicati si distribuiscono ai poli opposti della cellula.
batterio non riesce a compiere. La citochinesi divide la cellula a metà, formando due
cellule figlie, ciascuna delle quali contiene un cromo-
 I primi studi con E. coli come organismo soma identico. L’intero processo richiede solamente 20
modello minuti circa a 37 °C, la temperatura corporea media dei
mammiferi. Quindi in appena 24 ore su una piastra Pe-
L’unione della biochimica e della genetica rese E. coli tri contenente un mezzo completo si forma una colonia
una ricca risorsa per la scoperta di nuove informazio- grande e visibile, con milioni di batteri identici. Grosse
ni. Il famoso “test di fluttuazione” di Salvador Luria e quantità di E. coli possono essere cresciute anche in una
Max Delbruck nel 1943 dimostrò che E. coli muta spon- coltura liquida in un giorno.
taneamente per diventare resistente al batteriovirus a e
trasmette questa resistenza al fago alla nuova progenie,  Tecniche genetiche
rendendo quindi E. coli un sistema modello per com-
prendere la natura e la funzione dei geni. La scoper- Per una descrizione completa di molte di queste tecniche
ta da parte di Joshua Lederberg e Edward Tatum che vedi Capitolo 7.
E. coli va incontro a una sorta di incrocio e crossing over
(coniugazione del DNA mediata dal plasmide F) rende Mutagenesi La frequenza di mutazione in E. coli può es-
possibile lo scambio del DNA e i saggi di complemen- sere aumentata con sostanze chimiche o con la luce UV.
tazione e rende E. coli un valido modello per la geneti- Le cellule mutanti possono essere selezionate in base al
ca. Nel 1952, Alfred Hershey e Martha Chase usarono fenotipo oppure ricercate mediante piastratura delle re-
E. coli per dimostrare che il DNA è il materiale genetico pliche su mezzi di coltura diversi.

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© 978-88-08-19531-9 APPENDICE Organismi modello 7

E. coli ni positivi (cellule che sopravvivono in condizioni in cui il


mutante non sopravvive) possono poi essere sequenziati
DNA per identificare il gene di complementazione.
Il ciclo Replicazione
si ripete del DNA Espressione di una proteina ricombinante La crescita ve-
loce e non costosa di E. coli fa di questo organismo il vei-
colo più ampiamente usato per l’espressione e la purifica-
zione di proteine estranee. Queste in genere sono espresse
da geni posti su plasmidi presenti in un elevato numero
Formazione
delle cellule
di copie. L’espressione è indotta usando elementi di rego-
figlie lazione derivanti da promotori ben noti di E. coli e di fagi.

 E. coli come organismo modello ai nostri giorni

Citochinesi Separazione Macchine multiproteiche Gli studi biochimici e struttura-


dei filamenti di DNA li stanno oggi descrivendo i dettagli atomici di strutture e
processi di trasferimento dell’informazione che un tempo
FIGURA A.1 Il ciclo vitale di Escherichia coli. erano sconosciuti. Tra questi ci sono la struttura e la fun-
zione dell’apparato di replicazione del DNA, delle protei-
ne di riparazione e ricombinazione del DNA, della rego-
Plasmidi E. coli possiede molti plasmidi naturali che pos- lazione dell’RNA polimerasi e della struttura e della chi-
sono portare del DNA estraneo nella cellula. Questi pla- mica del ribosoma. Queste strutture e processi multipro-
smidi sono utili ai ricercatori per far esprimere delle pro- teici si trovano sia nei batteri che negli eucarioti, ma sono
teine, come vettori navetta, o per costruire e sequenzia- esemplificati nella semplice cellula di E. coli.
re grossi genomi.
Studi citologici I processi possono essere visualizzati nel-
Introduzione di DNA Mediante trasformazione chimica le cellule viventi di E. coli grazie all’uso di proteine di fu-
o con l’elettroporazione, E. coli può essere reso in grado sione fluorescenti. Per esempio, studi recenti di questo ti-
di accettare del DNA estraneo. Le cellule trasformate con po hanno permesso di rilevare le proteine coinvolte nella
un plasmide contenente un gene per la resistenza all’an- replicazione del cromosoma e il loro movimento lungo il
tibiotico possono essere selezionate e mantenute aggiun- cromosoma durante la replicazione.
gendo l’antibiotico al mezzo di coltura.
Tecnologia del DNA ricombinante E. coli detiene una po-
Knockout genico I plasmidi privi di un’origine di replica- sizione centrale nella tecnologia del DNA ricombinante.
zione ma contenenti un gene che conferisce resistenza a I suoi plasmidi sono ampiamente usati come vettori na-
un antibiotico possono essere selezionati per essere inte- vetta per amplificare e mantenere le librerie di DNA di al-
grati in un cromosoma batterico. L’integrazione di norma tri organismi. E. coli è ancora uno dei veicoli più utilizzati
viene ottenuta con la ricombinazione omologa, utile per per l’espressione e la purificazione di proteine estranee.
la delezione genica, o knockout.
Biologia dei sistemi Il suo genoma piuttosto piccolo fa
Complementazione Questa tecnica viene spesso utilizza- di E. coli un sistema interessante in cui tentare studi di
ta per dimostrare che una mutazione si trova in un gene biologia dei sistemi. Sono stati costruiti chip di DNA per
particolare e consiste nell’aggiunta di un gene wild-type esaminare la risposta di ogni trascritto in molte condizio-
che ristabilisca la funzione. L’analisi di complementazio- ni diverse. La funzione di circa il 35% dei geni di E. coli è
ne delle cellule mutanti può essere effettuata con plasmi- ancora sconosciuta e una raccolta genomica di knockout
di che contengono una copia wild-type del gene d’interes- dei geni di questo batterio sta permettendo di assegnare
se. L’analisi di complementazione di mutazioni sconosciu- una funzione a questi geni e di identificare nuove reti di
te spesso utilizza una libreria di plasmidi genomici. I clo- interazioni geniche.

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Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae è un fun- zucchero ad alcool e CO2, e stabilì che la fermentazione


go ascomicete microbico, usato è una forza vitale che non può essere separata dagli or-
per secoli dagli uomini per fare il ganismi viventi. Nel 1897, Eduard Buchner notò casual-
pane, la birra e il vino. General- mente che un estratto di cellule di lievito fermentava e
mente gli scienziati lo chiamano chiamò la sostanza fermentante “zimasi”. Studi succes-
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lievito gemmante, ma è detto an- sivi dimostrarono che la zimasi era di fatto una misce-
che lievito del pane, lievito di bir- la di molti enzimi differenti. Il suffisso –asi è usato per
ra o semplicemente lievito. Il lievito ha molte caratteristi- molti nomi di enzimi anche oggi.
che che lo rendono adatto come organismo modello. È un
organismo unicellulare aploide, si riproduce velocemen-  Ciclo vitale
te nei terreni liquidi, forma colonie clonali sulle piastre di
agar e può essere conservato congelato. Come per E. coli, Il lievito gemmante può esistere sia allo stato aploide che
queste caratteristiche fanno del lievito un eccellente or- diploide (Figura A.2). Entrambe le cellule aploidi e diploi-
ganismo modello per studiare la genetica e la biochimica di si possono riprodurre asessualmente per gemmazione.
di processi vitali fondamentali, come la replicazione, la Il sesso in S. cerevisiae è determinato dai prodotti del ge-
trascrizione e la traduzione. Però, a differenza di E. coli, il ne del locus del tipo sessuale (MAT), per il quale esistono
lievito è un eucariote dotato di tutti gli organelli intracel- due alleli, a e a (vedi Figura 13.22). Aploidi di tipi sessua-
lulari, come i mitocondri e il nucleo, ha il DNA compatta- li diversi possono essere incrociati per formare dei diploi-
to nella cromatina e una struttura citoscheletrica. Quin- di piastrandoli insieme. Il lievito diploide a/a può essere
di S. cerevisiae è un modello adatto per studiare meccani- convertito allo stato aploide in terreni che lo inducono a
smi unici degli eucarioti, come il controllo del ciclo cellu- sporulare, andando incontro a meiosi per produrre quat-
lare, la regolazione delle proteine mediante fosforilazio- tro spore aploidi contenute in un asco. La tetrade di spore
ne, la struttura cromosomica e la funzione mitocondriale. può essere dissezionata con un micromanipolatore e cia-
Il genoma di S. cerevisiae è lungo solamente 12 Mbp scun fenotipo aploide può essere analizzato dopo che le
e contiene circa 6000 geni. Contiene anche omologhi di spore sono cresciute formando delle colonie.
molti geni umani responsabili di malattie e questo lo ren-
de un modello per la comprensione delle funzioni di ba-  Tecniche genetiche
se dei prodotti genici coinvolti in alcune malattie; inol-
tre questi omologhi indicano come alcune malattie uma- Mutagenesi Gli studi mutazionali in S. cerevisiae sono
ne derivino dalla distruzione di processi vitali piuttosto semplificati dalla sua capacità di crescere come aploi-
semplici e fondamentali. Però, il lievito unicellulare non de. Il lievito può essere replicato su piastra per studiare
serve come modello di sviluppo e le molte malattie uma- i fenotipi mutanti per la capacità di crescere su fonti di
ne che derivano da mutazioni che provocano difetti dello carbonio differenti e per cercare la presenza di geni le-
sviluppo non possono essere studiate nel lievito, limitan- tali condizionali (per esempio geni che, se mutati, per-
done l’utilità nella ricerca medica. mettono all’organismo di crescere solamente a partico-
La natura aploide del lievito rende possibili alcuni utili lari temperature).
studi di mutazione. Il lievito viene anche facilmente tra-
sformato con il DNA esogeno. Il DNA si integra frequente- Complementazione Il lievito aploide può essere incrocia-
mente nel cromosoma per ricombinazione omologa, ren- to per produrre cellule diploidi per l’analisi di complemen-
dendo possibile la costruzione di ceppi knockout per un tazione dei mutanti aploidi. Le mutazioni nei geni essen-
gene specifico. La facilità della genetica, unita alla facili- ziali possono essere mantenute portandoli allo stato di-
tà di crescita, fa di S. cerevisiae, come di E. coli, un organi- ploide. Quando un diploide con una mutazione in un ge-
smo modello che combina perfettamente gli studi gene- ne essenziale va incontro a sporulazione, due delle quat-
tici con quelli biochimici. tro spore non saranno vitali. L’isolamento di tutti e quattro
i prodotti della meiosi in un asco è utile per l’analisi della
 I primi studi con il lievito come organismo ricombinazione durante la meiosi.
modello
Introduzione del DNA Il DNA può essere introdotto in S.
Il lievito è stato un organismo modello per più di cen- cerevisiae per abrasione chimica o fisica della spessa pa-
to anni e, di fatto, ha dato origine alla biochimica mo- rete cellulare. Il DNA lineare, con un marcatore selezio-
derna. Louis Pasteur dimostrò che il lievito fermenta lo nabile ed estremità omologhe al cromosoma, s’integra fa-

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Tetrade di spore del genoma (vedi Figura 7.7). Inoltre, S. cerevisiae è dota-
to di un plasmide naturale di 2 m che può essere usato per
a 
mantenere nella cellula il DNA esogeno.
a 
a   Il lievito come organismo modello ai nostri
Asco di giorni
S. cerevisiae
Sporulazione Meccanismi fondamentali di trasmissione dell’informa-
(meiosi)
zione La struttura semplice e unicellulare, la capacità di
a a  
a 
crescere in grandi quantità per studi biochimici e la faci-
Gemmazione Gemmazione lità della manipolazione genetica, tutto ciò rende il lievito
aploide aploide ideale per lo studio di meccanismi dettagliati dei proces-
(mitosi) (mitosi)
a 
si fondamentali, quali la replicazione, la regolazione ge-
a 
 nica, la riparazione del DNA, la trascrizione, la traduzio-
ne e la ricombinazione.
a/
Il ciclo di divisione cellulare Quando il lievito si divide, la
a/ Gemmazione
gemma è visibile al microscopio così come i cambiamenti
diploide a/ di forma nelle diverse fasi del ciclo cellulare. L’accumulo di
a/ (mitosi) cellule mutate, bloccate nella fase gemmante, è stato usato
come fenotipo tramite il quale identificare diversi mutan-
a/
ti del ciclo cellulare (cdc), utili per la dissezione genetica
e biochimica del ciclo cellulare. Gli uomini hanno omolo-
a  ghi di molti dei geni del ciclo cellulare scoperti nel lievito.
Incrocio
Le vie di trasduzione del segnale Il lievito è un model-
FIGURA A.2 Il ciclo vitale di Saccharomyces cerevisiae. lo per lo studio delle vie di trasduzione del segnale, come
quelle coinvolte nelle risposte di accoppiamento ai fero-
moni prodotti da cellule di tipi sessuali opposti.
cilmente nel genoma per ricombinazione omologa. Que-
sta configurazione può portare le estremità a ricombinare Ricombinazione meiotica Dato che S. cerevisiae produce
con le sequenze a loro omologhe nel cromosoma di lievi- un asco con quattro spore derivanti da una sola cellula, i
to, sostituendo il gene d’interesse con un marcatore sele- ricercatori possono seguire gli eventi che avvengono du-
zionabile e distruggendo il gene. rante la meiosi. Questo ha portato a modelli molecolari
dettagliati della ricombinazione meiotica.
Marcatori selezionabili La selezione nel lievito è effettua-
ta principalmente con gli auxotrofi, ceppi che sono privi di Biologia dei sistemi Uno degli scopi della biologia dei si-
un gene che codifica un enzima di una via della biosintesi stemi consiste nel comprendere la maggior parte delle in-
degli amminoacidi e quindi richiedono quell’amminoaci- terazioni genetiche, fisiche e molecolari dei 6000 geni di
do per crescere. Le cellule vengono fatte crescere in mez- lievito. Allo stesso modo lo studio delle interazioni geneti-
zi definiti privi di quell’amminoacido ora essenziale. Sola- che tra i knockout di questi geni sta portando alla scoperta
mente le cellule che hanno acquisito il marcatore e quindi di nuove vie. Gli approcci proteomici sono stati usati per le
sono in grado di sintetizzare l’amminoacido a partire da prime volte nel lievito. È stato determinato il numero del-
materiale grezzo sopravviveranno. Per la selezione posso- le copie intracellulari di quasi tutte le proteine di lievito
no anche essere usati marcatori di resistenza ai farmaci. su tutto il genoma. Sono state determinate anche le inte-
razioni proteina-proteina e proteina-RNA a livello globa-
Plasmidi Il DNA può anche essere mantenuto nel lievito le, usando le tecniche del doppio ibrido e del triplo ibrido
come plasmide circolare, usando una fra le tante origini (vedi Capitolo 7) e la spettrometria di massa dei comples-
cromosomiche note come ARS (autonomously replicating si proteici. Gli studi di biologia cellulare sono facilitati da
sequence, sequenza di replicazione autonoma). Gli YAC una libreria di marcatori proteici fluorescenti posti, nel
(yeast artificial chromosome, cromosomi artificiali di lievi- genoma di lievito, in ogni cornice di lettura aperta. Inol-
to) possono mantenere inserti molto grandi (da 300 kbp tre, il lievito è usato come sistema di espressione proteica
a 1 Mbp), e questo è utile nei progetti di sequenziamento per lo studio di geni esogeni.

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10 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9

Muffa del pane, Neurospora crassa

La muffa del pane, Neurospo- lipeptide”. Questo lavoro ha dato l’avvio a una nuova era
ra crassa, è un fungo ascomice- della genetica molecolare e all’uso dei microrganismi in
te filamentoso. È stato uno dei studi di genetica (vedi Figura 2.23).
primi microrganismi eucarioti-
ci utilizzato per studi genetici.  Ciclo vitale
Woodfall Wild Images/Photoshot
All’incirca il 75% di tutti i fun-
ghi è ascomiceto; la restante Il ciclo vitale asessuato di Neurospora inizia con le spore
parte è data dai basidiomiceti (funghi). Circa il 90% de- aploidi rilasciate dai microconidi e dai macroconidi (Figu-
gli ascomiceti è filamentoso (ovvero multinucleato, co- ra A.3, in alto). Quando la spora aploide germina, dall’e-
me spiegato meglio di seguito), mentre il resto è costi- stremo in crescita si allunga una proiezione tubolare che
tuito da lieviti unicellulari. Il genoma di N. crassa (spes- porta alla formazione di un micelio, contenente le ife ra-
so detto semplicemente Neurospora) è dato da circa 43 mificate. La crescita avviene mediante la replicazione e
Mbp e 11 000 geni, paragonabile al moscerino della frut- divisione dei nuclei aploidi e non è accompagnata dalla
ta per complessità genomica. formazione di setti cellulari. La crescita è veloce, fino a 10
La lotta tra funghi filamentosi e batteri ha prodotto cm in un solo giorno. Sulle piastre Petri, la rete compatta
importanti antibiotici, inclusa la penicillina. Queste mo- di filamenti produce una colonia. Di fatto questa rete di
lecole organiche complesse non si trovano da nessuna al- ife in una colonia è essenzialmente una sola grande cel-
tra parte in natura e, in accordo con ciò, più del 40% dei lula continua, con molti nuclei aploidi. La colonia aploi-
geni di Neurospora non ha una controparte simile in nes- de sporula formando i sacchi dei conidi e una colonia può
sun altro organismo studiato. La nicchia ecologica occu- produrre milioni di spore.
pata dai funghi filamentosi comprende molti tipi di ma- Due diversi alleli del gene del tipo sessuale, MATA
teriali biologici in decomposizione. Questo può spiegare e MATa, controllano il ciclo sessuale di Neurospora. Le
perché Neurospora può crescere su fonti di carbonio e azo- spore contengono l’allele MATA o MATa e il contatto
to insolite, il che probabilmente si riflette nella presenza tra le colonie dei diversi tipi sessuali porta alla fusione
di altri geni insoliti. della parete cellulare seguita dalla fusione dei nuclei
Una caratteristica unica di Neurospora è la disposi- aploidi. I nuclei diploidi ottenuti vanno velocemente
zione delle spore prodotte dalla meiosi di un solo nu- incontro a divisioni meiotiche e ogni nucleo diploide
cleo diploide nell’apposito involucro (asco). Le spore produce quattro spore aploidi in un asco (Figura A.3,
sono disposte linearmente nell’ordine in cui sono sta- in basso). Le spore aploidi vanno incontro a un’altra di-
te prodotte con le divisioni meiotiche. Con la possibili- visione mitotica, producendo otto spore disposte secon-
tà di separare le spore precisamente e di studiarle sin- do la loro origine cellulare, e s’impilano in fila all’inter-
golarmente, i ricercatori hanno un modello ideale per no di un asco lungo e sottile. Più aschi sono contenuti in
l’analisi della ricombinazione meiotica. Neurospora è in- una struttura detta peritecio. Ogni spora nel peritecio
teressante anche per lo studio di numerosi meccanismi è aploide e può formare un’altra colonia di Neurospora.
di silenziamento genico, alcuni dei quali esistono anche Ci vogliono circa 3-4 settimane per passare da spora, a
negli eucarioti pluricellulari. ifa aploide, a nuclei diploidi, e per tornare indietro alla
produzione di spore.
 I primi studi con Neurospora come organismo
modello  Tecniche genetiche

All’inizio Neurospora è stato un modello importante per il Mutagenesi Neurospora può essere mutagenizzata trat-
suo stato aploide, la sua crescita veloce, la produzione di tando le spore con radiazioni ionizzanti. Le spore irradia-
milioni di spore per colonia e la facilità di coltura su ter- te vengono fatte germinare in un terreno completo e la-
reni semplici e definiti. Negli anni Quaranta, la capacità sciate sporulare, producendo una grande quantità di spo-
di sintetizzare tutte le biomolecole essenziali a partire da re. Le spore possono essere poi analizzate per la presen-
terreni di coltura dalla composizione nota ha velocemen- za di mutazioni.
te portato Neurospora alla ribalta, come modello ideale in
cui studiare la genetica delle vie metaboliche conservate Introduzione del DNA Neurospora assume facilmente il
in tutte le cellule. Un’importante nota storica è stato l’uso DNA del plasmide esogeno grazie al meccanismo di tra-
di Neurospora da parte di George Beadle e Edward Tatum sformazione. Il DNA deve integrarsi nel genoma per poter
negli studi che hanno portato all’ipotesi “un gene-un po- essere ereditato stabilmente. L’antibiotico igromicina può

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Asessuato (aploide) Macroconidi (multinucleati) tation; mutazione puntiforme indotta dalla ripetizione).
e microconidi (uninucleati)
La RIP avviene nei nuclei aploidi delle cellule premitoti-
che; il DNA ripetuto viene cercato e distrutto mediante
l’introduzione di transizioni da GC a AT, su entram-
be le copie del gene duplicato. Questo processo porta di
Dispersione
fatto a un ceppo knockout.

Sporulazione Non appena i cromosomi di Neurospora se-


Micelio gregano durante la meiosi, le cellule figlie si dispongono
linearmente su un asse lungo. La frequenza di crossing
over può essere usata per mappare la distanza di un locus
allelico mutante dal centromero.
Germinazione
Sessuato (diploide)  Neurospora come organismo modello ai nostri
Il contatto tra colonie MATA Singolo giorni
e MATα produce cellule diploidi asco
con 8
spore Ricombinazione meiotica Come abbiamo visto, Neuro-
Meiosi 1 Meiosi 2 Mitosi aploidi spora, a partire da un solo evento meiotico, impacchetta
2n n
le proprie spore con una disposizione (nell’asco) che ri-
a
a
specchia l’ordine di segregazione cromosomica durante
a la meiosi. Questa caratteristica rende Neurospora un siste-
a ma interessante per gli studi di ricombinazione da cros-
A
A sing over durante la meiosi.
A
A Ritmi circadiani Neurospora segue un ritmo circadiano
Sviluppo dell’asco Peritecio con più aschi giornaliero nella formazione delle spore dei conidi. Que-
ste sono visibili a occhio nudo e, quindi, il fenotipo di un
FIGURA A.3 Il ciclo vitale di Neurospora crassa. [Fonte: comportamento ritmico può essere studiato nelle piastre
(Micelio) da Neurospora: Contributions of a Model Organism by Petri o in tubi graduati, lunghe provette in cui si può mi-
Roland Davis. © 2000 Oxford University Press, Inc. Fotografia surare la crescita rapida delle ife. Perché esista questo rit-
per gentile concessione di Matthew L. Springer, University
of California, San Francisco. (Germinazione) M. G. Roca et mo in Neurospora non è chiaro, ma è un modello utile per
al., Eukaryot. Cell 4: 911-919, 2005. (Asco singolo) Per gentile la comprensione delle basi molecolari del comportamen-
concessione di Namboori B. Raju, Stanford University. (Peritecio) to ritmico.
Per gentile concessione di Louise Glass.]
Meccanismi di silenziamento Neurospora è dotata di al-
meno tre meccanismi di silenziamento diversi, che pro-
babilmente si sono evoluti come difese genomiche con-
essere usato per selezionare la Neurospora con un transge- tro il DNA invasore, come i trasposoni e i virus. Il silen-
ne. A differenza del lievito, l’inserzione del DNA in Neu- ziamento meiotico è un processo tramite il quale un gene
rospora avviene raramente per ricombinazione omologa; non appaiato, rilevato durante la meiosi, viene silenziato.
l’inserzione è più spesso casuale e senza alcun bersaglio. L’inibizione detta “quelling” avviene nelle cellule aploidi
e rivela le sequenze duplicate. La RIP rivela le sequenze
Knockout genico Il modo per produrre uno specifico duplicate subito prima della meiosi, mutando da GC ad
knockout in Neurospora è insolito. Con un processo a AT entrambe le copie della sequenza duplicata. Il silen-
quanto pare specifico di questo organismo, una cellula ziamento meiotico e la RIP sembrano essere meccanismi
con un gene duplicato, quando viene incrociata va in- specifici di Neurospora, mentre il quelling sembra essere
contro a un processo detto RIP (repeat-induced point mu- correlato all’interferenza da RNA.

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12 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9

Nematode, Caenorhabditis elegans

I piccoli microrganismi unicel- mente. Oggi sappiamo che la morte cellulare program-
lulari, come E. coli e il lievito, so- mata è importante per lo sviluppo di organismi superio-
no modelli di incredibile succes- ri, tra cui l’uomo, e che difetti in questo processo posso-
so per lo studio a livello cellulare no portare allo sviluppo del cancro.
Per gentile concessione di Wormatlas
(www.wormatlas.org). della chimica fondamentale dei Uno dei primi esempi di C. elegans come modello di svi-
processi vitali, ma per studiare luppo è dato dagli studi sulla vulva. Lo sviluppo di questo
la complessità dello sviluppo e del sistema nervoso servo- organo di 22 cellule è stato studiato intensamente, perché
no modelli pluricellulari. Nel 1960, Sideny Brenner si re- le sue singole cellule sono facilmente visibili al microsco-
se conto che era il momento di porsi delle domande sul pio. Le ricerche per identificare i difetti nello sviluppo del-
sistema nervoso e su come un organismo pluricellulare si la vulva sfruttano il fatto che le uova fecondate nell’utero
formi a partire da una sola cellula. Brenner decise di usa- devono essere deposte nella vulva per poi schiudersi al di
re come modello per studiare questi argomenti un verme fuori del corpo. Se la vulva ha difetti di sviluppo, le uova
nematode, un piccolo metazoo traslucido. non possono essere depositate e si schiudono all’interno.
Caenhorabditis elegans è un membro della famiglia Il microscopio evidenzia molti vermi interni alla madre (a
Rhabditidae dei nematodi, ma, a differenza di altri mem- volte si parla di “un sacco di vermi”). Utilizzando questo
bri della famiglia, non è patogeno o parassita di altri ani- evidente fenotipo mutato, i ricercatori hanno identifica-
mali. C. elegans è una buona scelta come modello di svi- to molti geni che controllano lo sviluppo della vulva, tra
luppo animale perché cresce velocemente e, in funzione cui geni appartenenti a una via di fosforilazione conser-
della temperatura, si può sviluppare da uovo ad adulto vata che controlla la crescita cellulare. Gli omologhi di al-
sessualmente maturo in 21/2-31/2 giorni. I vermi sono facili cuni di questi geni nei mammiferi codificano soppressori
da crescere su piastre di agar con E. coli come fonte di nu- tumorali e oncogeni.
trimento, e possono perfino essere congelati per una con- La morte cellulare programmata nello sviluppo di
servazione a lungo termine. Gli ermafroditi di C. elegans si C. elegans porta alla morte di una delle due cellule della
possono autofecondare, una caratteristica che permette di progenie che derivano dalla divisione cellulare durante di-
ottenere velocemente mutanti omozigoti a partire da una versi stadi di sviluppo. Questo meccanismo è essenziale
popolazione di vermi mutagenizzati. I maschi, che si for- in diversi stadi dello sviluppo affinché la progenie cellu-
mano in piccola percentuale, possono accoppiarsi con gli lare sopravvissuta si sviluppi correttamente. In C. elegans
ermafroditi, formando dei ceppi con nuove combinazioni ci sono numerosi esempi di morte cellulare programma-
di mutanti, un aspetto essenziale di qualunque organismo ta, molti dei quali avvengono durante lo sviluppo del si-
modello genetico. Inoltre, C. elegans è trasparente, e que- stema nervoso. La morte cellulare programmata è impor-
sto permette di vedere ogni cellula durante lo sviluppo. tante anche nello sviluppo embrionale umano, come, per
Anche se l’ermafrodita contiene solamente 959 cellule so- esempio, nella rimozione di tessuto tra le dita.
matiche, il nematode è molto complesso ed è dotato di un
sistema nervoso, di muscoli, di sistemi digestivi e riprodut-  Ciclo vitale
tivi e mostra una serie di comportamenti utili per gli studi
di genetica neurologica. Ciascun verme produce centinaia In C. elegans ci sono due sessi, ermafrodita e maschio.
di discendenti, permettendo la ricerca di mutanti per tut- Gli ermafroditi sono dotati di due copie del cromosoma
ti i tipi di cambiamenti morfologici e comportamentali. X. Una piccola percentuale di cellule germinali dell’er-
mafrodita (dallo 0,05% all’1,0%) va incontro a una non-
 I primi studi con C. elegans come organismo disgiunzione dei cromosomi X durante la meiosi, forman-
modello do dei gameti detti gameti X-nulli, e quindi una progenie
(maschile) X0. Gli ermafroditi sono molti di più dei ma-
Per porre le fondamenta degli studi sullo sviluppo di un schi e quindi la maggior parte della progenie è prodot-
organismo pluricellulare, Brenner e altri hanno mappa- ta per autofecondazione, la quale in genere dà origine a
to la posizione di tutte le 959 cellule presenti nel verme 200-300 uova fecondate che vanno incontro a un ciclo vi-
ermafrodita, ricostruendo immagini tratte da fettine di tale a più stadi (Figura A.4). Dopo l’embriogenesi, che ri-
tessuto. Durante lo sviluppo, ciascuna cellula migrato- chiede circa 12 ore a 25 °C, le uova si schiudono, produ-
ria si muove verso una posizione precisa nell’animale. cendo delle larve lunghe 80 mm. La larva iniziale contiene
Ulteriori studi hanno portato i ricercatori a scoprire che 558 cellule. Lo sviluppo procede attraverso quattro stadi
circa il 12% delle cellule muore sempre durante lo svi- larvali (da L1 a L4) separati da mute. La muta finale por-
luppo e che la morte cellulare è programmata genetica- ta a vermi adulti sessualmente maturi. L’intero processo

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di inserimento casuale di un trasposone. L’integrazione del


Uovo DNA in un gene d’interesse può essere cercata median-
te PCR usando un primer interno al trasposone e un altro
25˚C primer che ibrida con il gene in esame.
L1
Adulto (12 h)
Interferenza da RNA L’interferenza da RNA, originaria-
Dauer mente scoperta nel nematode, può essere usata per silen-
ziare la funzione di un gene introducendo RNA a doppio
filamento omologo al gene in esame (vedi Capitolo 22).
L2
L4 (7 h)  C. elegans come organismo modello ai nostri
(9 h)
giorni
L3 (7 h)
Vie di trasduzione del segnale La morte cellulare pro-
FIGURA A.4 Il ciclo vitale di Caenorhabditis elegans. [Fonte: grammata e lo sviluppo della vulva utilizzano vie di tra-
(Uovo) Center for Cell Dynamics. (L1-L4 e Dauer) ristampato sduzione del segnale che sono utili modelli per le vie di
per gentile concessione di Wormatlas (www.wormatlas.org). segnalazione umane. Gli studi eseguiti sullo sviluppo di
(Adulto) Per gentile concessione di Ian Chin-Sang, PhD, Queen’s C. elegans continuano a rivelare caratteristiche importan-
University, Kingston, Ontario.]
ti di questi processi.

Malattie umane C. elegans ha molti geni omologhi a geni


richiede circa 52 ore a 25 °C. Gli adulti vivono approssi-
umani responsabili di malattie, compresi quelli che appar-
mativamente 15 giorni. In condizioni di stress, le larve L2
tengono alla via del segnale dell’insulina, così come i geni
possono entrare in una fase dormiente, la larva “dauer”
coinvolti nelle malattie cardiache, renali e neurologiche.
che può sopravvivere per diversi mesi, aspettando che le
Lo studio di questi geni dovrebbe portare a comprendere
condizioni migliorino.
le basi delle malattie umane.
 Tecniche genetiche
Invecchiamento Gli studi genetici della larva dauer hanno
portato a identificare una serie di geni che, quando ven-
Mutagenesi I vermi possono essere mutagenizzati con
gono attivati nell’adulto, aumentano significativamente
trattamenti chimici o irradiazioni. I vermi mutanti posso-
la durata della vita del verme. La presenza di omologhi di
no essere osservati direttamente al microscopio, per cerca-
questi geni in altri animali ha ovvie implicazioni nello stu-
re la presenza di alterazioni fenotipiche che determinano
dio dell’invecchiamento.
un comportamento o uno sviluppo aberrante, l’incapacità
di alcune cellule di andare incontro a morte cellulare pro-
Controllo dell’espressione genica basato sull’RNA Gli
grammata, un’aspettativa di vita modificata, l’incapacità
studi sull’interferenza da RNA (scoperti per la prima
delle larve di entrare nello stadio dauer.
volta nel nematode) hanno portato a identificare dei
miRNA coinvolti nell’espressione genica. Infatti, è noto che i
Autofecondazione e fecondazione incrociata L’autofe-
miRNA possono regolare l’espressione genica sia nelle
condazione porta da un solo ermafrodita a circa 300 di-
piante che negli animali.
scendenti e permette di ottenere velocemente, a partire
da singoli vermi mutanti, alleli mutanti recessivi. Anche
Neurosviluppo Il sistema nervoso di C. elegans rappre-
se i maschi vengono prodotti solo raramente, questi for-
senta l’organo più grosso dell’animale e comprende più
niscono un’opportunità di produrre nuovi ceppi genetici
di un terzo delle sue cellule (302 neuroni e 56 cellule glia-
incrociandoli con un ermafrodita.
li). A differenza delle connessioni neuronali dei vertebra-
ti, altamente ramificate, la connettività dei neuroni in
Introduzione di DNA Negli studi di trasformazione, del
C. elegans è piuttosto semplice, con circa 5000 sinapsi e
DNA ricombinante lineare viene iniettato direttamen-
2000 giunzioni neuromuscolari. Le anomalie comporta-
te nella gonade prima che si formino le uova. Rari even-
mentali sono facili da osservare e possono essere mappate
ti d’integrazione portano a ereditare stabilmente più
con precisione su specifiche reti neuronali. La conoscenza
transgeni. Raramente si ha un’integrazione per ricombi-
della connettività neuronale completa permette ai ricerca-
nazione omologa.
tori di studiare come viene guidata la crescita dell’assone
Knockout genico La distruzione per mezzo di un traspo- e come si formano le sinapsi. Inoltre, C. elegans ha molte
sone sopprime la funzione di un gene. Negli organismi do- classi di neuroni differenti che permettono studi genetici
tati di trasposoni attivi, le mutazioni insorgono per eventi sul differenziamento neuronale.

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14 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9

Arabetta comune, Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana è un’angio- to collegamento con gli animali. La corona del fiore è for-
sperma, una dicotiledone della mata da quattro anelli concentrici (Figura A.5). L’anello
famiglia della senape (Brassica- esterno (whorl 1) è costituito da quattro sepali; il whorl
ceae) che comprende i più fami- 2 da quattro petali, il 3 da sei antere e quello interno da
liari broccoli, cavolo e rapanel- due carpelli che si fondono, formando il pistillo. Lo studio
lo. Arabidopsis è considerata ge- delle piante con mutazioni omeotiche ha mostrato un’al-
neralmente un’erbaccia e non terazione nell’identità dei whorl. Per esempio, in un mu-
ha importanza economica, ma tante, i carpelli si ritrovano nel whorl 1 al posto dei sepa-
le sue caratteristiche la rendo- li. Questo comportamento genetico ricorda le mutazioni
Nigel Cattlin/Alamy
no speciale come modello spe- nei geni omeotici in Drosophila, in cui gli arti si estendo-
rimentale. Arabidospis è piuttosto piccola; pertanto pos- no da segmenti del corpo scorretti. Inoltre, come in Dro-
sono essere fatte crescere molte piante in uno spazio ri- sophila, i geni omeotici di Arabidopsis codificano fattori
stretto. Ha un ciclo vitale breve, circa 5-6 settimane dal se- di trascrizione che agiscono tramite la formazione di gra-
me al fiore e ogni pianta è capace di autoimpollinazione, dienti di concentrazione nell’embrione in via di sviluppo
producendo migliaia di semi per ampi studi di mappatura (vedi Capitolo 22).
genetica. Inoltre, il genoma di Arabidopsis ha una dimen-
sione di meno del 5% del genoma del mais (2500 Mbp) e  I primi studi con Arabidopsis come organismo
di meno dell’1% di quello del grano (16 000 Mbp). Molti modello
laboratori nel mondo studiano Arabidospis e molti centri
di stoccaggio pubblici conservano scorte di semi di linee Arabidopsis è stato aggiunto piuttosto di recente al grup-
mutanti e varianti naturali di Arabidopsis dette ecotipi, co- po di organismi modello, ed è diventato un modello af-
sì come risorse genomiche. fermato solamente negli anni Ottanta. Nel 1907, Friedrich
Arabidopsis rappresenta un modello per quel che ri- Laibach ha identificato il numero di cromosomi di Arabi-
guarda fisiologia, sviluppo, genetica e struttura di tutte dopsis e nel 1940 ha proposto di usare questa pianta come
le piante. È anche un modello di come le piante interagi- organismo modello. Con l’aiuto di Albert Kranz, Laibach
scono con l’ambiente e di come percepiscono la lunghez- ha raccolto e organizzato molti ecotipi, che hanno contri-
za del giorno, il freddo, l’aridità e la presenza di sale e di buito alla collezione attuale di 750 ceppi di Arabidopsis. Il
come rispondono ai patogeni. Potremmo aspettarci che ci nascere di una comunità scientifica dedita alla ricerca su
siano molte differenze tra le piante e gli animali nella ge- Arabidopsis divenne chiaro con la pubblicazione di un bol-
netica dei programmi di sviluppo. Però gli studi sullo svi- lettino nei primi anni Sessanta, e con la prima Conferen-
luppo della corona (whorl) del fiore mostrano uno stret- za Internazionale su Arabidopsis tenutasi nel 1965. Negli
anni Ottanta, Arabidopsis era uno tra i numerosi modelli
vegetali tra i quali era anche compreso il mais, un model-
Stigma lo genetico ben consolidato. Con lo sviluppo della trasfor-
Pistillo Petali
(carpelli) Stilo mazione mediata dal T-DNA (vedi più avanti) nel 1986,
Arabidopsis è diventato velocemente il modello principa-
Antera le per la ricerca vegetale.
Sepali
(Whorl 1)
 Ciclo vitale

Arabidopsis ha un ciclo vitale comune delle piante (Figu-


ra A.6). Come in molte angiosperme, sia le cellule germi-
Petali nali maschili che quelle femminili risiedono nello stesso
(Whorl 2)
fiore e l’autofecondazione (autoimpollinazione) avviene
Stami facilmente. Le piante possono andare incontro anche a
(Whorl 3)
una fecondazione incrociata (impollinazione incrociata).
Carpelli Ciascuna pianta produce molti fiori che insieme possono
(Whorl 4) produrre più di 10 000 semi. Il ciclo vitale completo, dalla
germinazione del seme al nuovo raccolto di semi, richie-
FIGURA A.5 Anatomia del perigonio del fiore di Arabidopsis
thaliana. [Fonte: Per gentile concessione del Prof. Dr. Sabine de da 5 a 6 settimane, con lo sviluppo di radici, foglie, fio-
Zachgo.] ri, e alla fine i semi.

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ne usata negli studi dei vegetali. Però sono disponibili va-


ste collezioni di mutanti di Arabidopsis sequenziati e nei
centri di stoccaggio è possibile ordinare inserzioni speci-
Giorno 0
Seme fiche in singoli geni.
Giorno 1
Germinazione
Giorno 45 Interferenza da RNA Una funzione genica in Arabidop-
Sviluppo del seme
e senescenza Giorno 2 sis può essere eliminata con efficacia utilizzando l’RNAi
Comparsa (vedi Capitolo 22).
dell’ipocotile
Giorno 40 e dei cotiledoni
 Arabidopsis come organismo modello ai nostri
Giorno 3 giorni
Sviluppo
Giorno 30 della radice
Infiorescenza Evoluzione della pianta I quasi 750 differenti ceppi di
Giorno 7 Arabidopsis sono molto diversi per sviluppo e forma (per
Giorno 23 Sviluppo
Gemma il primo fiore della foglia esempio per la forma della foglia, il tempo di fioritura, la
setosità e la resistenza alle malattie) e sono stati usati per
spiegare l’evoluzione delle caratteristiche e le risposte del-
Giorno 11 la pianta all’ambiente.

Sensibilità alla luce Le piante hanno molte risposte diver-


so alla luce e Arabidopsis è un modello genetico per alcu-
FIGURA A.6 Il ciclo vitale di Arabidopsis thaliana. [Fonte: C. ne di queste. Una tipica risposta è quella di passare dalla
Douglas et al., Plant Cell 13: 1499-1510, 2001. Copyright © 2001, produzione di foglie a quella di fiori. Arabidopsis fiorisce
American Society of Plant Biologists.] quando la lunghezza del giorno aumenta ed è un model-
lo per la sensibilità alla luce del giorno. Inoltre, una ridot-
ta luce nel periodo di germinazione dei semi porta a una
 Tecniche genetiche
crescita alterata a causa di una modificazione di sviluppo
Mutagenesi Le piante possono essere mutagenizzate programmata che porta a piccole piante con un sistema
trattando i semi con radiazioni ionizzanti o mutageni radicale ridotto. Arabidopsis è stata usata come modello
chimici. Le piante che sono omozigoti recessivi per i ge- per comprendere la genetica che controlla come la luce
ni mutati possono essere facilmente ottenute con l’au- influenzi questo sviluppo precoce. Un altro processo sen-
tofecondazione. sibile alla luce in Arabidopsis in studio è il modo in cui la
pianta evita l’ombra.
Complementazione Arabidopsis fiorita può essere auto-
fecondata o incrociata con altre piante con tecniche simi- Ritmi circadiani Come potremmo aspettarci per organi-
li a quelle usate da Gregor Mendel, in cui le antere vengo- smi con uno stile di vita immobile e dipendenti dalla luce,
no tagliate, permettendo quindi il controllo dell’impolli- le piante mostrano forti ritmi circadiani. Arabidopsis è un
nazione e l’incrocio genetico (vedi Capitolo 2). modello eccellente per studiare le basi genetiche dei ritmi
circadiani e la natura del misterioso “oscillatore ritmico”.
Introduzione del DNA La trasformazione con il DNA ri-
combinante è mediata dal T-DNA (DNA di trasferimen- Resistenza della pianta ai patogeni Le piante sono do-
to) di Agrobacterium tumefaciens, che normalmente s’in- tate di un’ampia gamma di strategie per sopravvivere alle
serisce nei cromosomi in modo casuale. A. tumefaciens è condizioni di stress, come l’invasione di patogeni, e Ara-
un batterio gram-negativo che causa tumori nelle pian- bidopsis è un modello per lo studio dei patogeni e la dife-
te. Contiene un plasmide di 200 kbp che induce il tumo- sa contro di essi. Tra queste difese ci sono le molecole an-
re (Ti), il quale include geni che facilitano il trasferimen- timicrobiche, lo sviluppo di barriere fisiche e l’induzione
to replicativo del DNA in una cellula vegetale. Una volta della morte cellulare programmata.
introdotto nella cellula vegetale, il plasmide integra un
particolare segmento del suo DNA, il T-DNA, nel geno- Genetica di sviluppo delle piante Come organismo plu-
ma della pianta. Quando nel T-DNA si trova del DNA ricellulare, Arabidopsis ha un’ampia varietà di organi e ti-
ricombinante, anche questo viene inserito nel genoma. pi tissutali, ciascuno dotato di una propria genetica di svi-
luppo. Le aree di studio dello sviluppo comprendono la
Knockout genico La ricombinazione omologa di DNA crescita della foglia, la formazione della corona dei fiori,
transgenico, determinando un knockout genico, avvie- dei semi e delle radici, lo sviluppo del tessuto vascolare,
ne solo raramente nelle piante e normalmente non vie- l’embriogenesi e il piano di sviluppo del fiore.

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16 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster

Siamo tutti abituati a considera-


re il moscerino della frutta co-
me un fastidio cosmopolita, ma
Drosophila melanogaster ha una
Per gentile concessione di Marcos
storia lunga 100 anni come im-
Teixeira de Freitas
portante organismo modello per
studi di genetica e dello sviluppo. Il corpo del moscerino
della frutta è diviso in segmenti diversi che formano tre
sezioni principali: la testa, il torace e l’addome. Le sezioni
corporee sono racchiuse in una dura cuticola di chitina,
FIGURA A.7 Cromosoma politenico d’insetto. [Fonte: S. F. Werle
secreta dalle cellule epidermiche sottostanti, e sono ric-
et al., Can. J. Zool. 82: 118-129, 2004, Fig. 2. © 2004, NRC, Canada.]
che di particolari anatomici (indentazioni, peli) che ser-
vono come marcatori fenotipici per gli studi di genetica.
cromosomi si erano invertiti permettendo di mappare i
 I primi studi con Drosophila come organismo geni su un cromosoma, così come di stabilire la posizione
modello dei geni sui cromosomi.

Nel 1908 Thomas Hunt Morgan cercava un organismo  Ciclo vitale


idoneo per gli studi di genetica animale. A quel tempo
i finanziamenti per la scienza erano ridotti e quindi al- Le mosche hanno un breve ciclo vitale diploide (12 gior-
la fine decise di concentrarsi sulla Drosophila, in quan- ni) (Figura A.8). Il sesso nelle mosche è determinato dal
to economica e facile da crescere. Nel 1910, dopo due numero di copie di cromosoma X, non dal cromosoma Y
anni di studi senza successo, Morgan trovò un maschio (XX è femmina e il raro X0 è maschio), anche se il cromo-
con una mutazione spontanea che causava occhi bian- soma Y è necessario alla produzione dello sperma. All’in-
chi (questa mosca normalmente ha gli occhi rossi). Studi circa un giorno dopo l’accoppiamento, la femmina inizia
eleganti e dettagliati di quest’unico mutante hanno di- a deporre centinaia di uova. Le divisioni nucleari nell’em-
mostrato che i geni si trovano sui cromosomi, che ogni brione sono le più rapide di qualunque altro organismo
gene ha due alleli, che gli alleli si distribuiscono in ma-
niera indipendente durante la meiosi e che i geni po-
sti su cromosomi diversi si assortiscono in maniera in-
dipendente. Queste e altre scoperte importanti hanno Femmina

rafforzato le leggi di Mendel nel contesto fisico dei geni Maschio


localizzati sui cromosomi (vedi Capitolo 2). 
Il moscerino della frutta è stato anche il primo orga-
nismo per il quale si è ottenuta una mappa genetica. Al-
fred Sturtevant, uno studente del laboratorio di Morgan,
Embrione
mappò la distanza relativa tra i geni lungo i cromosomi in Pupa
funzione delle loro frequenze di ricombinazione per cros-
sing over. Calvin B. Bridges portò ancora più avanti que- Ciclo vitale di
Drosophila
sti studi identificando la posizione esatta dei geni lungo melanogaster
i cromosomi politenici. Questi cromosomi giganti, posti
1° stadio larvale
nelle ghiandole salivari del moscerino della frutta, sono
costituiti da gruppi di cromosomi impacchettati insieme Prepupa
e sono caratterizzati da schemi di bandeggio unici quan-
do vengono colorati (Figura A.7). Bridge identificò più di
2° stadio larvale
5000 bande disposte secondo uno schema tipico. Non si sa
perché si formino i cromosomi politenici, ma potrebbero
3° stadio larvale
essere collegati al ruolo della ghiandola salivare di secre-
zione dell’involucro della pupa durante la metamorfosi. FIGURA A.8 Ciclo vitale di Drosophila melanogaster. [Fonte:
Molte mutazioni basate sulla ricombinazione sono state Prof. Dr. Christian Klambt, Westfalische Wilhelms-Universitat
identificate con bande mancanti o con posizioni in cui i Munster, Institut fur Neuor- und Verhaltensbilogie.]

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pluricellulare e le uova si schiudono in un giorno circa. nell’adulto anche grazie all’uso di una ricombinasi di lie-
Il baco passa attraverso tre stadi larvali, separati da mu- vito inducibile dal calore (detta FLP) ingegnerizzata nel
te che richiedono circa 5 giorni. Le larve contengono i di- genoma. L’induzione del calore comporta un’elevata fre-
schi imaginali di tessuto destinati a trasformarsi nelle ap- quenza di ricombinazione mitotica nei tessuti riscaldati,
pendici della mosca adulta (come gli occhi, le antenne, le formando dei mosaici genetici. Anche se le alterazioni ge-
zampe, le ali, le altere, cioè ali modificate che funziona- netiche possono essere letali per gli embrioni, non neces-
no come stabilizzatori del volo) e le parti della bocca. Le sariamente uccidono l’adulto, dato che la loro espressio-
ghiandole salivari del terzo stadio larvale secernono l’in- ne è localizzata solamente in alcune cellule.
volucro della pupa, in cui la metamorfosi avviene in 31/2-
41/2 giorni fino alla mosca adulta. Le mosche vivono ap- Knockout genici È difficile ottenere dei knockout genici
prossimativamente 30 giorni. in Drosophila perché le tecniche di ricombinazione omo-
loga non sono ancora perfette. Esistono, però, delle pro-
 Tecniche genetiche cedure in due passaggi in cui un gene è inserito a caso, se-
guito dall’espressione delle proteine che determinano l’e-
Mutagenesi Le mosche possono essere mutagenizzate scissione del gene. Una volta escisso, il frammento di DNA
esponendole alle radiazioni ionizzanti o nutrendole con lineare può andare incontro alla ricombinazione omologa
sostanze chimiche mutagene. Le mutazioni che portano con il gene wild-type.
a cambiamenti nel colore dell’occhio, nella forma dell’ala
o di parti del corpo possono essere identificate mediante Interferenza da RNA L’RNAi può essere usata per dimi-
l’osservazione visiva. nuire efficacemente il prodotto di uno specifico gene in-
vece che eliminare realmente il gene.
Introduzione di DNA Per inserire il DNA ricombinante
viene usato un processo noto come trasformazione dell’e-  Drosophila come organismo modello ai nostri
lemento P, di norma usato per studiare gli effetti dell’e- giorni
spressione proteica sugli elementi di controllo della tra-
scrizione. L’elemento P è un trasposone di 3 kbp che può Malattie umane Il genoma di Drosophila, di circa 170 Mbp,
portare una sezione di DNA ricombinante tra le sue ripe- è all’incirca venti volte più piccolo del genoma di topo e
tizioni terminali al posto della trasposasi e del repressore di quello umano, eppure codifica approssimativamente lo
da esso codificati (vedi Capitolo 14). Il DNA dell’elemento stesso numero di famiglie geniche. All’incirca il 60% dei
P ricombinante viene iniettato nell’uovo fecondato, insie- geni noti per essere coinvolti in malattie umane ha degli
me a un plasmide che codifica una trasposasi. L’inserimen- omologhi nel moscerino della frutta. Per esempio, gli stu-
to è casuale e il plasmide che codifica il gene della traspo- di dei geni embrionali letali in Drosophila hanno permes-
sasi viene perso durante le divisioni cellulari, impedendo so di spiegare la base genetica di difetti della nascita uma-
in questo modo la reintroduzione del trasposone in altri na. Altri modelli di malattia sono i difetti immunologici,
punti nel genoma. il diabete, il cancro, il morbo di Huntington, di Alzheimer
e di Parkinson.
Cromosomi bilanciatori Alleli letali recessivi possono
essere mantenuti stabilmente nei moscerini della frutta Piano di sviluppo del corpo La localizzazione dell’mRNA
quando sono appaiati a un cromosoma bilanciatore, un materno nelle uova porta a un’espressione genica localiz-
cromosoma che non può ricombinare con il suo omologo zata che stabilisce gli assi antero-posteriore e dorso-ven-
per la presenza di molte inversioni interne che impedisco- trale in Drosophila. Questi geni controllano il piano di svi-
no l’allineamento completo durante la meiosi. I cromoso- luppo corporeo e hanno i loro corrispondenti negli ani-
mi bilanciatori sono letali quando sono omozigoti, quin- mali più complessi. Quindi il moscerino serve come siste-
di l’unica progenie che sopravvive è eterozigote per il ge- ma piuttosto semplice per comprendere la formazione
ne letale recessivo e il bilanciatore. del piano corporeo (vedi Figura 16.24 e Capitoli 21 e 22).

Mosaici genetici Con l’induzione della ricombinazione Comportamento Drosophila fornisce un modello per la
mitotica mediante irradiazione con raggi X, nel mosce- comprensione della base cellulare e molecolare di alcu-
rino della frutta adulto si possono formare dei mosaici ni tipi di comportamento. Le anomalie di comportamen-
genetici, porzioni di tessuti geneticamente alterati. I mo- to del moscerino della frutta comprendono cambiamenti
saici sono particolarmente utili quando si studiano i geni nell’apprendimento e nella memoria, nella ricerca del ci-
letali. I mosaici genetici dei geni letali possono formarsi bo, del riposo, e in altri comportamenti, e nell’alcoolismo.

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Topo domestico, Mus musculus

Il topo domestico, Mus muscu- za del genoma. Little fondò anche il Jackson Laboratory
lus, è stato collezionato e alle- in Bar Harbor, Maine, un centro di genetica del topo che
vato dagli “amanti” dei topi per serve anche come deposito pubblico di modelli murini
centinaia di anni, e alcuni dei per la ricerca scientifica.
ceppi puri, sviluppati da questi,
sono usati oggi come standard  Ciclo vitale
iStockphoto per gli studi scientifici. Il topo
domestico è il modello di mam- I cromosomi X e Y determinano il sesso nei topi, come ne-
mifero principale ed è più simile agli uomini di quanto ci gli uomini. La fecondazione dà origine a una blastocisti
piaccia ammettere (vedi Figura 1.12). Il genoma del topo contenente alcune cellule non differenziate unite assieme
ha quasi la dimensione di quello umano e codifica essen- nella massa cellulare interna, la fonte di cellule staminali
zialmente lo stesso numero di geni; il 99% di questi ha un embrionali. La gestazione dura 19-21 giorni e porta a una
omologo nell’uomo. Infatti, una gran parte del genoma nidiata di 3-14 piccoli. La maturità sessuale richiede cir-
murino è sintenico con il nostro, ovvero interi blocchi di ca 6 settimane per le femmine e 8 settimane per i maschi,
geni si ritrovano nello stesso ordine in entrambe le specie ma l’accoppiamento può avvenire in soli 35 giorni. I topi
(vedi Figura 8.4). vivono 1-2 anni e le femmine possono dare 5-10 nidiate,
Rispetto ad altri organismi modello, lavorare con i to- sostanzialmente nel primo anno di vita.
pi è più complicato sotto ogni aspetto. Sono più grandi,
ovviamente, ma hanno anche un tempo di generazione  Tecniche genetiche
di circa 8-10 settimane e producono, in media, solamen-
te da 6 a 8 piccoli per nidiata. Questi numeri sono molto Mutagenesi Gli incroci tra consanguinei per molte gene-
interessanti se confrontati con altri mammiferi, ma po- razioni hanno portato a molti ceppi utili di topi mutati.
co se confrontati con altri organismi modello. Le colonie L’aggiunta di sostanze chimiche mutagene al nutrimento
di topo sono anche costose da mantenere e non posso- facilita lo sviluppo di ceppi mutati.
no essere trattati i numeri necessari per attuare grandi
screening genetici, come avviene con altri organismi mo- Introduzione di DNA Il DNA estraneo può essere inietta-
dello. Però, a differenza del nematode e del moscerino del- to direttamente nel nucleo delle uova fecondate, seguito
la frutta, i topi hanno sistemi biologici senza paralleli in dall’impianto delle uova nell’ovidotto della femmina rice-
modelli animali inferiori, come il sistema immunitario e vente. L’integrazione casuale avviene con elevata frequen-
l’apparato scheletrico, o sono semplicemente modelli mi- za. Il DNA ricombinante usato di norma ha un promotore
gliori per studi di sistemi complessi come l’apparato car- di topo che dirige l’espressione di un gene reporter, come
diovascolare, il sistema endocrino e molti altri. Il topo è lacZ o GFP (proteina fluorescente verde), in modo che l’e-
un modello per le malattie umane, come il cancro, prati- spressione del transgene possa essere seguita durante lo
camente in tutti questi sistemi. sviluppo. Circa metà dei topi transgenici contiene DNA
ricombinante nella linea germinale e quindi passa il gene
 I primi studi sul topo come organismo modello ricombinante alle generazioni future.

Gli studi genetici sui topi iniziarono nei primi anni del Knockout genico Il knockout mirato come modello di una
Novecento, quando la selezione e l’incrocio erano i prin- malattia murina viene ottenuto a partire dalle cellule sta-
cipali metodi per ottenere una progenie con i caratte- minali embrionali (Figura A.9). Le cellule staminali sono
ri desiderati. Questi primi studi portarono a un model- estratte dalla massa cellulare interna della blastocisti e
lo generale che spiegava il colore della pelliccia in tutti fatte crescere in coltura. Le cellule staminali coltivate so-
gli altri mammiferi con pelo. I topi e i ratti hanno anche no poi trasformate con del DNA lineare contenente una
una lunga storia negli studi nutrizionali, specialmente copia mutata del gene in esame, insieme ai geni per la re-
per l’identificazione di vitamine e sintomi causati dal- sistenza alla neomicina (neor) e la timidina chinasi (tk).
la mancanza di vitamine nella dieta. L’utilizzo dei topi DNA omologo fiancheggia il gene mutato (genemut nella
in un modello di malattia umana è stato avviato da Cla- Figura A.9) e il gene neor, in maniera tale che l’integrazio-
rence Cook Little. Negli anni Venti, mediante incroci ne omologa sostituisca il gene wild-type con il gene mu-
tra consanguinei, questi sviluppò un ceppo di topo, il tato insieme a quello per la neor. Al contrario, il DNA che
C57BL/6 (comunemente detto Black6), che alla fine di- si inserisce casualmente porta all’integrazione dell’intero
venne il ceppo di topo usato per determinare la sequen- frammento di DNA, compresa la tk.

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Blastocisti omologa, perché queste cellule contengono la tk, e la ti-


midina chinasi trasforma il ganciclovir in una tossina che
Cellule uccide queste cellule. Solamente le cellule che contengo-
della massa
interna no i knockout genici prodotti dalla ricombinazione omo-
(cellule staminali) loga sopravvivono a entrambe le selezioni. Le cellule sta-
minali ingegnerizzate vengono iniettate in un embrione
ospite wild-type allo stadio di blastocisti. Questo porta al-
la formazione di un embrione che è una chimera dell’o-
Estratto spite wild-type e delle cellule ingegnerizzate donatrici. Le
di cellule staminali
chimere risultanti vengono incrociate per trasmettere la
modificazione genetica attraverso la linea germinale. I to-
pi eterozigoti della F1 (prima generazione) vengono poi in-
genemut neor tk
Trasformazione crociati per ottenere una progenie F2 wild-type, eterozi-
gote e omozigote, nell’atteso rapporto mendeliano 1:2:1.
genemut neor genemut neor tk Accoppiamenti selezionati portano a topi knockout omo-
zigoti. Sono state sviluppate tecniche per conservare, tra-
mite crioconservazione di sperma e di cellule uovo, ceppi
Nessuna Integrazione Integrazione di topo preziosi e difficili da ottenere.
integrazione omologa non omologa

Uso della neomicina  Il topo come organismo modello ai nostri


per selezionare la neor giorni
genemut neor genemut neor tk
Malattie umane Il topo è un modello importante per lo
studio delle malattie umane. I modelli delle malattie pos-
Nessuna Integrazione Integrazione sono essere ottenuti tramite accoppiamento tra consan-
integrazione omologa non omologa guinei o producendo knockout di noti geni responsabili
Uso del ganglocivir di malattie. I modelli murini di malattie umane compren-
per selezionare contro la tk dono il cancro, l’arteriosclerosi, l’invecchiamento, l’iper-
tensione, le malattie metaboliche, le malattie del sistema
genemut neor genemut neor tk
immunitario, il diabete di tipo 1 e tipo 2, la sindrome di
Down, il morbo di Alzheimer, il glaucoma, l’osteoporosi,
Integrazione Integrazione l’obesità, l’epilessia, la malattia Lou Gehrig (la sclerosi la-
omologa non omologa terale amiotrofica), il morbo di Huntington, le malattie
del sangue e molte altre.
Iniezione nell’embrione
Mappatura dei geni mutati I geni mutati possono essere
identificati più velocemente nel topo rispetto ai geni mu-
tanti negli uomini. Ceppi di topo molto simili (come Mus
musculus e Mus spretus) possono essere incrociati per pro-
durre ibridi che generalmente presentano sequenze di-
Eterozigote knockout
verse in posizioni polimorfiche, permettendo ai ricerca-
tori di usare l’analisi di associazione per sviluppare map-
Incrocio della progenie pe genetiche dettagliate e localizzare un gene responsa-
per ottenere un topo
omozigote recessivo bile di una malattia.

FIGURA A.9 Costruzione di un topo knockout. Comportamento Esistono modelli murini per certi tipi di
comportamento, come l’alcoolismo, la dipendenza da dro-
ghe, disturbi ansiosi e comportamento aggressivo.
Per selezionare le cellule con il gene knockout opportuno,
sono necessari due passaggi. La selezione per la neor, gra- Sviluppo del mammifero I topi transgenici sono usati per
zie all’uso della neomicina, uccide tutte le cellule che non studiare la posizione e la modalità di espressione di par-
hanno integrato il DNA trasformante. La selezione contro ticolari geni in vari momenti dello sviluppo. Inoltre, esi-
la tk, con l’uso dell’antivirale ganciclovir, uccide le cellu- stono modelli per studiare alcune malattie dello sviluppo
le che hanno integrato del DNA per ricombinazione non umano, come il labbro leporino e la palatoschisi.

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