I.T.I.S.

Enrico Fermi Treviso

ESAME DI STATO 2010/2011

Micropropagazione
Moltiplicazione in vitro delle piante

Enrico Foltran 5 A Chimica

Indice
Indice .................................................................................................................................................... 2 Premessa .............................................................................................................................................. 3 Introduzione ......................................................................................................................................... 4 Cos la micropropagazione? ............................................................................................................... 5 La micropropagazione in Italia ............................................................................................................. 6 Limportanza della micropropagazione ............................................................................................... 7 Vantaggi ........................................................................................................................................... 7 Svantaggi .......................................................................................................................................... 7 Le fasi della micropropagazione .......................................................................................................... 8 Reperimento degli espianti .............................................................................................................. 8 Sterilizzazione degli espianti ............................................................................................................ 8 Impianto del materiale vegetale sterilizzato ................................................................................... 9 Proliferazione degli espianti............................................................................................................. 9 Allungamento dei germogli ............................................................................................................ 10 Radicazione dei germogli ............................................................................................................... 10 Acclimatazione delle piante ........................................................................................................... 10 Esperienza in laboratorio ................................................................................................................... 12 Preparazione del materiale ............................................................................................................ 12 Il terreno colturale ......................................................................................................................... 12 Composizione ............................................................................................................................. 12 Preparazione .............................................................................................................................. 13 Sterilizzazione............................................................................................................................. 14 Reperimento degli espianti ............................................................................................................ 14 Sterilizzazione degli espianti .......................................................................................................... 15 Coltura in vitro ............................................................................................................................... 16 Conclusioni ..................................................................................................................................... 17 Bibliografia e sito grafia ..................................................................................................................... 18

Premessa
Cosa mi ha fatto scegliere questo argomento.

Introduzione
Spiegare in breve di cosa tratta la tesina facendo un breve riassunto di tutti i punti.

Cos la micropropagazione?
La micropropagazione una tecnica di moltiplicazione delle piante che permette di ottenere cloni della pianta stessa, ovvero un insieme di individui dotati dello stesso patrimonio genetico, tramite l'utilizzo dei moderni metodi di coltura in vitro di cellule e tessuti vegetali. La micropropagazione si differenzia dagli altri sistemi di moltiplicazione per la sofisticata tecnica operativa, che permette la produzione di cloni esenti da infezioni batteriche e virali; tale pratica permette inoltre, da esigui materiali di origine, di ottenere unenorme quantit dindividui clonati. Sin dal 1940 era nota la possibilit di mantenere vivi, in vitro, tessuti vegetali isolati dalla pianta, anche per lunghi periodi; il graduale affinamento delle tecniche di laboratorio permise, negli anni successivi, di ottenere la rigenerazione completa (ovvero la nascita di una nuova pianta) partendo dalle cellule e dai tessuti in coltura. Tale possibilit data dalla cosiddetta totipotenza, propriet intrinseca delle cellule vegetali, che permette da una singola cellula di sviluppare un intero organismo. Attualmente la produzione di piante per micropropagazione rappresenta un settore in costante e rapidissima evoluzione, al punto che, per un certo numero di specie, essa si gi imposta nella realt operativa. Il sistema particolarmente vantaggioso per la possibilit di produrre in un minor lasso di tempo e dallo stesso espianto una grande quantit di piantine rispetto ai sistemi tradizionali.

La micropropagazione in Italia
La storia della micropropagazione commerciale (o su larga scala) in Italia risale agli anni 60, quando in Liguria alcuni laboratori iniziarono unattivit di coltura in vitro basata sulla proliferazione di garofano e sulla moltiplicazione di orchidee. Verso la fine degli anni 60, il risanamento da batteri e funghi di piante fruttifere arboree fu praticato dai Vivai Zanzi, con lassistenza dellIstituto di Patologia Vegetale di Bologna. Queste attivit, tuttavia, non presero in considerazione la possibilit di compiere una moltiplicazione clonale su larga scala, quanto quella di ottenere stock foundations di materiali risanati da batteri o da virus. Fu solo nel 1976 che si realizz il primo grande laboratorio di micropropagazione italiano. Esso nacque dallesigenza di eliminare virus, batteri che infestavano i vivai e le coltivazioni di fragole della Romagna. Il Consorzio del Fragolone di Cesena si fece carico dellallestimento del Laboratorio (con il sostegno della Regione Emilia Romagna e con lassistenza tecnica dellIstituto Sperimentale per la Frutticoltura di Roma). Durante i primi otto mesi furono prodotte circa un milione di plantule. Con la costruzione di altri laboratori, in Romagna e in altre Regioni, si assisteva nel 1991 alla produzione di circa quindici milioni di piante micro propagate, ottenute da una ventina di laboratori commerciali. Nella ricognizione effettuata nel 1999, i fruttiferi erano largamente dominanti, ma con unofferta crescente di ortaggi, piante ornamentali da fiore, da fronda o da interno, si fece uno sforzo considerevole per incrementare e migliorare i protocolli di moltiplicazione in vitro di numerose altre specie. Gli ultimi dati produttivi si riferiscono a unindagine del 2006 che stimava la produzione italiana di piante radicate micro propagate in circa trenta milioni, comprendente ventuno tipologie di raggruppamenti vegetali.

Limportanza della micropropagazione

Rispetto ad altre tecniche di propagazione convenzionali, la micropropagazione riesce a produrre in breve tempo un maggior numero di piante, geneticamente uniformi ed esenti da virus. La vera limitazione della micropropagazione per molte piante lalto costo di produzione, infatti, per molte specie lutilizzo dei semi, naturalmente esenti da malattie e prodotti in grandi quantit, permette di produrre facilmente un adeguato numero di piante in tempi relativamente brevi e a costi molto inferiori. In seguito sono riassunti i principali vantaggi e svantaggi di tale tecnica.

Vantaggi
1. Produzione, in tempi brevi, di un grande numero di piante da ununica pianta madre; 2. Uniformit genetiche delle piante ottenute con la pianta madre (si evitano in questo modo mutazioni indesiderate della specie); 3. Produzione di piante virus-esenti; 4. Grande numero di piantine in uno spazio ristretto; 5. Svincolamento dai cicli stagionali; 6. Produzione di piante pi robuste con una conseguente crescita accelerata rispetto alle piante tradizionali; 7. Produzione di piantine pronte per la crescita con conseguente risparmio di tempo per il coltivatore quando la specie produce semi lenti a germogliare; 8. utile a moltiplicare le piante che producono semi in quantit antieconomica, o quando le piante sono sterili e non producono semi vitali.

Svantaggi
1. Alti costi iniziali per le attrezzature richieste; 2. Necessit di personale qualificato; 3. Le piante prodotte sono geneticamente identiche e quindi vulnerabili alle stesse infezioni.

Le fasi della micropropagazione

La tecnica della micropropagazione effettuata attraverso diversi passaggi consecutivi, con i quali, dal singolo espianto di partenza, sono prodotte diverse nuove piante. La fase della micropropagazione hanno tutte unimportanza fondamentale per lottenimento di piantine adatte allo stadio finale di acclimatazione, ovvero, il trasferimento delle piante prodotte dallambiente in vitro allambiente in vivo (nelle serre). Tutte le fasi sono tra loro collegate ed eventuali errori operativi commessi si ripercuoto nelle fasi successive. Le fasi in cui si articola la micropropagazione sono: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Reperimento degli espianti; Sterilizzazione degli espianti; Impianto del materiale vegetativo sterilizzato; Proliferazione degli espianti; Allungamento dei germogli; Radicazione degli espianti; Acclimatazione.

Tutte le fasi, tranne lultima di acclimatazione, sono effettuate in laboratorio sotto cappa a flusso laminare per mantenere lambiente sterile.

Reperimento degli espianti

La base di partenza del processo di micropropagazione lespianto, rappresentato preferibilmente da un germoglio o una gemma ma che in linea teorica pu essere una qualsiasi porzione di tessuto vegetale. Gli espianti sono prelevati dalle cosiddette piante madri, piante allevate in ambiente controllato dal punto di vista igienico-sanitario esenti da virus e malattie e con un buon vigore vegetativo. In genere si preferiscono tessuti giovani che hanno una capacit di accrescimento maggiore dei tessuti pi maturi. Pi piccolo sar lespianto pi la tecnica e la strumentazione con cui si opera, sar accurata (se si opera con porzioni vegetali di poche decine di millimetro, si dovr ricorrere al microscopio e a personale qualificato) con conseguente aumento dei costi.

Sterilizzazione degli espianti

Una delle caratteristiche principali della micropropagazione rappresentata dalla condizione di sterilit in quasi tutte le fasi in cui si opera. A tale scopo prima di procedere alla coltura dellespianto necessario sottoporre il materiale vegetale a unaccurata fase di sterilizzazione volta a debellare batteri e virus naturalmente presenti nelle piante che troverebbero nel terreno colturale di crescita un ottimo ambiente per lo sviluppo e la moltiplicazione. 8

La sterilizzazione compiuta con diversi principi attivi, tra i principali troviamo lipoclorito di sodio (NaClO, in soluzione acquosa al 5% comunemente chiamato varecchina) e letanolo (C2H5OH, il comune alcol etilico). La sterilizzazione eseguita immergendo il materiale vegetale nelle diverse soluzioni sterilizzanti in successione e terminando con un accurato risciacquo con acqua deionizzata sterile per evitare che i principi attivi, rimanendo per lungo tempo sulla superficie vegetale, la intacchino.

Impianto del materiale vegetale sterilizzato

Limpianto del materiale vegetale sterile eseguito sotto cappa a flusso laminare, per ridurre al minimo lapporto ambientale di batteri, e utilizzando strumenti di lavoro sterilizzati. Gli espianti sono collocati in contenitori di vetro, in precedenza sterilizzati, che contengono il terreno di coltura (Figura 1) e vi rimangono per 15-30 giorni, in seguito le colture che non presentano contaminazione sono trasferite in terreno colturale fresco e poste in una camera di crescita con buona intensit luminosa, fotoperiodo di sedici ore su ventiquattro e una temperatura costante di 21-25 C.

Figura 1

Proliferazione degli espianti

Lo scopo di questa fase aumentare considerevolmente il numero dei germogli attraverso diverse sub-culture che prevedono il trasferimento degli espianti in terreni colturali freschi ogni 15-30 giorni. In questo stadio si utilizzano contenitori da 500 ml di volume (vasi di coltura) nei quali sono collocati un numero variabile (dipende dalla specie) di germogli provenienti dalla fase precedente. In genere, per favorire la moltiplicazione dei germogli, nel terreno aumentata la concentrazione di citochinina, un ormone che favorisce la divisione cellulare.
Figura 2 - Fase di proliferazione degli espianti. (immagine da http://www.clonal-solutions.com.au/)

Allungamento dei germogli

Lallungamento la fase di preparazione dei germogli alla radicazione. In questa fase abbassata notevolmente la quantit di citochinina nel terreno colturale per favorire la distensione cellulare e il conseguente allungamento dei germogli formati durante la fase di proliferazione. Lallungamento non indispensabile ma trova una costante applicazione per molte specie perch permette di ottenere materiale omogeneo e facile da maneggiare.

Radicazione dei germogli

La radicazione lultima fase che precede lacclimatazione delle plantule in vivo, lo scopo di tale stadio favorire la formazione di radici; a tal proposito i germogli sono spostati in un substrato di crescita in cui si elimina gran parte o tutta la citochinina in favore dellauxina, un ormone che favorisce la radicazione. Le nuove radici formate non hanno capacit di assorbimento attivo, ma da queste, in fase di acclimatazione, si formeranno nuove radici funzionali. Dopo un tempo variabile di 2-4 settimane di coltura nel substrato di radicazione, i germogli saranno trasferiti alla fase di acclimatazione.

Acclimatazione delle piante

La fase di acclimatazione la fase pi delicata della micropropagazione, le condizioni ambientali durante la coltura in vitro (umidit relativa elevata, temperatura costante, bassa intensit luminosa ecc.) determinano, infatti, delle alterazioni anatomiche e funzionali nella pianta neo formata che possono compromettere la sua sopravvivenza in condizioni naturali. In particolare le radici formate nella fase di radicazione non hanno ancora sufficiente capacit di assorbimento per soddisfare in fabbisogno dacqua della pianta, in alcuni casi avviene una repentina disidratazione delle piante al momento del trasferimento dal vaso di coltura allambiente esterno. Le fasi pi critiche dellacclimatazione sono essenzialmente due: a) fase di attecchimento al nuovo substrato; b) fase di ambientamento alle condizioni ambientali esterne. Nella prima fase gioca un ruolo molto importante la formazione di nuove radici funzionali in grado di sostenere la domanda dacqua e di nutrimento della pianta. Nella seconda fase, attraverso una graduale diminuzione dellumidit relativa e della temperatura si cerca di favorire una modificazione anatomica e fisiologica della pianta per riportarne allorigine le funzioni vitali che la coltura in vitro ha modificato. Lesecuzione di unefficace fase di acclimatazione richiede perci serre in cui sia possibile controllare fattori come umidit, temperatura e intensit luminosa.

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Figura 3 - Piantine in fase di acclimatazione in serra. (immagine da http://shaheeriyyad.blogspot.com/)

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Esperienza in laboratorio
Lesperienza copre le prime tre fasi della micropropagazione poich lattrezzatura e i reagenti richiesti per le fasi successive non sono presenti nei laboratori scolastici.

Preparazione del materiale

Tutto il materiale utilizzato per il trattamento e lincubazione degli espianti stato sterilizzato in autoclave a 121C per 20 minuti al fine di eliminare virus e batteri. Gli strumenti di lavoro come pinze e forbici sono state sterilizzate tramite flambaggio con becco bunsen. Si proceduto anche alla pulizia della cappa a flusso laminare lavando accuratamente tutte le pareti con NaClO all8% e lasciandola accesa per consentire il riflusso dellaria. stata controllata lintegrit e la chiusura ermetica dei tappi di tutti i provettoni che serviranno in seguito per linoculo degli espianti.
Figura 4 - Provettoni per l'inoculo degli espianti

Il terreno colturale
Il terreno colturale scelto per la coltura lM&S (inventato nel 1962 dagli scienziati Toshio Murashige e Folke K. Skoog) il substrato pi comunemente usato nel campo delle colture in vitro di cellule vegetali.

Composizione
Costituenti
Macronutrienti inorganici Nitrato dammonio

Formula chimica
NH4NO3

Quantit
1.650 mg/l

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Cloruro di calcio Solfato di magnesio Fosfato di potassio Nitrato di potassio Micronutrienti inorganici Acido borico Cloruro di cobalto Solfato di rame Solfato ferroso Solfato di manganese Ioduro di potassio Molibdato di sodio Solfato di zinco Fonti di carbonio organico Saccarosio Ormoni IAA Chinetina Vitamine Mio-inositolo Niacina Piridossina Tiamina Altri additivi EDTA Glicina Etilendiammina Agar

CaCl2 * 2H2O MgSO4 * 7H2O KH2PO4 KNO3 H3BO3 CoCl2 * 6H2O CuSO4 * 5H2O FeSO4 * 7H2O MnSO4 * 4H2O KI Na2MoO4 * 2 H2O ZnSO4 * 7H2O C12H22O11

440 mg/l 370 mg/l 170 mg/l 1.900 mg/l 6,2 mg/l 0,025 mg/l 0,025 mg/l 27,8 mg/l 22,3 mg/l 0,83 mg/l 0,25 mg/l 8,6 mg/l 20 g/l 1-30 mg/l 0,004-10 mg/l 100 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l 0.1 mg/l

Na2EDTA * 2H2O

37,2 mg/l 2,0 g/l 1,0 g/l 10 g/l

Preparazione
La preparazione di 1 litro di terreno si svolge secondo i seguenti punti: 1. si pesano tutti i componenti che fanno parte del substrato; 2. si riempie una beuta da 1 litro con l80% del volume finale di acqua (in questo caso 800 ml di acqua); 3. si aggiungono nella beuta tutti i componenti solidi del terreno e si agita fino a completa dissoluzione; 4. si aggiungono tutti i componenti liquidi (vitamine, ormoni ecc.); 5. si porta il tutto alla temperatura di circa 50C con una piastra riscaldante mantenendo lagitazione; 6. in una seconda beuta pi piccola si aggiunge il restante 20% di acqua e 10 grammi di agar; 7. si porta la seconda beuta alla temperatura di circa 80C in modo da solubilizzare lagar; 8. si incorpora la seconda beuta nella prima, in questo modo si evita di scaldare i componenti termolabili del terreno colturale a 80C; 9. mantenendo il terreno colturale a circa 50C si procede alla semina, cio si riempiono i provettoni con il terreno, che, raffreddandosi, gelifica grazie allagar che a temperature inferiori a 50C solida. 13

Figura 5 - Beuta da 1 litro contenente i componenti del terreno colturale.

Figura 6 - Beuta da 500 ml contenente lagar.

Sterilizzazione
La sterilizzazione stata compiuta trattando i provettoni con dentro il terreno colturale in autoclave a 121C per 20 minuti. Da questo momento lambiente di crescita sterile e tutte le fase successive saranno effettuate sotto cappa a flusso laminare.

Reperimento degli espianti

Per questo esperimento tutti i campioni di materiale vegetale non provengono da piante madri ma da comuni piante da giardino. Sono state raccolte 9 specie di piante diverse preferendo gli alberi da frutto perch hanno una percentuale di attecchimento al substrato maggiore.

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Figura 7 - More

Figura 8 - Rose rampicanti

Figura 9 - Limone

Figura 10 - Melograno

Figura 11 - Caco

Figura 12 - Vite

Figura 13 - Gocce d'oro (prugne)

Figura 14 - Pesco

Figura 15 - Albicocco

Sterilizzazione degli espianti

La sterilizzazione del materiale vegetale stata eseguita immergendolo in etanolo al 70% per pochi secondi (letanolo disidrata le cellule batteriche uccidendole) e in seguito in NaClO all8% per 15 minuti (lipoclorito di sodio uccide i virus).

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Figura 16 - Fase di sterilizzazione degli espianti in NaClO

Successivamente il materiale vegetale stato accuratamente lavato con acqua sterilizzata in modo da eliminare in principi attivi delletanolo e dellipoclorito di sodio che danneggerebbero i tessuti.

Coltura in vitro
Dal materiale vegetale sterilizzato sono stati isolati 7 espianti per ogni specie, comprendenti gemme, parti legnose o semi-legnose come gambi e frammenti di foglie per un totale di 63 provettoni riempiti.
1 Gemma Gemma Gemma Gemma Gemma Gemma Gemma Gemma Gemma 2 Gemma Foglia Gambo Foglia Gemma Gambo Gambo Gemma Gambo 3 Gemma Foglia Gambo Foglia Gambo Gambo Foglia Gambo Gambo 4 Gambo Foglia Gemma Foglia Gambo Foglia Foglia Foglia Gambo 5 Gambo Foglia Foglia Foglia Foglia Gambo Foglia Foglia Gambo 6 Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia 7 Gambo Foglia Foglia Foglia Foglia Gambo Foglia Foglia Foglia

Mora Rose rampicante Limone Melograno Caco Vite Gocce doro Pesco Albicocco

Operando sotto cappa a flusso laminare gli espianti sono stati piantati nel substrato dentro i provettoni con lutilizzo di pinzette sterilizzate. I campioni sono stati trasferiti in una stanza con temperatura e umidit ambiente e una luminosit elevata, impedendo per che gli espianti ricevessero direttamente i raggi del sole.

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Figura 17 - Espianti di vite in vitro.

Figura 17 - Espianti di limone in vitro.

Conclusioni

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Bibliografia e sito grafia

Micropropagazione (http://micropropagazione.blogspot.com) Wikipedia Italia Lenciclopedia libera (http://it.wikipedia.org/wiki/Pagina_principale) Wikipedia The free encyclopedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Main_Page) Clonal Solutions Australia (http://www.clonal-solutions.com.au) Video - Plant Tissue Culture Media Preparation (http://www.youtube.com/watch?v=ltbdM3boWmU) Video - Aseptic Transfer Techniques (http://www.youtube.com/watch?v=zd0iVJrQwyY)

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