Le biotecnologie

Le biotecnologie sono applicazioni tecnologiche che usano organismi viventi o loro derivati per realizzare
prodotti o processi per usi specifici, vantaggiosi per l’uomo.
Possono essere:
 Moderne, o chiamate tecnologia del DNA ricombinante perché in qualche modo si va a manipolare il
DNA per ottenere nuovi fenotipi (nuove espressioni utili nell’organismo manipolato).
Gli ambienti di applicazione di quelle moderne vengono divisi in:

 Green biotech, che riguardano l’ambiente e portano al miglioramento di alcune specie vegetali;
 White biotech, che sono quelle della farmaceutica (antibiotici) e trovano sostanze chimiche che sono
a basso impatto ambientale
 Red biotech, che sono quelle della medicina, usate sia per le diagnosi che per terapie e per la
produzione di vaccini

 Tradizionali, di cui un primo esempio sono i fermenti e i lieviti nella fermentazione, mentre quelle
moderne consentono di andare a modificare o duplicare un gene, ovvero un tratto di DNA la cui
espressione porta ad un enzima o ad una proteina.
Il gene che ci interessa è il gene d’interesse, che può essere duplicato, ovvero si possono ottenere tantissime
copie del gene che ci interessa oppure tantissime copie di un frammento di DNA che ci interessa.
Abbiamo due modi per ottenere queste copie:

 PCR (polymerase chain reaction), che consiste nella reazione a catena della polimerasi
 Clonaggio in vettore

La PCR ha un limite ed un vantaggio:

 Limite: per usare l’amplificatore di questo tipo devo conoscere le sequenze nucleotidiche
all’estremità del frammento da amplificare e si svolge nel termociclatore
 Vantaggio: una volta che ho messo tutto ciò che mi serve nell’apparecchio, il lavoro da parte
dell’operatore è semplificato.
(L’altro modo è il clonaggio CHE STA DOPO, una tecnica più lunga ma che non presenta il limite di dover
conoscere le sequenze dell’estremità)
Per quanto riguarda la PCR, nel termociclatore mettiamo sia il DNA che vogliamo amplificare e poi A T G
C, ovvero 4 boccette di desossiribosio, e poi inseriamo l’enzima che si occuperà dell’amplificazione ovvero
la TAQ polimerasi, il cui nome deriva da un batterio di nome themus aquaticus, che ha la capacità di
sopravvivere a temperature estreme (può operare a temperature di 90° senza essere denaturato).
Dunque, all’interno del termociclatore inseriamo:

 Frammenti di DNA
 4 nucleotidi
 TAQ polimerasi
 Primer, per iniziare la duplicazione
Poi si chiude e si impostano i cicli di duplicazione.
Abbiamo più fasi:

 Denaturazione: un apparecchio deve denaturare il DNA, ovvero deve rompere i legami ad idrogeno e
si fa arrivando a 90° in modo da separare i due frammenti di DNA
  Ibridazione: l’apparecchio si porta a 65° e avviene l’annealing (appaiamento) dei primer, ovvero i
primer si appaiano all’estremità 3’ di ciascun filamento
 Allungamento: interviene la TAQ polimerasi che agisce in maniera continua sui filamenti e copia;
così finisce il primo ciclo, a cui si susseguono altri cicli per ottenere moltissime copie
Clonaggio
Consiste nell’amplificazione del DNA (diverso dalla clonazione).
Abbiamo bisogno di geni di interesse, enzimi di restrizione e vettori, ovvero organismi in grado di trasferire
ed introdurre in una cellula i geni di interesse.
I vettori possono essere:

 Virus, quando il DNA di interesse che vogliamo amplificare è in grande quantità

 Plasmide, ovvero DNA extracromosomico che ha origine di replicazione propria, ha dei siti per
l’antibiotico resistenza e dei siti polylinker (nei quali viene inserito un DNA esterno grazie all’aiuto
degli enzimi di restrizione). Il plasmide, a differenza del virus, porta meno gene di interesse.
Gli enzimi di restrizione sono invece enzimi che naturalmente contengono alcuni batteri che lo difendono da
infezioni virali. Sono una sorta di forbice molecolare che ci consente sia di tagliare dal DNA il gene di
interesse sia di tagliare il plasmide. L’enzima di restrizione taglia nel punto del DNA che contiene sequenze
palindrome (parola che può essere letta allo stesso modo da destra a sinistra o viceversa, quindi sequenze che
possono essere lette allo stesso modo dall’estremità 3’ a 5’ e viceversa).
In corrispondenza delle sequenze palindrome, l’enzima di restrizione può tagliare in 2 modi:

 Taglio blunt ent: lascia 2 estremità della stessa lunghezza

 Taglio sticky ends: taglio con filamenti sfalsati che rende più facile l’appaiamento del gene di
interesse e lascia 2 estremità più appiccicose
Prima di tutto frammento il DNA, tagliandolo con gli enzimi di restrizione, per ottenere il pezzetto che mi
interessa e lo metto in presenza dei plasmidi. Poi può avvenire che o il batterio incorpora il suo plasmide e
non ha il gene di interesse o incorpora il plasmide con il gene di interesse. Come faccio a sapere quali batteri
hanno incorporato il plasmide più il gene di interesse? Mi viene in aiuto la selezione dei batteri in terreni
contenenti antibiotico, perché sicuramente l’inserimento del gene di interesse avrà danneggiato il gene
l’antibiotico resistenza. Supponiamo che l’inserimento del gene di interesse ha danneggiato il gene
dell’antibiotico resistenza all’ampicillina (è un tipo di antibiotico): che cazzo faccio?
Prendo un po’ di queste colonie batteriche, ne vado a segnare la posizione, le faccio crescere in ampicillina e
vedo che muoiono. Allora vuol dire che queste colonie sono quelle che hanno il gene di interesse, allora le
prendo e le faccio crescere in un terreno normale. È chiaro che mentre stanno duplicando il loro DNA e il
loro plasmide, stanno duplicando anche il gene di interesse che mi serve. Dunque dopo che ho fatto crescere
queste cellule, le recupero, frammento il DNA del gene di interesse, separo questi DNA con l’elettroforesi su
gel e vado a recuperare il DNA del gene di interesse ormai sarà stato amplificato in migliaia di copie.

Clonazione
Non confondiamo il clonaggio con la clonazione:

 Per clonaggio intendiamo la duplicazione ripetuta di un gene di interesse all’interno di un vettore.

 Per clonazione di intende la copia di un intero individuo ottenuto senza la duplicazione
Il nuovo individuo non viene ottenuto dall’unione di un gamete femminile e maschile.
Nel caso di Dolly sono state coinvolte 3 tipologie di pecore:
  Una pecora di colore scuro che voglio clonare, quindi di cui voglio avere la copia identica di tutto il
materiale genetico non solo una somiglianza esteriore.
 Una pecora donatrice di cellule uovo
 Una pecora che è la madre surrogata, nel cui utero avviene la gestazione
Dalla prima pecora da cellule nucleate io estraggo il nucleo diploide, ovvero che presenta 2 serie di
cromosomi omologhi. Dalla seconda pecora io prelevo dalle cellule uovo il nucleo aploide e vado ad
impiantare il nucleo diploide, così avvio le divisioni. In questo momento questa cellula, pur non essendo
prodotto della fecondazione, è uno zigote. Prendo allora questo zigote che ha iniziato a dividersi e lo vado ad
impiantare nell’utero della terza pecora, la quale alla fine partorirà una pecora identica alla prima. Gli
studiosi hanno usato queste 3 pecore per capire realmente se la pecora che sarà fecondata sarà uguale alla
prima. Da questa fecondazione si è capito che queste clonazioni hanno un invecchiamento precoce, cioè tutte
le malattie si manifestavano precocemente. Infatti, ogni essere che si produce in modo sessuato è diverso
dagli altri perché ad esempio nel nostro DNA noi siamo diversi per resistenza o suscettibilità alle malattie.
Tuttavia, se ognuno di noi fosse resistente ad un sacco di malattie ma suscettibile ad un solo virus, e questo
virus piombasse nell’ambiente esterno ed entrasse dentro di noi, comunque ci porterebbe ad estinguerci.