LE TECNICHE DI SEPARAZIONE

Essendo oggi a conoscenza delle tecniche per farlo, se so che io ho un gene

“malato, mutato” - per esempio il BRCA2 il quale può far venire una serie di
tumore al seno - posso applicare tecniche di editing genomico che si stanno
ancora sperimentando. In che cosa consistono? Prendo una forbice molecolare
(enzimi di restrizioni all’interno della molecola di Dna), entro nella mia cellula e
vado a sostituire quel pezzo di filamento mutato—>tecnica è recentissima,
animalisti non sono d’accordo con le seguenti tecniche in quanto vengono
fatte dal vivo e dunque sugli animali:
1. pcr;
2. applicazione a editing genomico; BRCA2
3. clonazione CRISPR;
4. biotecnologie mediche in agricoltura e ambientali: tra le più semplici, applicate per ridurre
drasticamente l’uso di insetticidi e di erbicidi.

LA PCR (Polymerase Chain Reaction)-pg.b141,142

Sappiamo che il Dna è una molecola a doppia strand circolare chiusa che porta l’informazione
genetica: è una molecola che può essere amplificata, basta essere a conoscenza della sequenza
che possiamo trovare nelle banche dati, perché il genoma umano è stato tutto sequenziato—>
conosco la sequenza e lo voglio amplificare, cioè da poche molecole anche con una singola,
dopo un certo numero di cicli di amplificazione, si ottengono 2^n molecole. Esiste un
apparecchio elettrico chiamato “termale cycler” (o termociclatore) che compie dei giri di
temperatura con all’interno una provetta—>posso programmare le temperature e il tempo in cui
la provetta sarà contenuta nelle apparecchiature. Quindi nella provetta sono presenti:
- Il Dna;
- I mattoni di Dna, i dNTP (deossinucleotiditrifosfato);
- Un’enzima che permetta loro di unirsi, di accoppiarsi insieme, che faccia i legami estere tra i
nucleotidi—>una Dna polimerasi non qualsiasi, in questo caso la Taq polimerasi in quanto
estratta dal batterio Thermus aquaticus, un batterio che sa vivere quasi a 100°; questo significa
che la Dna polimerasi non si denatura ad alte temperature, ha una struttura proteica secondaria,
terziaria complicata che qui appare instabile;
- Inserisco sali che determinano l’astringenza;
- I primer: sappiamo che l’aggiunta di un nucleotidi avviene in 3’—OH e, per dare un innesco,
aggiungo il primer 1 (si attacca ad un filamento) e il primer 2 (si attacca al filamento opposto).

DNA dNTP Dna polimerasi sali primer 1 e primer 2

Messo tutto in provetta, inserisco quest’ultima nel termociclatore—>abbiamo tre fasi:

1. Denaturazione: il termociclatore porta la provetta a 95°, momento in cui si denatura il Dna
perché noi stiamo lavorando in provetta e non nella cellula, determinando così la temperatura
(alzo la temperatura e i due filamenti si separano poi, durante la separazione, vengono a contatto
con il primer 1 e primer 2 per far si che non si vengano a formare legami a idrogeno tra i primer);
2. Appaiamento (annealing): adesso si fa abbassare la temperatura a circa 50°-65° per far si che i
primer+filamenti denaturati si appaiano—>i 2 primer vengono sintetizzati, ma in senso opposto;
3. Allungamento (elongation): a 68°-72° la Taq polimerasi comincia ad amplificare, e qui si ha la
sintesi dell’altro filamento.

Denaturazione Appaiamento Allungamento

Alla fine del ciclo, partendo da una molecola per un certo numero di cicli, in generale ottengo
2^n per ogni molecola. La Pcr viene utilizzata per molte cose (ad esempio per il papilloma virus):
se è presente il genoma del virus e dò ad esso i primer giusti, quei primer riconoscono solo il
genoma del virus, gli dò tutti gli ingredienti e se c’è viene amplificato=sintetizzato (abbiamo la
certezza con la Pcr), (altro esempio: scena del delitto, prendo materiale biologico, decidiamo
quale sequenza da controllare, amplificata tale sequenza, viene digerita con enzima di restrizione
e si ottiene un pattern, poi vado a vedere chi corrisponde alla sequenza presa in esame).

METODO DI SEQUENZIAMENTO DI SANGER-pg.b144,145

Altra tecnica fondamentale è la tecnica di sequenziamento di Sanger: questa tecnica del

sequenziamento del Dna è una tecnica molto antica che non si usa più. Voglio amplificare il dna,
costruisco il primer, vado in banca dati: c’è una branca della biologia molecolare, ovvero la “bio-
informatica” che mi dice come devo costruire questo primer, a che temperatura lo devo usare,
che ciclo di Pcr devo fare, ecc—>questo è possibile perché è stato sequenziato il genoma. Noi
abbiamo 20.000 geni di cui solo il 2% del nostro Dna viene codificato(=a una determinata
sequenza, corrisponde una determinata proteina). Come è stato sequenziato? Le tecniche di
separazione di sequenziamento nel tempo sono cambiate: quella più versatile che poi è stata
adottata e potenziata è la tecnica di Sanger. Partiamo dal fatto che non siamo a conoscenza della
sequenza del Dna: lo vado a mettere in incubazione, metto un primer casuale che va ad appaiare
e poi la dna polimerasi incomincia ad appaiare. A un certo punto faccio quattro provette diverse
e, in ogni provetta, metto un terminatore diverso: nella 1° metto un ddATP, 2°ddCTP, 3°ddGTP,
4°ddTTP—>d=deossinucleotidetrifostato, mentre dd=dideossinuclotidetrifosfato, ciò vuol dire
che questa’ultimo non ha il 3’—OH per l’innesco. Quindi nel momento in cui viene inserito
nell’allungamento di una catena, viene inserito il ddATP e quella sequenza terminerà con A,
perché gli altri non si riescono ad inserire. In conclusione questa tecnica ha permesso, attraverso
l’elettroforesi cycler blotting, quindi elettroforesi su gel di poliaceilammide e non più gel di

agarosio, di ottenere dei frammenti che terminano tutti con A nella 1°provetta, C nella 2°, G nella
3°, T nella 4°.

NEXT GENERATION SEQUENCING

La next generation sequencing è una tecnica di separazione attraverso cui, grazie a questa
tecnologia avanzata che sfrutta il metodo di sequenziamento di Sanger, è stato possibile
sequenziale tutto il dna (con macchine, no + gel).