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REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

( PCR =Polymerase Chain Reaction)



Verso la met degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un
metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantit
illimitata di copie della sequenza di un singolo gene. Questo metodo,
chiamato PCR, in grado di copiare sequenze di DNA che sono inizialmente
presenti in quantit estremamente basse. Lunica condizione che si
conosca, almeno in parte, la sequenza nucleotidica del gene che deve
essere copiato.
Con la PCR le 2 catene di un campione di DNA vengono separate ed
incubate con la DNA Polimerasi (Taq Polimerasi, da Thermus acquaticus,
stabile al calore), dNTP e 2 Primer oligonucleotidici le cui sequenze sono
complementari a quelle fiancheggiatrici del campione in esame.
I primer, a partire dai quali la DNA Pol. inizia a sintetizzare le catene
complementari, delimitano il frammento di DNA che deve essere studiato
(DNA bersaglio).
Ogni ciclo di questo processo raddoppia la quantit di DNA bersaglio e
quindi, anche partendo da ununica copia di DNA, si ottiene
unamplificazione geometrica.
In Figura sono illustrate le varie fasi del processo.

La reazione utilizza la ripetizione di tre fasi che si svolgono a diverse temperature :

fase 1) DENATURAZIONE: la sequenza di DNA stampo viene denaturata al calore
mediante incubazione a 94 C al fine di ottenere la separazione delle catene . La
fase dura 1-2 minuti

fase 2) IBRIDAZIONE: in seguito al raffreddamento, i primers (o inneschi) si legano
alle rispettive sequenze complementari sulle catene singole di DNA bersaglio. Questa
fase viene eseguita per 1-2 minuti ad una temperatura inferiore alla temperatura di
denaturazione DNA stampo- Primer. La temperatura di ibridazione viene scelta quindi
in base alla sequenza dei primers e si calcola mediante lapplicazione di questa formula
empirica:
T= 2X(A+T) + 4 X (G+C)
dove A, T, C, G, indicano il numero dei nucleotidi presenti nel primer

fase 3) ESTENSIONE: la DNA polimerasi utilizza i dNTPs, presenti nella miscela di
reazione, per allungare i primers ibridati usando come stampo la singola catena di DNA
bersaglio. In questo modo avviene la sintesi della catena complementare. Per
l'estensione viene utilizzata una temperatura di 72 C (temperatura ottimale per
lattivit enzimatica) per 1-3 minuti

La PCR viene realizzata utilizzando uno strumento chiamato termociclatore: questo
strumento, opportunamente programmato, passa da una fase allaltra modificando la
temperatura della miscela dincubazione presente allinterno della microprovetta.
Pertanto, finito un primo ciclo di denaturazione , ibridazione ed estensione, lo
strumento riporta la temperatura a 94C per denaturare i frammenti appena formati
e ripete il ciclo per un numero variabile di volte (in genere da 25 a 40)
Venti cicli di PCR aumentano di circa 1 milione di volte (2
20
) la sequenza bersaglio
con grande precisione ed efficienza



Obiettivo della esercitazione:




Verificare la eventuale presenza soia OGM a
partire dai campioni di DNA estratto




Procedimento per lamplificazione del DNA di soia
estratto il 3/04/2008 e del DNA OGM



CONCENTRAZIONE DEI COMPONENTI NELLA MISCELA
PRESENTI NEL KIT JUMP START Accu Taq LA DNA
POLIMERASE Mix

Buffer 10 x : 20 mM Tris-HCl pH 7,5 + 100 mM KCl + 25 mM MgCl
2


dNTP : miscela dei 4 dNTP

primers: 20 M

Taq DNA polimerasi: 0,75 l = 1.2 Unit










PROCEDIMENTO


In una provetta da microcentrifuga pipettare nel seguente ordine (il
volume finale della miscela di reazione di 25 l)


1) H
2
O 10.7 l

2) Buffer 10 x 2,5 l

3) dNTP 0,5 l

4) primers OGM 0,5 l

5) primers PSII 0,5 l

6) DNA Soia 10l (~ 0.2 g)

7) Taq DNA polimerasi 0.3 l


PROCEDIMENTO amplificazione DNA SOIA OGM


In una provetta da microcentrifuga pipettare nel seguente ordine (il
volume finale della miscela di reazione di 25 l)


1) H
2
O 17.7 l

2) Buffer 10 x 2,5 l

3) dNTP 0,5 l

4) primers OGM 0,5 l

5) primers PSII 0,5 l

6) GMO-positive control DNA 3l (~ 0.2 g)

7) Taq DNA polimerasi 0.3 l




Pippettare allinterno della microprovetta PCR lopportuna quantit di H
2
O,
allinterno di una microspinco sterile
Continuare con laggiunta dei successivi reattivi, spippettando di volta in volta
al fine di miscelarli opportunamente.
RICORDARSI DI CAMBIARE IL PUNTALE DOPO AVER PIPETTATO
CIASCUN REATTIVO
Dopo aver aggiunto lenzima Taq Polimerasi, chiudere la microspinco e
picchiettare dolcemente il fondo
Centrifugare mediante lopzione short spin
Incubare in termociclatore col seguente file di amplificazione:


94C 2 95C 1 59C 1 72C 2 72C 10

40 cicli
















Per la realizzazione dellesperimento, dopo aver preparato i campioni, questi andranno
sistemati nel porta campioni del termociclatore. Quindi verranno attivati i vari cicli di
amplificazione, con le seguenti condizioni sperimentali :

fase 1) DENATURAZIONE: la sequenza di DNA stampo viene denaturata al calore
mediante incubazione a 94 C

fase 2) IBRIDAZIONE: in seguito al raffreddamento, i primers si legano alle
rispettive sequenze complementari sulle catene singole di DNA bersaglio. La
temperatura di ibridazione di 59 C (questa temperatura stata scelta in base
alla sequenza dei primers utilizzati per questa reazione)

fase 3) ESTENSIONE: la DNA polimerasi utilizza i dNTPs, presenti nella miscela di
reazione, per allungare i primers ibridati usando come stampo la singola catena di DNA
bersaglio. In questo modo avviene la sintesi della catena complementare. Per
l'estensione viene utilizzata una temperatura di 72 C

Si riporta la temperatura a 94C per denaturare i piccoli frammenti appena formati e
si ripete il ciclo (denaturazione per 40 volte)






Al termine della PCR (4 esercitazione), i prodotti di amplificazione (5 l) dovranno
essere controllati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide