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Relazione di Scienze Naturali

Cesare Andreatta 5UB

VERIFICA DELLA PRESENZA DI DNA GENETICAMENTE MODIFICATO ATTRAVERSO LA PCR

Premessa espositiva: Per organismo geneticamente modificato (OGM) si intende un organismo, diverso da
un essere umano, in cui il genoma (DNA) è stato modificato in un modo differente da quanto avviene in
natura, con ad esempio l’accoppiamento e la ricombinazione genetica naturale. L’applicazione delle
moderne biotecnologie permette di trasferire tratti di geni selezionati da un organismo all’altro, anche di
specie diverse, per esempio tra batteri e piante.

Gli OGM trovano applicazione soprattutto in ambito alimentare, agricolo, zootecnico e medico.
Per quanto riguarda l’ambito agricolo è ormai noto ad esempio che centinaia di milioni di ettari di terra
sono oggi coltivati nel mondo con piantagioni OGM (es. soia, mais, etc.) per rendere tali piante resistenti
all’irrorazione con potenti erbicidi (come il famoso glifosato che distrugge tutte le piante, indesiderate e
non).
Molte persone, specialmente in Europa, considerano gli OGM un potenziale pericolo per la salute e per
l’ambiente, in quanto la modificazione genetica di piante ad uso alimentare potrebbe comportare
l'introduzione nella catena alimentare di prodotti con potenziali effetti collaterali non del tutto prevedibili
sui consumatori e sugli ecosistemi circostanti alle piantagioni.

Descrizione dell’esperienza: Attraverso l’utilizzo della tecnica PCR si intende scoprire se all’interno del DNA
oggetto dell’esperimento si trova o meno un gene esogeno, che nel caso fosse presente, indicherebbe che
si tratta di un OGM.

Materiali:

 Micropipetta (con taratura da 0,1 µlitri a 30 µl o simile)


 Puntali per Micropipette (sterili)
 Guanti
 Tubi per PCR
 2 Tubi per PCR contenenti i primer (forward e revers) per l’amplificazione del transgene
Glifotransferasi e l’amplificazione del gene di controllo Amido Sintasi
 24µl di PCR Mix (buffer, mix di DesossiriboNucleotidi Trifosfati, Taq Polimerasi e MgCl)
 8 µl di DNA (di mais)
 8 µl di ddH2O (acqua distillata)
 Centrifuga da laboratorio
 Termociclatore
 Vaschetta per Elettroforesi in gel
 Pettine
 Bilancia
 Beuta da 250 ml
 3g di agarosio
 3ml di buffer TAE 50x
 147 ml di acqua distillata
 Microonde
 5µl di colorante per DNA
 Buffer TAE 1x
 Transilluminatore a luci UV
Svolgimento: Per andare a svolgere la PCR, iniziamo innanzitutto a preparare il contenuto dei tubi per PCR
che andranno inseriti poi nel termociclatore.

Suddividiamo i tubi per nome, in modo tale da non confondere il loro contenuto ed essere più efficaci.
I due tubi contenenti cada uno i 4 µl di primer (Forward e Revers) sono divisi in un tubo T, contenente i
primer per l’amplificazione di un eventuale transgene Glifosatoacetiltransferasi T, e in un tubo S,
contenente i primer per l’amplificazione del gene di controllo Amido Sintasi.

Prepariamo altri tre tubi, che chiameremo A, B e C contenenti rispettivamente il Mix per PCR, il DNA di mais
e acqua distillata. Questi tre tubi devono essere precedentemente conservati ad una temperatura di circa
-20 gradi Celsius.
Estraiamo i tubi A, B e C dal freezer.
Prima di iniziare ad aggiungere i vari componenti, indossiamo i guanti e rileghiamo eventuali capelli lunghi
per evitare che la punta della micropipetta o il composto vengano contaminati da agenti esterni provenienti
dal nostro corpo.
Prendiamo la micropipetta, e impostiamo la capacità a 12 µl. Con un semplice movimento che non
necessita di troppa forza, inseriamo la punta della pipetta all’interno di uno dei puntali di cui disponiamo.

Ovviamente a questo punto il tubo T e quello S devono già essere aperti.


Degli altri tre tubi apriamo inizialmente solo il tubo A, contente il Mix per PCR.
Con la micropipetta equipaggiata dal puntale, andiamo a prelevare 12 µl del contenuto, prestando
attenzione a tenere premuta la micropipetta quando vado a estrarre il liquido dal tubo A, rilasciando poi
gradualmente e delicatamente la micropipetta per fare in modo venga raccolta la quantità giusta. Estratta
con attenzione la micropipetta, la avviciniamo al tubo T e inseriamo delicatamente la punta fino a toccare il
fondo del tubo, a questo punto premiamo la micropipetta fino in fondo, in modo da inserire nel composto
tutto il contenuto.
Eseguito questo passo, rilasciamo con l’apposito pulsante il puntale, e andiamo a sostituirlo con uno nuovo.
Ripetiamo lo stesso passaggio con le stesse quantità per il tubo S.
Ripeteremo poi lo stesso procedimento con il contenuto del tubo B e C, per entrambi i tubi T e S.
Per il contenuto di B e C è pero importante cambiare la quantità che verrà assorbita nella micropipetta,
infatti la dovremo cambiare da 12 a 4 µl.
Eseguito i passaggi con la micropipetta (per sei volte in totale, tre per tubo T e tre per tubo S), tenendo a
mente di cambiare puntuale ogni volta che si riesegue il passaggio e le quantità giuste per ogni
componente, abbiamo ora i nostri due preparati quasi pronti per essere inseriti nel termociclatore.

Per ottenere una miscela più omogenea e concentrare il tutto il più possibile sul fondo dei tubi, mettiamo
questi in una piccola centrifuga da laboratorio. Inseriti i tubi e fatti girare per qualche momento, possiamo
estrarli e immetterli nel termociclatore: lo strumento più importante per l’esecuzione della PCR.
Andiamo ad inserire i nostri tubi appena usciti dalla centrifuga nel termociclatore, e impostiamo il
macchinario. Il termociclatore verrà impostato per 35 cicli, il che risulterà in una durata complessiva di circa
tre ore e mezzo.
Il termociclatore, attraverso diversi cambi di temperatura, permetterà alle sequenze targhet dei geni di
essere amplificati per un numero di volte che equivale circa a 2 elevato alla trentacinquesima.
I cicli del macchinario inizieranno con elevazione rapida della temperatura a 95 gradi. Verrà mantenuta
questa temperatura per 8 minuti. Queste temperature faranno avvenire la denaturazione della doppia elica
del DNA, che verrà srotolata e i cui legami fosfodiesterici tra le basi azotate si romperanno.
Successivamente la temperatura di abbasserà a 51 gradi per 30 secondi. In questo breve lasso di tempo
avverrà il cosidetto annidamento, dove i primer forward e revers si andranno a legare con le specifiche
sequenze promotrici per fare in modo che la DNA Polimerasi possa iniziare il suo lavoro.
A questo punto la temperatura all’interno del termociclatore verrà nuovamente alzata, a 72 gradi, per
permettere alla Dna Polimerasi (ricordiamo che stiamo parlando della Taq Polimerasi, che è in grado di
resistere e eseguire la sua funzione anche a temperature molto elevate come quelle che vengono raggiunte
all’interno del termociclatore) di iniziare l’allungamento, ovvero di partire dai primers e iniziare la
replicazione delle sequenze targhet utilizzando i nucleotidi presenti nel composto. Come per
l’annidamento, l’allungamento dura 30 secondi. Queste tre fasi compongono un ciclo, che si andrà a
ripetere per 35 volte complessivamente. Nei cicli successivi al primo però, segnaliamo il fatto che la
denaturazione a 95 gradi andrà a durare 30 secondi esattamente come le altre fasi.
Nell’ultima estensione però, il termociclatore manterrà la temperatura a 72 gradi per 3 minuti anziché 30
secondi.

Durante le tre ore e mezza di durata della PCR, possiamo iniziare a preparare la vaschetta per l’Elettroforesi
che verrà eseguita successivamente.
Prendiamo quindi la vaschetta per il gel, rigorosamente vuota e pulita, dove andremo ad inserire il pettine,
un pezzo che ci servirà per la creazione dei pozzetti dove andremo successivamente ad inserire le miscele
estratte dal termociclatore.
Andremo ora a preparare il gel d’ agarosio, necessario per l’elettroforesi in quanto filtro dove andremo ad
analizzare la quantità di bp (pair bases, coppie di basi) che andranno a spostarsi a causa dell’intervento
delle cariche all’interno della vaschetta elettroforetica,
Prendiamo quindi 3g di agarosio, 3 ml di Buffer TAE 50x e i 147 ml di acqua distillata.
All’interno della beuta da 250 ml andremo a immettere l’agarosio (pesato con la piccola bilancia), grazie alla
“barchette”, piccoli contenitori dalla forma funzionale al trasporto di piccole quantità di materiale.
Andremo quindi ad inserire l’acqua e il buffer (che ha la funzione di eliminare gli ioni che erano presenti nel
mix, utili per il lavoro della Taq Polimerasi ma che poi non serviranno più a nulla). Notiamo che il buffer è da
diluirsi per ogni 1 ml in 150 ml di acqua distillata. Andremo quindi a mescolare la miscela con dei piccoli
gesti del polso, dopo di che andremo ad inserirlo nel microonde. Mantenendo una temperatura non troppo
elevata andremo quindi a riscaldare la miscela fino al suo punto di ebollizione (circa 100 gradi). Una volta
che la miscela inizia a bollire, la estraiamo dal microonde. Se la miscela non ha un colorito biancastro,
possiamo reinserirlo nel microonde per alcuni secondi. Abbiamo quindi ottenuto una miscela nella beuta di
colore bianco, che andremo a versare nella precedentemente preparata vaschetta per il gel (corredata di
pettine). A questo punto andremo ad inserirla in un freezer per far sì che il gel si solidifichi.

Al termine dei 35 cicli del termociclatore, andremo a estrarre i tubi T e i tubi S.


Ora al loro interno avremo migliaia di copie delle sequenze targhet.
Estraiamo pure il gel, che dopo un lasso di tempo superiore ad un’ora si è solidificato, aderendo
perfettamente alla forma della vaschetta.
Possiamo quindi andare ad estrarre senza movimenti bruschi il gel dal pettine, che ha lasciato nel gel dei
piccoli fori che chiamiamo pozzetti.
A questo punto inseriamo la vaschetta elettroforetica nella cella eletttroforetica. All’interno di questa
inseriamo il buffer TAE x1, che essendo già diluito non ha bisogno di correzioni. Sempre con attenzione
versiamo il buffer, fino ad arrivare a coprire il gel di qualche centimetro.
La vaschetta elettroforetica può essere ora attaccata ad una fonte di corrente di 125V, in modo da attivare
già i due elettrodi, che serviranno nella corsa elettroforetica.

Tornando ai tubi T ed S, prima di inserire il loro contenuto nei pozzetti, aggiungeremo 5µl di colorante per
DNA, contenuto in un tubo con nomenclatura D. Questo speciale colorante ci permetterà di visualizzare i
risultati della corsa elettroforetica, in quanto ci permetterà di visualizzare gli spostamenti dei DNA
all’interno del gel, sotto i raggi UV del transilluminatore.

Con i tubi T e S carichi del colorante, andiamo a sottoporli a qualche ciclo con la centrifuga,
sempre per concentrare di più il tutto.

Estratti dalla centrifuga, è arrivato il momento di inserire il DNA nei pozzetti con la micropipetta.
Sempre corredata dell’apposito puntale, impostiamo la micropipetta a 30 µl.
Andremo ad estrarre il contenuto del tubo S con la micropipetta, tenendo presente l’attenzione con cui si
deve estrarre il contenuto per non andare a perderlo. Una volta estratto il contenuto dal tubo, andremo a
immetterlo nel primo pozzetto. Questo passaggio è molto importante ed è da eseguire con estrema
delicatezza. Inseriamo la punta della micropipetta nel gel, e raggiungendo delicatamente la fine del
pozzetto, andremo a rilasciare lentamente il contenuto. Facendo molta cautela quando estraiamo la punta
della micropipetta, tenendo la levetta della micropipetta premuta, la togliamo dal gel evitando che la
miscela si espanda nel buffer.
A questo punto, una volta eseguito lo stesso procedimento anche per il contenuto del tubo T, andremo a
mettere la cella per l’elettroforesi sotti il transilluminatore, che attraverso i raggi UV renderà più visibili le
varie frazioni di Dna che si spostano all’interno del gel. Assistiamo alla corsa elettroforetica, ovvero allo
spostamento del Dna all’interno del gel; lo spostamento è causato dal fatto che il Dna possiede come
caratteristica naturale quella di avere una carica negativa. Ponendo alle spalle dei pozzetti, dove è
contenuta la nostra miscela, un elettrodo con carina negativa e di fronte uno con carica negativa, il Dna si
sposta verso il polo positivo, spinto dalla repulsione verso la carica negativa e l’attrazione verso la carica
positiva.

Risultati: Il Dna inizia a muoversi all’interno del gel, è possibile osservare che si creano varie fasce,
corrispondenti a frazioni di Dna che hanno lo stesso numero di bp. Le frazioni che posseggono meno bp, e
quindi le più leggere, si muovono più velocemente e quindi riescono ad arrivare più lontano (ovvero più
vicine all’elettrodo di polo positivo).
Andiamo quindi a verificare se per i due campioni abbiamo avuto i risultati sperati.
A causa di un incidente dove il puntale è scivolato dalla punta della micropipetta, dal pozzetto contente il
gene di controllo non abbiamo i risultati sperati, gran parte si è dispersa nel buffer e quindi soltanto
pochissime basi si sono spostate dal pozzetto. Per il tubo S la verifica è fallita.
Per il tubo T invece i risultati sono quelli sperati. Le frazioni di Dna si muovono nel gel e possiamo notare le
varie fasce crearsi. Attraverso una comparazione con un righello molecolare (marker ladder), possiamo
stabilire che il Dna che abbiamo preso in esame è un OGM, in quanto una delle fasce arriva all’indicatore
tra i 600 e i 700 bp, che sta ad indicare il fatto che il transgene glifosatoacetiltransferasi è presente ed è
stato amplificato.

Si considera molto importante l’attenzione e la precisione con cui si vanno ad eseguire i vari procedimenti,
perché anche il minimo errore può portare ad una conclusione indesiderata dell’esperimento.
Il dosaggio e la pazienza con cui si vanno a creare le varie miscele è un’altra fondamentale parte della
sperimentazione.
Discussione: Esistono poche e molto specifiche tecniche alternative alla PCR per l’amplificazione dei geni,
un esempio è la LAMP.

La Loop-mediated isothermal amplification è un metodo molto simile alla PCR ma che ha la caratteristica di
essere molto meno costosa, in quanto non necessita macchinari come il termociclatore. Questa infatti
tecnica mantiene la miscela di Dna a una temperatura stabile, tra i 60 e i 65 gradi centrigradi. Inoltre la
LAMP riesce ad amplificare le sequenze di Dna in un lasso di tempo notevolmente inferiore
La LAMP è ancora in via di sperimentazione, ma ha acquistato comunque grande valenza perché è un
metodo molto efficace, utilizzato per l’individuazione di alcune malattie come la malaria o la tubercolosi.

La NASBA o meglio "Nucleic Acid Sequence Based Amplification", ossia "amplificazione basata su una
sequenza di acidi nucleici" è un altro metodo che permette tramite l’utilizzo dell’Rna di amplificare delle
sequenze specifiche di Dna. Questa però non riesce a raggiungere il di specificità della PCR, dato che la DNA
Polimerasi che viene sfruttata è messa a operare a temperature intorno ai 41 gradi, e quindi lavora in
un’ambiente molto meno appropriato rispetto ai 75 gradi della PCR.

Anche la ”Self-sustained sequence replication” anche detta 3SR utilizza l’Rna e lo amplifica in modo
isotermico utilizzando temperature simili a quelle usate nella Nasba, per questo mantiene lo stesso
problema legato alla scarsa specificità.

Altre tecniche famose e ancora molto usate come la SDA, la MDA e la RCP, utilizzano metodologia e
materiali simili se non praticamente identici alla PCR, ma spesso queste tecniche alternative non riescono a
emulare gli stessi risultati della più famosa e affidabile “polymeraze chain reaction”.

Oltre alla difficoltà nel distinguere i prodotti OGMda quelli non, con il necessario ricorso alla verifica del Dna
(con metodi come la PCR), possiamo trovare un'altra serie di motivi per il quale l’utilizzo e la creazione degli
OGM porti ad una serie più ampia di problematiche rispetto a benefici.
Il dibattito OGM sì/OGM no, si prolunga da molti anni (circa dagli anni 90’ in Europa), in ambito
internazionale, europeo ma soprattutto nella realtà italiana.

Il dibattito principale si basa sui rischi che questi prodotti potrebbero comportare sia a livello ambientale sia
direttamente sulla salute dei consumatori.
Per quanto riguarda l’ambiente uno dei temi più discussi è quello della scarsa conoscenza di quanto queste
specie modificate geneticamente possano essere invasive rispetto a quelle tradizionali, cosa che potrebbe
portare, secondo quanti appoggiano la tesi del NO OGM, a delle vere catastrofi ambientali mettendo a
rischio interi ecosistemi, rovinando così fattori ambientali importarti come la biodiversità.
Una delle accuse che più si muove alle piantagioni OGM è quella relativa all'inquinamento del naturale
sistema d'impollinazione. Il forte rischio in questo caso è dovuto al non isolamento delle coltivazioni
modificate geneticamente e quindi al sicuro espandersi delle loro specifiche caratteristiche anche alle
piantagioni vicine attraverso la classica impollinazione.

Organizzazioni come Coldiretti, in Italia, cercano di arginare in tutti i modi la possibilità che nella Penisola
possano venire legalizzate colture OGM, che se implementate, a seguito di quanto scritto sopra ad
esempio, potrebbero in pochi anni far scomparire la enorme vastità di prodotti tipici italiani, che sono
riconosciuti a livello internazionale per la loro unicità.
L’Italia è infatti l’unico Paese al mondo con 5155 prodotti alimentari tradizionali censiti, 297 specialità
Dop/Igp riconosciute a livello comunitario e 415 vini Doc/Docg, ma è anche leader in Europa con quasi
60mila aziende agricole biologiche e ha fatto la scelta di vietare la carne agli ormoni e le coltivazioni Ogm e
a tutela dei primati nazionali della biodiversità.
Si può dire quindi che dato che successo dell’agricoltura italiana sta nella sostenibilità, nella straordinaria
qualità con caratteri distintivi e unici, e in una varietà e un’articolazione sul territorio che non hanno uguali
al mondo, è normale e quasi logico che si cerchi di spingere per il mantenimento fuori dall’Italia di prodotti
OGM, che andrebbero a modificare completamente il mercato agricolo.

Se almeno in campo agricolo l’esistenza degli Ogm sembra rappresentare una causa di discussione più che
un fattore che porti al progresso, non si può dire lo stesso del suo utilizzo in ambito medico. Gli organismi
geneticamente modificati hanno in realtà anche un ruolo fondamentale, sebbene non riconosciuto, nel
garantire il nostro benessere: sono infatti alla base della produzione di molti vaccini e farmaci che salvano
vite umane. Tuttavia, la sperimentazione degli OGM in Italia e in Europa è in molti casi regolata dalle stesse
leggi che regolano la ricerca sugli OGM in campo alimentare, costringendoci a volte ad acquistare
dall’estero farmaci ottenuti sulla base di studi effettuati da scienziati italiani mai completati, con un danno
per la ricerca e l’economia del nostro paese molto alto.
Non si può certo dimenticare che grazie alla coltura di batteri considerati ONG ora possiamo disporre di
materiale medico come l’insulina che viene direttamente prodotta in laboratorio e deve essere più estratta
dai maiali, da cui si aveva il rischio di contrarre malattie.

Perciò per gli OGM utilizzati in ambito prettamente medico, si dovrebbe cercare in ambito legislativo di fare
una distinzione netta rispetto agli OGM utilizzati in ambito agricolo o zootecnico.

Conclusione: Il mondo che ci circonda è ormai pieni di nuovi aspetti che devono essere verificati, come ad
esempio la possibilità di trovarci di fronte ad una tipologia di mais geneticamente modificato o meno.
Il mondo scientifico ha ora a disposizione una serie di strumenti e metodi per aiutarci a verificare questi
aspetti del reale. La PCR è sicuramente uno di questi, è molto valida, precisa, e specifica, inoltre richiede
pochissimo materiale per poter essere effettuata e questo la rende ancora più valida come scelta per una
eventuale analisi riguardante il DNA.
Nonostante nel nostro esperimento l’elettroforesi del gene di controllo non abbia aiutato la verifica della
ricerca, siamo riusciti a capire comunque che il nostro campione di Dna era effettivamente un OGM, dato il
fatto che avevamo comunque la sicurezza che i risultati dell’elettroforesi sarebbero stati certi e validi.
Probabilmente con un po’ più di attenzione saremmo giunti alla conclusione che il nostro campione di DNA
era sia valido, e quindi la PCR era riuscita senza intoppi, sia un OGM dato la creazione della fascia tra i 600 e
i 700 bp.

Fonti: http://www.salute.gov.it/portale/temi/p2_6.jsp?
lingua=italiano&id=1180&area=sicurezzaAlimentare&menu=ogm

https://www.efsa.europa.eu/it/topics/topic/gmo

https://www.greatitalianfoodtrade.it

https://www.wikiversity.org/

https://en.wikipedia.org/wiki/Loop-mediated_isothermal_amplification

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9387935
https://academic.oup.com/nar/article/28/12/e63/2359194

http://www.earthday.it/Alimentazione-sostenibile/Storie/Ogm-si-Ogm-no-pro-e-contro-degli-organismi-
geneticamente-modificati

http://www.today.it/green/life/organismi-geneticamente-modificati-pro-contro.html

https://www.coldiretti.it/ambiente-e-sviluppo-sostenibile/ogm-con-8-semine-e-flop-nella-ue-coltivati-in-1-
paesi-su-28

https://www.coldiretti.it/ambiente-e-sviluppo-sostenibile/59-degli-italiani-lambiente-crea-lavoro

https://www.terranuova.it/Il-Mensile/Nbt-i-nuovi-Ogm-alle-porte-dell-Europa

https://www.terranuova.it/News/Agricoltura/Partita-la-Campagna-Stop-Pesticidi-L-agroecologia-e-la-
strada

https://ilfattoalimentare.it/ogm-nbt-leggi.html

https://eur-lex.europa.eu/resource.html?uri=cellar:303dd4fa-07a8-4d20-86a8-
0baaf0518d22.0008.02/DOC_1&format=PDF