UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA

CALIFORNIA
FACULTAD DE CIENCIAS

Electroforesis en gel de agarosa como método de comprobación de

transformación de células competentes con proteínas fluorescentes

Alumnos:
-Xavier Moreno Meza
-Jack Pineda Fuentes
-Josué Ulbrich Escudero
-Sebastián José Soto Badilla
Grupo: 50

Dr. Manuel Alejandro Carballo

Materia: Biotecnología

30 de noviembre de 2022
Introducción:
Los recientes sucesos pandémicos han tenido una gran repercusión en los distintos sectores de la
humanidad, mismos que han favorecido y acelerado el desarrollo de las herramientas
biotecnológicas. Hoy en día es muy común escuchar términos como PCR, producción de
anticuerpos, proteínas, transformación o diagnósticos clínicos que anteriormente eran muy
desconocidos. Las biotecnología y la ingeniería genética han dado un paso a la solución de
muchos problemas por medio de estas técnicas tecnológicas y aplicándolas a organismos vivos.
Una de estas herramientas es la transformación bacteriana, que como su nombre lo indica es
producir cultivos bacterianos con la capacidad de replicar plásmidos ajenos a la bacteria. Este
proceso es mas complejo de lo que se escucha, se toman ciertas bacterias (estas reciben el
nombre de Competentes) se le incorpora ADN exógeno por medio de plásmidos que provienen
de otras bacterias o son creados in vitro y la bacteria competente tendrá la capacidad de
replicarla (Betancor, 2008). Se le llama competente a la capacidad de captar ADN extraño,
mantenerlo estable e interaccionar con él, este fenómeno dependerá de la presencia de un sistema
de captación de ADN específico que estará asociado a la membrana, es posible inducir esta
capacidad de captar ADN, ya sea por medio de distorsiones en la membrana celular
(electroporación) o por cambios en osmóticos y térmicos (Betancor, 2008). Los plásmidos son
moléculas circulares de ADN que varían de tamaño dependiendo del número de pares de bases,
contienen elementos extracromosómicos y tienen la capacidad de codificar hasta cientos de
proteínas. Los productos de sus genes le otorgan ventajas no ayuda en el crecimiento, los
plásmidos pueden otorgar la resistencia a ciertos tipos de medicamento, como a la penicilina y a
sus derivados. Estos elementos son parte de la evolución y adaptación de las bacterias ya que
fungen como mediadores en la conjugación (Loeza, 2004).
Gracias a los genes que hacen posible la transformación y con el conocimiento de los factores
moleculares que permiten la replicación , Los plásmidos pueden ser modificados para su uso
como vectores de clonación de amplio rango de hospedero o de expresión o como vectores
binarios (Loeza, 2004). En el laboratorio molecular las cepas bacterias de Escherichia coli son
las mas utilizadas debido a la gran información que tenemos existente, tambien son utilizadas
para múltiples actividades como propagación y conservación del ADN plasmídico de clones
hasta la creación de grandes librerías genéticas (Gomez, 2018). Uno de los métodos para
determinar si la transformación de nuestra bacteria fue exitosa y por lo tanto el gen de resistencia
a antibióticos se replicó, es añadir a nuestra cepa un gen que codifica para proteínas de diversos
colores fluorescentes, con esto se determina mediante criterios fenotípicos. Al haber adquirido el
plásmido que no tenía, se presentera un desarrollo morfocolonial fluorescente bajo la luz visible
en placas de agar debido a la expresión de los genes (en nuestro caso) (Pastelin, 2015).
Las endonucleasas son proteínas que rastrean secuencias específicas de ADN y cortan en esa
secuencia seleccionada. Las endonucleasas se clasifican en tres grupos: del I al III, grupo I y III
tienen la capacidad de cortar y metilar ADN, por otro lado el grupo II solo puede cortar ADN.
El método tradicional utiliza ADN ligasa y enzimas de restricción, (ambas se utilizan para la
inserción de genes y/o fragmentos de ADN en plásmidos) estas últimas se encargan de cortar los
sitios específicos del ADN, mientras que el ADN ligasa, une extremos siempre y cuando sean
complementarios, formando así una sola molécula de ADN.
En la siguiente práctica se desarrollaron diferentes técnicas biotecnológicas con el fin de lograr
una expresión de proteínas recombinantes de manera exitosa.

Objetivo
- Inducir transformación de células competentes para expresar proteínas fluorescentes
- Realizar una digestión enzimática y correrla en gel de agarosa

Materiales y metodología:
● Escalera casera:
Se elaboró una escalera casera de ADN en base a la metodología que desarrollaron Abassin y
colaboradores en 2015, en este artículo utilizaron los vectores Puc57 (GenScript) y Pet-21
(Novagen). Antes de llevar a cabo la replicación del PCR, se realizó un PCR bioinformático en la
plataforma Sequence Manipulation Suite, en el cual se tomaron los primers que utilizaron para
observar los fragmentos esperados. En nuestro caso, replicamos los fragmentos de 1200 (F3 y
R8), 2000 (F2 y R11) y 3000 (F6 y R9) y realizamos también una propuesta con diferentes
primers y vectores para ver si logramos ser mas exactos en los fragmentos esperados; Para 1200
utilizamos los mismos primers pero con los vectores pUC19, para el 2000 utilizamos pUC57 y
los primers F2-R11 y por último para los fragmentos de 3000 utilizamos F6-R9 y el vector pHis
(pET16b)
Para la replicación de PCR en el laboratorio, en un eppendorf añadimos 5 μl de buffer 10x a [1X
mm], 1 μl de nucleótidos de dNTPs (0.2 mm), 1.5 μl de Cloruro de magnesio (1.5 mm), 2.5 μl
del primer forward (0.5 mm), 2.5 μl de primer reverse (0.5 mm), 1 μl del templete ADN (10 ng),
0.3 μl de Taq polimerasa (1-25 U) y 26 μl de agua destilada, teniendo una solución de 50 μl.
Posteriormente lo colocamos 2 segundos el en vórtex para mezclar bien y 2 segundos en la
centrifugadora.
Posteriormente, los colocamos en el termociclador, los tiempos ajustados fueron los siguientes:
para el paso de desnaturalización la temperatura fue a 94°C durante 3 minutos, el siguiente paso
fue ajustarlo a 30 ciclos con una temperatura de 94 °C por 35 segundos, 55 °C a 30 segundos,
72°C por 120 segundos y 72°C por 10 minutos.
Se repitieron los mismos pasos para la propuesta, pero los primers y vectores anteriormente
mencionados.
● Electroforesis:
Para el gel de agarosa, se agregaron en una probeta 10 ml de buffer TAE, 90 ml de agua
destilada y 1 gr de agarosa, a donde luego se vertió en un matraz de 100 ml. En un microondas,
se calentó por 30 segundos y se calentó periódicamente por 10 segundos, dejando unos cuantos
segundos para enfriarse mientras se agitaba el matraz para evitar una reacción violenta hasta que
esta se disolvió completamente, dejando una mezcla traslúcida homogénea.
Una vez que se completó esto, la mezcla todavía cálida, se vertió en el molde y se le pusieron los
peines, en donde se dejó enfriar para que se solidifique el agar. Se tomaron 3 μl del PCR y se
mezclaron con un buffer de carga (0.5 μl), después añadimos la muestra con el buffer al pozo del
gel y se corrió una electroforesis a 100 voltios por 30 minutos.
● Transformar las células competentes:
Las células componentes SHuffle se retiraron del refrigerador, el cual estaba a -80°C, y se
colocaron en hielo de manera inmediata, dejándolas a una temperatura de alrededor 4°C. Luego
de haber hecho esto, se transfirió 50µl de células componentes a 3 tubos Eppendorf de forma que
quede un tubo por persona.
Se añadieron 2µl de ADN plasmídico junto con MRFP a dos de los tubos y al restante se le
añadió YFP y se dejaron en reposo en hielo por 30 minutos.
Las muestras fueron movidas del hielo a un termobloque a 42°C por 35 segundos y fueron
devueltas al hielo por otros dos minutos para inducir un choque térmico. Una vez pasado el
tiempo, se sacaron y se pusieron a temperatura ambiente a donde luego se les añadió 200µl de
LB agar.
La mezcla se dejó en incubación por 30 minutos a una temperatura de 37°C con agitación a 250
rpm y, posterior a eso, se transfirió 200µl de la solución de las células transformadas a cajas Petri
con medio LB de agar con Carbenicilina al 0.1M y se dispersó la muestra con uso de una asa.
Finalmente se preparó una caja con tres controles de células sin transformar, una caja con
plásmidos YFP y MRFP, y otra caja con MRFP y Tomato.
● Miniprep casero:
Se tomó 1.5µl de células transformadas a un tubo Eppendorf y se centrifugaron por 10 minutos a
4000 rpm a temperatura ambiente y, una vez concluído el tiempo de centrifugación, se decantó el
sobrenadante, al igual que resuspender el pellet que se formó en 100µl de la solución #1
(Glucosa 50 mM + Tris-HCL 25 mM + EDTA 10 mM + Rnase) junto con lisozima.
Se añadió 200µl de la solución #2 (NaOH 0.2m + SDS) y se mezcló por inversión un total de 6
veces, y se reposó por 10 minutos a temperatura ambiente. Luego de que transcurrieron los 10
minutos, se agregó 150µl de la solución #3 (3M KOAc acetato de potasio + Ácido acético
glacial) y se dejó en incubación en hielo por otros 10 minutos a donde luego se pasó a una
centrífuga refrigerada a 4°C a 12,000 rpm por 10 minutos.
En un tubo Eppendorf nuevo se agregó un aproximado de 50µl de sobrenadante junto con 300µl
de isopropanol y expresión y purificación proteica se dejó a temperatura ambiente por 5
minutos proseguido de una centrifugación a 12,000 rpm por 10 minutos, y se decantó el
sobrenadante, dejando el tubo abierto por un minuto para permitir que evapore el alcohol.
Finalmente se diluyó en 50µl de H2O.
Por último, se cuantificarón las muestras en el Spectrophotometer-Nanodrop: Se empieza
calibrando el Nanodrop seleccionando la opción para ácidos nucleicos, después se colocó 1.5 µl
de H2O en el pedestal para poder calibrarse, seguido se toma 1.5 µl de blanco-TE y se coloca en
el pedestal. Luego de esto se agregó 1.5µl de la muestra de cada persona en el pedestal. Una vez
completado esto, se midió y nombró el programa para poder identificar las muestras
individuales.
● Digestión enzimática:
En un tubo Eppendorf se añadieron 3µl del Buffer al 10x, 0.5µL de la enzima pRSET-B XBAI,
10 microlitros de nuestra muestra de ADN y 16.5 microlitros de agua destilada para completar
los 30 µl. Posteriormente se dejó incubando por 2 horas a temperatura ambiente. Se repitieron los
pasos para las Muestras SH-XA, JJ-YPF y SH-JUE respectivamente.

Resultados:
● Electroforesis de la ¨Escalera casera¨:
En comparación con la escalera, en el carril 3 se ve muy tenue pero se puede observar un poco,
se obtuvo un aproximado de 2.8 kb, en el carril 9 se obtuvo un aproximado de 1.5 kb, en el carril
10 se observa un doble bandeo, en 2.0 kb y en 2.5 kb. En el carril 11 se observa un 2.2 kb, en el
carril 13 2.0 kb, en el carril 14 no se observa banda y en el carril 19 se observa 1.9 kb.

Figura 1: Gel de agar de la escalera casera de ADN con el producto de PCR. Los carriles
numerados son los trabajados y el número debajo es el tamaño del fragmento que se
esperaba.
 ● Transformar las células competentes
Transformación de células competentes de E. coli con el plásmido mRFP exitosa.

Figura 2: Caja petri con medio de cultivo de células transformadas, elaborado con la
cepa SHuffle. En la caja petri se expresa con el plásmido mRFP.

● Resultado del Espectrofotómetro Nanodrop:

Figura 3. Gráfica de resultados de NanoDrop. Las concentraciones de ADN están expresadas en

microgramos por microlitro (μg/μL) . Las muestras JJ (1.39), SOTO (1.59), XA (1.57) y JUE
(1.87) corresponden a los integrantes del equipo y son resultado de la transformación con los
plásmidos que contienen los genes codificantes para YFP, mPlum y mRFP (XA y JUE)
respectivamente.

● Electroforesis de digestión enzimática:

Figura 4.- Gel 1: Resultado de la electroforesis de la digestión enzimática en gel de agarosa. En
el carril 1 se encuentra la escalera con fragmentos de 600 a 2800 pb, y en el carril 12 la escalera
2 con fragmentos de entre 300 y 2800 pb. Carril 3 y 11 producto del plásmido YFP con cepa
Shuffle

Figura 5.- Gel 2: Resultado de la electroforesis de la digestión enzimática en gel de agarosa. En

el carril 5 y 6 se observa el producto del plásmido mRFP en cepa Shuffle.

Discusión de resultados:
● Electroforesis de la ¨Escalera casera¨:
En el carril 3 no se obtuvieron los resultados deseados, esto debido a varios factores, ya sea si se
tomaron una mala cantidad de muestras, la concentración de primers fue más alta de lo requerido
o mal aplicación de los reactivos. En el carril 9 presentó resultados más normales a lo esperado,
pero de igual manera no fueron los esperados, esto nos puede indicar que los reactivos tal vez no
estén en la mejor calidad o es el resultado de malos pipeteos, en el carril 10 se obtuvo una
muestra con doble bandeo puesto a que se le insertó el doble de la cantidad de muestra que era
requerida, mientras que en el carril 11, se obtuvo una muestra nítida al finalizar la electroforesis
y esto puede ser debido a la condición degradada del material genético que se utilizó (Arévalo,
2003).
A pesar del hecho de que se utilizaron muestras de ADN viejo, se obtuvo un resultado similar a
los 1919 pb esperados en el carril 10 y 11.

● Transformar las células competentes:

Se realizó transfección del plásmido pRSET-b a células competentes de la cepa de expresión E.
coli Shuffle, por medio de transformación química. Esta cepa posee la capacidad de formar
enlaces disulfuro en su citoplasma (New England BioLabs, s.f.), lo que favorece el plegamiento
y adquisición de la estructura funcional de las proteínas expresadas. Los vectores pRSET son
vectores de expresión derivados de pUC diseñados para la expresión y purificación proteica a
partir de genes clonados en E. coli (invitrogen, 2010).Se utilizaron los plásmidos con los genes
YPF, la cual consiste en una variante de la proteína verde fluorescente, la cual ha sido
modificada en cuatro sitios de mutación (Jayaraman et al., 2000), lo que le confiere una mayor
longitud de onda (Wachter et al., 1998). La mRFP consiste en un monómero derivado de la
proteína DsRed proveniente de la anémona Discosoma sp, al igual que mPLUM (Campbell et
al., 2002), los cuales consisten en genes de expresión de proteínas fluorescentes.
Se observó crecimiento de colonias en los tres cultivos con medio LB con carbenicilina, por lo
cual se corrobora la presencia del vector, para verificar la presencia del gen de interés se realizó
una electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, este porcentaje se decidió debido a los tamaños
esperados de los fragmentos no eran mayores de 6 kb, el gel de agarosa permite separar
fragmentos desde 50 pb hasta 40 kb, para fragmentos de gran tamaño se requiere una menor
concentración de agarosa, mientras que para fragmentos pequeños se requieren concentraciones
mayores (Fierro, s.f.), lo que permite que los pequeños fragmentos pasen a través de los huecos
de la matriz, mientras que los fragmentos grandes se atoran o separan con más lentitud. Previa
extracción de ADN plasmidico y digestión enzimática, donde se utilizó la enzima de restricción
Xba I, la cual presenta un solo sitio de corte en el plásmido pRSET-b, donde reconoce la
secuencia T/CTAGA que se encuentra a 58 aminoácidos río arriba del promotor T7 (New England
BioLabs, 2022), con la cual se linealizó el plásmido para comparar los fragmentos obtenidos con
los tamaños teóricos del vector de expresión y del gen de la proteína fluorescente. El objetivo de
la digestión enzimática fue linealizar el plásmido, para determinar si el tamaño observado se
corresponde con el tamaño de este con el inserto. El ADN al estar linealizado se mueve más
lento por el gel de agarosa (Lirnanskaya y Limanskii, 2008), esto nos permite tener una
estimación de su tamaño, ya que al estar superenrollado se desplaza a mayor velocidad a través
de los poros del gel de agarosa, por lo que el tamaño observado en el gel será menor a su tamaño
real. El tamaño del vector de expresión pRSET es de 2897 pb (invitrogen, 2010) , mientras que
los tamaños de los fragmentos YFP, mPLUM y mRFP son 720 pb, 681 pb y 678 pb
respectivamente (SnapGene, s.f.), por lo que esperaría observar fragmentos de 3617 pb, 3578 y
3575 pb respectivamente. La escalera casera contiene fragmentos de longitudes de las 600 bp a
2800 pb, sin embargo, esta no se desplegó de forma adecuada por lo que no fue posible
determinar la longitud de fragmentos de ADN observados. Sin embargo se observan bandas por
encima de la banda de tamaño mayor tamaño de la escalera por lo que se asume que estos
fragmentos poseen un tamaño mayor a 3000 pb.
En carril 11 del gel 1 se observa mayor intensidad de la banda, la cual corresponde a la
transformación con mRFP con digestión enzimática, esta intensidad puede deberse a que
corresponde a la muestra con la concentración más alta de ADN.

● Electroforesis de digestión enzimática:

Durante la elaboración de la práctica, se mencionó que las muestras posiblemente estén
contaminadas con ADN citoplasmático durante el proceso de extracción, lo cual pudo haber
provocado el bandeo múltiple en varias de las muestras obtenidas al finalizar la práctica,
particularmente en el bandeo del carril 2 del gel 1 (figura 3) y en el carril 4 del gel 2 (figura 4)
(Arévalo, 2003).

Conclusiones:
En base al aspecto macroscópico de las colonias de E. coli concluimos que la transformación fue
exitosa, debido a que expresaron las coloraciones correspondientes para cada una de las proteínas
fluorescentes utilizadas. Con respecto a la electroforesis, a pesar de que se observan bandas de
tamaño similar en cada uno de los pozos, lo que hace suponer que todas contienen el plásmido,
no se pudo comprobar por este método debido a que no contamos con un tamaño de referencia
adecuado en el gel por la falta de despliegue de la escalera casera, por lo que no es posible
comparar el tamaño observado con el esperado. La electroforesis en gel de agarosa es un buen
método para comprobar si la transformación ha sido exitosa cuando la expresión del gen de
interés no es fácilmente observable; como es el caso de la proteína verde fluorescente, donde la
coloración característica requiere de un medio enriquecido con arabinosa para ser visualizada,
sin embargo, el vector con esta proteína no fue utilizado en el presente experimento.

Referencias bibliográficas:
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Instituto Nacional de Salud de Perú.
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