Biología Celular y Molecular 2023

Práctico Genética

Práctico de laboratorio

Detección de genotipos relacionados a la intolerancia a la lactosa

En los mamíferos, la posibilidad de digerir la lactosa presente en la leche y los productos

lácteos disminuye con la edad, debido a una disminución de la producción de la enzima
lactasa en el intestino delgado. Es más, en los seres humanos, la lactasa utilizada para
digerir este disacárido sigue expresándose en los adultos, un fenotipo conocido como
persistencia de lactasa (LP). Los individuos LP son tolerantes a la lactosa y mantienen la
capacidad de digerir productos lácteos hasta la edad adulta; en contraposición, las personas
intolerantes a la lactosa (LNP) no pueden digerir cantidades importantes de lactosa. La
persistencia de la actividad de la lactasa se ha relacionado con algunos polimorfismos de
nucleótido simple (SNP) en una región ubicada a unos 14 Kb río arriba del gen de la lactasa
(gen LCT). La LP se hereda como un carácter mendeliano dominante. En poblaciones
europeas, la variante genética C/T-13910 (rs4988235) se asoció con la actividad de lactasa
en la edad adulta: el genotipo CC se asoció con hipolactasia y los genotipos CT y TT con
persistencia de lactasa. Este alelo actúa como potenciador de la expresión de lactasa,
aumentando su transcripción en las líneas celulares. En diferentes poblaciones, la
frecuencia de este SNP varía dependiendo de la historia demográfica de cada región. En la
población uruguaya, que cuenta con un mestizaje moderado (con predominio de aporte
europeo y modesto aporte nativo americano y africano), la frecuencia de C/T-13910 es
similar a la de otras poblaciones sudamericanas con predominio del aporte parental europeo
así como a poblaciones de la Península Ibérica.

En el presente práctico estudiaremos la mutación C/T-13910 en una muestra de 3 pacientes

con sospecha de intolerancia a la lactosa. El objetivo es determinar el genotipo de cada
uno de los pacientes para el SNP C/T-13910, mediante PCR-RFLP. El polimorfismo del
largo de los fragmentos de restricción (RFLP) detecta diferencias en el tamaño de
fragmentos digeridos por una enzima de restricción, indicativo de una diferencia de
secuencia entre alelos.

Para ello se realizó una extracción de ADN de cada uno de ellos a partir de una muestra de
sangre. La región flanqueante al SNP se amplificó mediante PCR, con los siguientes
oligonucleótidos: (F) 5′-TCTGTATTGCCAGCGCAGAG-3′ y (R)

1
Biología Celular y Molecular 2023
Práctico Genética

5′-TGTTCCATTGCTTCAGCTTGT-3′. Luego el fragmento amplificado (990 pb) fue digerido

con la enzima de restricción BsmFI que reconoce como sitio de corte la secuencia

En presencia de la variante T se generan dos fragmentos de 450 y 540 pb cada uno.

En el salón de práctico su docente le proveerá 3 muestras de ADN ya amplificadas por PCR

para la región que incluye C/T-13910 (rs4988235) y digeridas con la enzima de restricción
BsmFI. También se le proveerá de un marcador de peso molecular. Cada grupo deberá
analizar el largo de los fragmentos de restricción obtenidos, mediante una corrida
electroforética. Se espera que con estos resultados cada grupo pueda predecir el estado de
tolerancia a la lactosa para cada individuo analizado.

Protocolo:

Atención: Durante todo el práctico deberá usar túnica y guantes para la manipulación. Se
recomienda llevar ambos al práctico.

1. Preparación del Gel

a. Los geles de agarosa se preparan utilizando una solución porcentual
peso/volumen. La concentración de agarosa en un gel dependerá del tamaño
de los fragmentos de ADN que se van a separar, y la mayoría de los geles
oscilan entre el 0,5 % y el 2 %. En este práctico usaremos 2%.

Por ejemplo: para preparar 100ml de solución de agarosa se precisan

2g de agarosa disueltos en 100ml de buffer TBE 0,5X.

Las cubas BlueGel son para geles de 20ml, calcular la cantidad de

agarosa necesaria para preparar una solución de agarosa al 2% en
un matraz. Pesar la cantidad de agarosa calculada.

2
Biología Celular y Molecular 2023
Práctico Genética

b. Agregar la cantidad necesaria de buffer de corrida TBE 0,5X. Mezclar

agitando suavemente el matraz.
c. Derretir la mezcla de agarosa/buffer en microondas. A intervalos de 30
segundos, retire el matraz (¡recordar que esta caliente!) y agite suavemente
el contenido para mezclarlo bien. Repita hasta que la agarosa se haya
disuelto por completo.
d. Añadir GelGreenTM a la solución de agarosa, según las siguientes
indicaciones:
i. Si es un gel de 20ml, agregar 2,0ul de GelGreenTM.
ii. Si es un gel de 100ml, agregar 10ul de GelGreenTM.
e. Deje que la agarosa se enfríe en la mesa de trabajo. Si no lo hace, la
bandeja donde verterá el gel se deformará.
f. Mientras enfría, prepare el molde donde vertirá el gel. Coloque un peine
apropiado para crear los pocillos.
g. Vierta la agarosa fundida en el molde de gel.
h. Permita que la agarosa se asiente a temperatura ambiente. Esto llevará unos
minutos. Una vez solidificado, retire el peine y coloque el gel en la cuba
electroforética.

2. Configuración la cuba electroforética y separación de fragmentos de ADN

a. Pídale a su docente 3 muestras de ADN de individuos a analizar, y marcador
de peso molecular. Cada muestra ya tiene incluido el colorante de carga.

El colorante de carga de gel ayuda a rastrear qué tan lejos ha viajado

su muestra de ADN en el gel y también permite que la muestra se
hunda en el gel (en oposición a difundirse en el buffer de la cuba).

b. Agregue 30ml de buffer de corrida para cubrir la superficie del gel. Es

importante utilizar el mismo buffer de corrida que el utilizado para preparar el
gel: en este caso TBE 0,5X.
c. Lenta y cuidadosamente, cargue las muestras de ADN y el control en los
pocillos del gel. Además de las muestras, deberá cargar un marcador de
tamaño de ADN adecuado (Marcador de peso molecular). Deberá cargar
10ul por pocillo.

3
Biología Celular y Molecular 2023
Práctico Genética

d. Los pocillos del gel deben estar ubicados en el extremo opuesto al boton de
encendido de la cuba. Colocar la tapa de la cuba electroforética.

El polo negativo debe estar más cerca de los pocillos que el polo
positivo.

e. Vuelva a verificar que los electrodos estén enchufados en las ranuras

correctas de la fuente de poder.
f. Encienda la fuente y corra el gel hasta que el colorante haya migrado a una
distancia adecuada.
3. Observación de fragmentos de ADN separados
a. Cuando se haya completado la electroforesis, apague la fuente de poder y
encienda la luz azul de la cuba electroforética.
b. Tome una foto del gel. Si es necesario utilice la caja negra para poder tomar
una foto con el celular.
c. Deseche correctamente el gel.
d. Analice los resultados utilizando la foto tomada en 3.b.
4. Discusión de resultados.

¿Qué genotipos tienen los individuos analizados? ¿Qué conclusiones puede

sacar con respecto a su fenotipo esperado?