PROTOCOLLO RT

1. Prendere i campioni, generalmente conservati in frigo e risospesi in 200 µl di RNA Zol;

2. Aggiungere ai campioni il 20% del volume totale di Cloroformio 40 µl;
3. Risospendere bene con shaker (metodo Mara) e vortexare;
4. Centrifugare i campioni a 13000 G/4° per 15 min;
5. Nel frattempo, preparare tube da 0,5 ml per ogni campione con 100 µl di isopropanolo [1:1];
6. *Dopo la centrigua si sarà formato un gradiente a 3 componenti:
(*l’RNA legato alla guanidina isotiocianato resta in sospensione)
 TrasparenteRNA;
 Bianco/molto sottileDNA+Protidi;
 BluScarti.
7. Prelevare delicatamente l’RNA da ogni campione, versarlo nella rispettiva provetta in isopropanolo,
e capovolgere più volte la vial. Congelare tutto a -20° overnight o in alternativa a -80° per 1h;
8. Disporre i campioni in centrifuga e attendere 15 min senza azionarla. Centrifugare poi i campioni a
13000 G/4° per 15min;
9. Gettare il sup e aggiungere 100 µl di EtOH 75%;
10. Ripetere step 8;
11. Pulire bene i campioni dall’EtOH in tre fasi utilizzare prima una pipetta impostata su 100 µl,
successivamente su 10 µl ed infine lasciare le provette sotto cappa per ~15 min per far evaporare;
12. Aggiungere 12µl di H2O ad ogni campione e leggere 1µl al NANODROP (ricordarsi di pulire bene il
NANODROP e leggere prima il bianco):

Rapporti:
Inquinamento da DNA: 260/280  1,8/2,0
Inquinamento da fenoli 260/230  1,4 ---

13. Aggiungere ad ogni campione la mix di 1,45 µl composta da (risospendere bene):

 1,2 µl di Buffer;
 0,25 µl di DNasi.
14. Mettere i campioni in incubatore a 37° per 10 min;
15. Aggiungere ad ogni campione 1 µl di EDTA 60mM per disattivare l’enzima;
16. Mettere i campioni in termoblocco (blocco 2) a 75° per 10 min;
17. Rimettere i campioni in ghiaccio e aggiungere 1µl della mix oligoDt (primer specifici per poliA)+
Random Primers PREPARAZIONE  diluire entrambi 1:5 40 µl Dt + 40 µl RP + 120 µl H2O
18. Mettere i campioni in termoblocco (blocco 2) a 70° per 5 min;
19. Rimettere i campioni in ghiaccio e aggiungere ad ogni campione la mix di 6,5 µl composta da:
 4 µl di Buffer;
 1 µl di enzima RT (retrotrascrittasi);
 1 µl di dNTPs; *PREPARAZIONE per 200µl: diluizione 1:10  20 µl per ogni dnucleotide in 120
µl di H2O;

 0,5 µl di RNasi inhibitor.

20. Disporre i campioni in Termociclatore impostando il programma RT: 42° x 60 min;
94° x 5 min;
4° overnight.

21. Terminata la retrotrascrizione, diluire i campioni 1:4 aggiungendo 60 µl H2Oe riporre tutto a -20 o a
4° se si usano in giornata

REAL TIME
22. prendere ghiaccino e SYBR nel cassetto 6, tutti i vari enzimi disposti in ghiaccio, ed allestire la
PCR:
*Prima di inoculare nei pozzetti, vortexare bene il campione!
a. Progettare la piastra per tutti i vari target, i geni HK e riportare i bianchi;
b. Preparare la mix per tutti i campioni sopraindicati:

 5 µl di SYBR Green;
 2,5 µl di H2O;
 0,5 µl di Primers

c. Inoculare in ogni pozzetto 8 µl di mix rispettando l’ordine precedentemente deciso;

d. Inoculare in ogni pozzetto 2 µl di cDNA rispettando l’ordine precedentemente deciso;

23. Sigillare tutto con la pellicola apposita ricorrendo alla spatola per prevenire ogni foro ai lati;
24. Centrifugare brevemente la piastra da PCR e inserirla nel termociclatore RT-Binrad CFX-
menager user defined express roadRun pcr