3- 14/03 Genetica umana molecolare (cap 5-6)

Costruzione cariotipo: allungamento dei cromosomi per vedere le bande. Pattern normale 450 bande, 700 bande ad
alta risoluzione. Ogni banda ha un certo numero di Mb e da questo dipende la grandezza delle bande.

Nei cariotipi femminili abbiamo due cromosomi X e uno è meno riconoscibile a livello di bande per via
dell’inattivazione.

Eteromorfismi citogenetici

Ci sono delle variazioni anche molto evidenti nel cariotipo

che non sono per forza anomalie:

 Variazione pericentromerica del cr.9 9qh+

 Inversione 9 inv – nessun problema per la
prole perché in questo punto c’è eterocromatina
 Variazione + inversione

Y – è il cromosoma che ha varianti polimorfiche in molti

uomini, per quanto riguarda la eterocromatina nel braccio lungo. Il cromosoma Y ricombina molto poco, esistono delle
famiglie note in cui c’è una variante di questo tipo perché viene trasmessa di padre in figlio. Fa un solo crossing-over
nella regione pseudo-autosomiale (PAR1). Subito sotto c’è il gene della determinazione del sesso maschile SRY. Nel
q ha i geni della spermatogenesi e un sacco di eterocromatina (deserti genici).

Come si fa il cariotipo?

1.Si contano i cromosomi: importante per sospettare la presenza di alterazioni nel numero cromosomico

2. Si appaiano gli omologhi per similiarità

3. Si mettono in ordine secondo la convenzione.

Fish (fluorescent in situ hybridazation): usare cromosomi e sfruttare il fenomeno dell’ibridazione della sonda che si
basa sul fatto che ad una certa temperatura e concentrazione di sali il DNA si apre e si denatura. Vedi blocco 2 slide
62-66)

Usato molto nei test genetici ed e stato messo a punto x tracciare singoli e piccole porzioni del genoma, per preparare
sonde che sono pezzi di DNA omologo ad uno del nostro genoma, legato a dei fluorofori (si usava sostanza radiottiva
tempo fa ora si usano fluorocromi).

Denaturo il vetrino mettendolo a 95 gradi, le eliche si aprono , si congela il vetrino in alcool a scalare e quindi ho
aperto le eliche. Poi metto a 37 gradi per una notte: le gocce di sospensione con sonda sali ecc , la sonda troverà il
suo partner, si attacca, si lava il vetrino e si colorano i cromosomi e si guarda al microscopio usando i filtri di
lunghezza d’onda giusta.

Sonda verde: marcata con fluorescina e sonda in rodamina rossa che riconosce le sequenze alfa satelliti del
Centromero.

Painting cromosomico: colorare cromatidio: é una collezione di sonde che colorano un certo cromosoma. Per es: il
painting del cromoosma 4 ci mette in evidenza x esempio se c’è stata traslocazione di pezzi di cromosoma.

Un'altro uso di FISH: nei nuclei interfasici per quantificare il

numero dei centromeri: per esempio in un nucleo di liquido
amniotico dove usando la FISH per il centromero del 21 vedo
che si ripete tre volte(trisomia 21). I due puntini di fluorescina
sono di controllo.non viene però più usata.

FISH interfasica x diagnosi prenatale. QF-PCR analizza

microsatelliti e misura i picchi di questi come diagnosi
prenatale.
Dove si studia oncoematologia si usa ancora la fish metafasica.

Uso più frequente é per le microdelezioni (la delezione del 22 sindrome di degeorge)

Tecniche per quantificare regioni cromosomiche (x capire se ci sono più o meno quantità di un certo pezzo
cromosomico): x studiare gli sbilanci cromosomi si usa una tecnica molecolare CGH-array ibridazione usando
solo DNA (dobbiamo testare un dna x esempio di un bambino che ha alterazioni fenotipo che possono essere
collegate ad un sbilanciamento cromosomico: si fa cariotipo ed è tutto apposto. Con la FISH non si può vedere base
per base o banda per banda, allora si usa il cgh array. Il DNA viene estratto dal sangue e viene marcato tutto con
fluorocromo rosso: poi si prende un DNA non patologico di riferimento e si marca di un altro colore. A quel punto si fa
in quantità equimolari si ibridano insieme li denaturo tutti e li ibrido su un vetrino (cyp) dove ogni quadratino
rappresenta una precisa regione genomica. Non uso i cromosomi per fare ibridazione ma uso in supporto dove in ogni
puntino c’è specifico pezzettino di tutti i cromosomi. Ogni pozzetto corrisponde a zona specifica del cromosoma. Dove
ci sono entrambi alle stesse quantità i quadrati sono gialli-- li va tutto bene, é una regine in cui il DNA da testare non
ha ne più ne meno. Se e rosso, vuol dire che ho più del mio DNA tester più del reference (c’è sbilancio--> in quel
punto c’è qualcosa in più del DNA tester e quindi una regione precisa del genoma dove ci dice che c’è una
duplicazione per esempio duplicazione o trisomia ). Se nel DNA tester ho un buco e quindi una delezione e quindi una
sola copia dell’allele ci sarà più verde. Questo sistema ha permesso di scoprire molte cose , non solo mappare
malattie genetiche difficili da conoscere ma anche di conoscere molte regioni che possono essere duplicate anche
senza nessun significato (in maniera fisiologica senza impatto nel fenotipo). Lapski articolo vedi. DNA da testare e di
controllo sono ibridati su piccole sequenze di DNA fissate su un vetrino, a costituire appunto l’array. Le sequenze
possono essere inserite in BAC (Bacterial Artificial Chromosome), oligonucleotidi specifici per gli esoni e introni.
Possono variare in numero a seconda della densità. La risoluzione varia da I Mb con I BAC-array e 100kb con I
nucleotide array. Lupski ha scoperto che si sono alcune regioni del genoma più suscettibili rispetto ad altre. Vedi slide
70-71-72

Ci sono delezioni e variazioni del genoma che si chiamano CNV (possono essere delezione, inserzioni ecc..). Con
array si diagnosticano anomalie quantitative del contenuto di DNA, riferite come CNV (Copy Number Variation).
Interpretazioni dei risulti: Il genoma è ricco in regione fisiologicam duplicate in numero variabile causate dalla elevata
plasticità del genoma favorita da dupliconi e LCR

Anomali cromosomiche: condizioni patologiche

Anomalie cromosomiche:

 Bilanciate: non sono correlate in un fenotipo anomalo normalmente, ci sono stati scambi dei pezzi, se non si
rompono geni o non si cambia un promotore(come nel linfoma di Burkitt) non succede nulla. Sono benigne
generalmente --> traslocazine robertsoniana tra cromosoma 14 e 21--> avremo un cromosoma in meno ma
c’è tutto (riguarda cromosomi acrocentrici) ci sono sindromi down in cui si ha traslocazione 14 e 21 e un
altro 21 --> questo succede quando si è portatrici e con fecondazione ci sarà un altro cromosoma. Quindi
potrebbero essere un motivo di suscettibilità ad avere figli con sbilanciamenti. QUASI SEMPRE IL
FENOTIPO È NORMALE
 Sbilanciate: hanno sempre impatto su fenotipo perche vuol dire in quegli alleli si avrà o un dosaggio extra o
un'aploinsufficienza. Quando non si sa che patologia ha un bambino per esempio con ritardo psicomotorio
o del linguaggio allora si fa cgh array. FENOTIPO ALTERATO o ABORTO

Gravità del fenotipo e il tipo di cromosoma coinvolta e geni interessati. Se c’è delezioni ampia quel feto magari non
nasce. Se é molto ampia la regione sbilanciata si può avere aborto precoce.

Che tipo di alterazione abbiamo?

Tra le sbilanciate si ha: triploidie (3N), aneuploidie (variazione del numero cromosomico che non riguarda l’assetto
completo)--> trisomie o monosomia, mosaici, marcatori soprannumerari (frutto di duplicazione o riarrangiamenti che
danno cromosomi extra facilmente identificabili con cgh array.
Epidemiologia ( non si sono popolazioni che hanno maggior incidenza di anomalie cromosomiche) es: talassemia é
più frequente nelle regioni malariche (perchè non si ammalano di malaria). Studi su incidenza nei nati vivi su 68.000
neonati ha evidenziato delle differenze: le anomalie cromosomiche si vedono 1:154. Le bilanciate possono essere de
novo o ereditate: se si trova una traslocazione che sembra bilanciata bisogna vedere i genitori perchè se hanno la
stessa traslocazione allora forse non è quella la causa della malattia, se invece l’anomalia é de novo allora potrebbe
esserci relazione con fenotipo alterato.

Gli sbilanciamenti di interi cromosomi o regioni cromosomiche sono dovuti a:

• Disturbi causati da segregazione cromosomica anomala o errori alla fecondazione (non disgiunzione
aneuploidie down, klinefelter e disomia uniparentale)
• Disturbi causati da anomalie cromosomiche sporadiche, tipicamente de novo (punti di rottura sporadici e
variabilisindrome da delezione (sindrome di cri du chat e da delezione 1p36)
• Disturbi causati da anomalie cromosomiche famigliari ereditate in modo sbilanciato(segregazione
sbilanciatatrasmissione di traslocazioni bilanciate e di inversioni pericentriche)
• Disturbi causati da sindromi cromosomiche ricorrenti, coinvolgenti delezioni o duplicazioni in hot spot
genomici (Ricombinazione a livello di duplicazioni segmentalisindromi da duplicazione/delezione, variazione
del numero di copie)
• Disturbi causati da eventi cromosomici e genomici che si associano a regioni soggette ad imprinting
genomico (Qualsiasi evento che impedisca il regolare imprinting sindrome di prader-willi/angelman)

- La POLIPLOIDIA è la costituzione cromosomica di una cellula, o di un organismo, che presenta tre o più
assetti cromosomici aploidi (n). (fecondazione di due spermatozoi di un unico ovocita e rappresenta il 15% ).

La presenza di tre copie dello stesso cromosoma è chiamata TRISOMIA, di una sola copia MONOSOMIA( Nullisomia
 nessuna copia di quel cromosoma).

Poliploidia: Si definiscono poliploidi le cellule con

un numero di cromosomi corrispondente ad un
multiplo esatto del corredo aploide (n) Triploidia
(3n= 69 cromosomi). Tetraploidia (4n= 92
cromosomi). Triploidia può essere dovuto anche al
fatto che l’ovocita non ha compiuto la seconda
divisione meiotica o che non l’ha compiuto lo
spermatozoo. Per la tetraploidia c’è
endoduplicazione del’ assetto non seguito da
citodieresi. E’ tra le più frequenti cause
cromosomiche di aborto spontaneo. Il 15% di tutte
le anomalie cromosomiche riscontrate nei materiali
abortivi.

Disomia uniparentale é un problema cromosomico

dove la madre ha prodotto un ovocita con due
cromosomi 15 e il padre ha messo il terzo
cromosoma. Un feto con tre cromosomi non é
compatibile con la vita, avviene il trisomic rescue e si perde uno dei tre cromosomi: se perdo uno materno apposto ma
se perdo quello paterno allora avrò solo quelli materni (siccome ci sono regioni soggetti a imprinting, il bambino avrà
la sindrome di Prader Willy e ritardo mentale). Se fosse il cromosoma 1 non si avrebbe nessun fenotipo perchè non
ha regioni soggette a imprinting.

Una non disgiunzione chr causa il più delle volte trisomia o monosomia del chr coinvolto nell’errore di segregazione.
Però può anche condurre a uno stato disomico in cui entrambe le copie di un chr derivano dallo stesso genitore 
questo è la condizione di disomia uni parentalepresenza di una linea cellulare disomica contenente due chr o
porzioni di essi che sono ereditati dallo stesso genitore con assenza del contributo dell’altro. Se i due chr derivano da
cromatidi fratelli idntici, allora la condizione si chiama isodisomia. Se entrambi gli omologhi di un genitore sono
presenti, la situazione è detta eterodisomia. La spiegazione più comune per la disomia uni parentale è l’eliminazione
del chr soprannumerario in almeno una cellula di un embrione trisomico (trisomic rescue). Se a caso viene eliminato il
chr di origine paterna, i due rimanenti saranno entrambi di origine materna questo se avviene durante
l’embriogenesi precoce, produce una cellula vitale con più possibilità di sopravvivere rispetto a quelle trisomiche. La
causa della trisomia originaria è una non disgiunzione meiotica in una delle linee germinali parentali. Il salvataggio
avviene grazie ad un secondo evento di non disgiunzione durante la mitosi salvando cosi il feto.

Frequenza nei nati vivi é bassa nelle poliploidie causato da non disgiunzione cromosomica

- Le anomalie di numero di singoli cromosomi sono invece chiamate ANEUPLOIDIE. Si definiscono aneuploidi
le cellule con cromosomi in più o in meno, ma non equivalenti a un multiplo esatto del corredo aploide

– Trisomie
– Monosomie
– Marcatori sovrannumerari

L’aneuploidia è i principale fattore eziologico alla base di un alterato sviluppo fetale e, nella maggior parte dei casi,
esita in aborto.

• Frequenza nei nati vivi 0,38%

• Il principale meccanismo all’origine è la non-disgiunzione cromosomica durante la meiosi
• Rischio correlato all’età materna

Le aneuploidie sono causate da:

Non-disgiunzione

- Mancata separazione degli omologhi in anafase I della meiosi

- Mancata separazione dei
cromatidi alla meiosi II

Segregazione inversa

- Separazione dei cromatidi fratelli in

meiosi I e separazione dei cromosomi
omologhi in meiosi II

Ritardo (lag) anafasico: Migrazione

ritardata del cromosoma durante
l’anafase, con conseguente perdita del
cromosoma al momento della
formazione dell’involucro nucleare.
Mancata incorporazione di un
cromosoma nel nucleo di una delle
cellule figlie. Solitamente è un evento
post-zigotico e genera un MOSAICO.
(cromosoma che migra in modo
ritardato in anafase con conseguente
perdita quando si riforma l’involucro
nucleare: genera mosaicismo).
 – E’ causato da un ritardo nella migrazione del cromosoma/cromatide durante l’anafase.
– Dà origine ad una cellula figlia in cui manca un cromosoma o un cromatidio.

Non disgiunzione se avviene nella prima divisione o nella seconda divisione meiotica: nella prima tutto é sbagliato, ma
se avviene nella seconda , in uno avremo numero corretto in uno no.

Nell’ invecchiamento dell’ovocita, la fase della meiosi che resta bloccato da fase fetale a maturazione sessuale é
meiosi uno( trisomie di età materna sono legate sicuramente a meiosi 1--> mal segregazione in meiosi 1, in diplotene
)

Mosaicismo : avviene in maniera

post zigotica e può generare
linea a 47 cromosomi. Il
mosaicismo lo vediamo nel
sangue ma è difficile fare
associazione genotipo fenotipo:
non è detto che rispecchi
alterazione a livello di altri
tessuti.

ANEUPLOIDIE DEGLI AUTOSOMI COMPATIBILI CON LA SOPRAVVIVENZA POSTNATALE:

Sindrome di Edward ( trisomia 18)ci sono aterazioni strutturali (schisi e problemi alle mani) ci sono però anche
anomalie cerebrali e cardiache gravi per permettere la vita. Mentre la sindrome di Down nonostante spesso abortita in
maniera spontanea, può essere compatibile con la vita.

Sindrome di Down(trisomia 21): il 20% o son abortiti o nascono morti perchè spesso ci sono anomalie cardiache:
nel 95% l’errore di non disgiunzione è durante la meiosi , il 90% nella meiosi 1. Il 2% presenta condizione di
mosaicismo mentre nel 5% é trasmessa da un genitore portatore con traslocazione robertsoniana del cromosoma 21.
I bambini con down hanno caratteristiche specifiche del volto e struttura e del taglio delle palpebre obliquo ecc...

 Traslocazione robertsoniana
Mosaicismo: evento
post-zigotico

Diagnosi della trisomia 21 fish, cgh array, cariotipo.

Quale è la regione causativa nel cromosoma 21: probabilmente c’è una regione più terminale del cromosoma 21 più
correlata ad un fenotipo down ovvero duplicazione 21q22 ovviamente se il tutto è ridotto il fenotipo è meno grave.

Sindrome di Edwards: (18) difetto di non disgiunzione durante la meiosi materna mentre X e Y (Klinefelter e Turner
hanno origine da una mal segregazione materna) Vedi caratteristiche patologie slide.

Sindrome di Patau (trisomia 13)

Perché sono gli unici compatibili con la vita? Perché sono i 3 chr con il numero minore di geni. Per gli altri chr
aborto spontaneo. La trisomia 18 e 13 sono meno comuni della 21 e la sopravvivenza oltre il primo anno è rara a
differenza della Down in cui l’aspettativa di vita è oltre i 50 anni.

La mutazione più comune coinvolge errori nella segregazione cromosomica, con formazione di un gamete anormale
in quanto contiene due copie o nessuna copia del chr coinvolto nell’evento di non disgunzione.