LEZIONE 1

Eterogeneità all’etica: forme diverse di alleni danno fenotipi diversi (es. FC)
Eterogeneità di locus: alei diversi di geni diversi possono dare lo stesso fenotipo (es.
ipoacusia)

Materiale di lavoro
Si cerca di essere il meno invasivi possibile.

Per le analisi “normali” si usa sangue periferico o addirittura campioni spatolati dalle
mucose. Per le diagnosi prenatali si può fare villo- o amniocentesi, ma è anche possibile
prelevare DNA fetale dal circolo della madre, e la stessa cosa si può fare per il DNA
tumorale circolante (se metastasi). Le analisi per impianto si fanno direttamente su una
cellula del blastocista, tanto sono onnipotenti.

Misurazioni in genetica
Le sindromi genetiche dipendono dalla quantità di materiale genetico coinvolto. Le tecniche
che abbiamo a disposizione sono più avanzate delle nostre conoscenze, dal momento che
non sappiamo con certezza che ruolo abbiano tutti i geni o addirittura il materiale genetico
non codificante.

In clinica le sindromi genetiche vengono classificate per sistema, mentre in questo esame di
merda distinguiamo:

-Citogenetiche: cromosomi
-Citogenetiche molecolari: a livello del singolo gene
-Biomolecolari: risoluzione altissima, penso si tratti del sequenziamento.

Malattie cromosomiche
La risoluzione è di 5÷10 megabasi, e il riconoscimento dei cromosomi si basa sulla loro
morfologia e sul bandeggio (affinità della colorazione per regioni a prevalenza AT o CG). Le
anomalie cromosomiche sono spesso causa di aborti o poliabortività o infertilità di coppia. Si
stima che circa l’1% della popolazione sia portatrice di anomalie cromosomiche che
comportano solo un aumento dell’abortività.

Il prelievo per il carotino può essere effettuato su qualsiasi cellula vitale in metafase, dacché
diventa complicato fare cariotipi su campioni paraffinati.

Esecuzione del cariotipo

Prelevato il campione si aggiunge fitoemagglutina, che induce la proliferazione es, dei LyT, e
lo si incuba. Dopo l’incubazione si aggiunge colchicina, sostanza che blocca la formazione
del fuso mitotico: l’ideale è arrestare il ciclo cellulare in profase/prometafase, momento in cui
si ottiene la risoluzione massima di bandeggio (850 bande). Si lisano le membrane con
soluzione ipotonica, si gocciola il materiale su vetrino, si fissa e si sciacqua. Oltre ai due
sottoindicati la citogenetica viene impiegata per la diagnostica oncologica in caso di
leucemie del midollo.

Citogenetica in diagnostica prenatale

La diagnostica prenatale prevede procedure invasive possibilmente dannose per il feto,
quinde ci sono indicazioni particolari:
-Età della madre >35 aa.: L’incidenza di prole malata passa da 1/250 a 1/9. L’indicazione
non è assoluta tuttavia: servono misurazione translucenza ducale e DNA fetale, biochimica
della madre e livelli ormonali della madre.
-Precedente gravidanza con anomalie cromosomiche: solitamente si tratta di eventi casuali
ma potrebbe esserci un mosaicismo germinale
-Genitore con traslocazione bilanciata
-Genitore con marcatore cromosomico sovrannuumerario
-Riscontro ecografico di anomalier predittive per anomalie cromosomiche

Citogenetica i diagnostica postnatale

Per la mia sanità mentale riporto solo qualche indicazione: fenotipo riconducibile a sindrome
cromosomica, poliabortività, infertilità di coppia a cause non note, sospetto clinico di
sindrome da microdelezione/-duplicazione, femmine con patologie recessive legate all’X.

Sia su nati vivi, sia su nati morti. Non mi sembra così importante.

Aborti spontanei
Il 20% circa degli ovociti presenta aneuploidie importanti, ed il 20% circa dei concepimenti
esita in aborti talmente precoci da non essere ne,mmeno registrati come tali. Solo alcune
aneuploidie progrediscono a dare aborti tardivi, mentre tra quelli precoci è riscontrabile un
po’ un poutpurri.

Non-disgiunzione
Può succedere in meiosi I e dare a valle due cameti senza un cromosoma e due
eterodisomici, o in meiosi II e dare due gameti euploidi, uno senza un cromosoma, ed uno
isodisomico.

LEZIONE 2
Cromosoma trivalente
Nel contesto della meiosi di un genitore con traslocazione che porta ad un cromosoma
derivativo, es. 13-14, la segregazione può essere bilanciata o sbilanciata. Nel caso di
segregazione bilanciata il gamete erediterà o i 13 e 14 normali, estinguendo
fondamentalmente la trasmissione del derivativo, o il derivativo (figlio portatore). Nel caso di
sbilanciata, potrebbero esserci aneuploidie, es. il gamete riceve due cromosomi 14 invece
che uno -> incompatibile con la vita.

Le aneuploidie che consentono di arrivare alla nascita sono 13, 18, e 21.

Calcolo del rischio

Può essere fatto sulle mendeliane classiche o in maniera empirica, fondamentalmente
epidemiologicamente. Non si può calcoilare il rischio di aborto e in questo caso si può solo
dare una valutazione del rischio.

Disomia uniparentale
Situazione in cui un individuo è perfettaemente euploide, ma una coppia di cromosomi arriva
dallo stesso genitore invece che da due; questo può succedere es. dopo un tentativo di
correzione di trisomia (madre con traslocazione, che quindi ha un 14 ed un 13-14 derivativo
nel gamete, arriva il 14 paterno e si rischia la trisomia che viene eliminata eliminando o il 14
materno o il 14 paterno dal corredo completo). Può essere associato a quadri sindromici.

Essendo l’individuo perfettamente euploide è impossibile vedere la disomia uniparentale nel

cariotipo, servono tecniche di biologia molecolare.

Trisomia 21 libera o da traslocazione

La trisomia 21 può essere causata o da trisomie libere, in cui non c’è disgionzione in meiosi
o molto raramente ci sono linee germinali trisomiche, mentre la traslocazione è più rara, ed è
presente un cromosoma derivativo 14-21. L’implicazione è che nel caso di traslocazione una
seconda gravidanza ha un rischio di avere trisomia 21 molto più alto.

Cromosoma Philadelphia
Traslocazione bilanciata 9-22. A livello del 9 viene coinvolta la regione telomerica con il gene
ABL, a livello del 22 la rottura è centromerica e viene coinvolto il gene BRC. Si genera un
trascritto chimerico, altrimenti inesistente nel genoma umano, con potere oncogenico.
L’evento è casuale e probabilmente selezionato da se stesso. È riscontrabile in alcune
leucemie, e la sua identificazione è importante perché comporta la sensibilità a farmaci
specifici.

Biologia molecolare
La citogenetica ha due grossi limiti: la risoluzione e l’incapacità di individuare mosaici poco
rappresentati (se avviene ad 1/1000 cellule auguri a beccarla). Le tecniche di biologia
molecolare si basano tutte sull’ibridazione,l vale a dire la capacità del singolo filamento di
DNA di formare doppi filamenti con qualsiasi altro singolo filamento, non necessariamente
con il suo originale.

Ad esempio la FISH è un’ibridazione a fluorescenza in-situ.

Sonde per ibridazione

Per tutti i saggi di ibridazione si usano sonde, vale a dire filamenti di materiae genetico
marcate o con fluorescenza o con radioattività.

Possiamo distinguere le sonde in base alla loro lunghezza e al loro materiale: dalle sonde
oligonucleotidiche di 50÷150 paia di basi alle sonde di DNA con migliaia di paia di base.
Esistono anche quelle di RNA.

Ovviamente sonde lunghe e sonde corte hanno finalità d’uso differenti, es. quelle fini
verranno usate per cercare sequenze specifiche. Le sonde lunghe ibridano anche se ci sono
importanti regioni di mismatch, mentre sonde più corte sono instabili con mismatch più
piccoli. La stabilità dell’ibridazione dipende anche dalla temperatura. Un esempio di sonda
molto piccola è il primer della PCR.

Procedura di ibridazione
Si estrae il DNA da numerose cellule del paziente, dopodiché si denaturano assieme alla
sonda, aumentando la temperatura, e si lasciano rinaturare. I frammenti heteroduplex sono
quelli di interesse, ovviamente. L’osservazione può essere fatta su nuclei in qualsiasi stato di
replicazione.

Sonde utilizzate in FISH

La FISH ai fini pratici viene usata per ottenere maggiori informazioni da un cariotipo, quindi
le sue sonde devono essere grandi, nell’ordine delle chilo- se non megabasi, altrimenti non
si appaiano e non emettono abbastanza fluorescenza, e devono essere locus-specifiche.

Oltre alle sonde geniche, esistono le sonde centromenriche, le sonde telomeriche (usate
nella diagnostica dei ritardi mentali), e le sonde painting, che contengono sequenze
rappresentative di uno specifico cromosoma opportunamente parcate e usate per indagare
le treaslocazioni. La limitazione più importante della FISH è il fatto che siamo limitati
all’esame di cinque *cose* alla volta, dal momento che i fluorocromi non sono infiniti.

La FISH ha dei vantaggi sulle tecniche di citogenetica: permette di effettuare la valutazione

su cellule con basso indice mitotico (non richiede coltura), permette l’identificazione e la
quantificazione di mosaici e analogamente permette di confermare la clonalità in ambito
oncologico, permette di quantificare la malattia minima residua sempre in ambito oncologico,
e permette di individuare microdelezioni e microtraslocazioni.

Ovviamente è talmente locus-specifica che va usata in caso di sospetto clinico molto

preciso.
Malattie genomiche
Chiamate anche mallattie da microdelezione o -duplicazione, o malattie da geni contigui in
quanto spesso vengono coinvolti geni, per l’appunto, contigui. Il fenotipo dipende da quanti
geni o in che misura sono coinvolti i geni. [Pippone sul ffatto che gli alleli dominanti sono
aploinsufficienti e quindi dose-dipendenti].
I meccanismi alla base possono essere una delezione, una duplicazione, una traslocazione,
o il cambio di promotore, ma il fatto che delle sequenze precise siano spesso coinvolte non
è un caso: alla base della patologia c’è un crossing-over ineuguale che avviene a livello
deller LCR, low-copy repeats. Il meccanismo è lo stesso che permette il crossing-over
ineuguale tra omologhi, solo che avviene a livello di cromosomi diversi o all’interno dello
stesso cromosoma -> non vengono rimescolate sequenze omologhe ma sequenze che non
hanno niente a che fare l’una con l’altra.

Trattandosi di sindromi genetiche il fenotipo non sarà mai completo, quindi il quadro
sindromico è caratterizzato da un certo grado di variabilità. L’iter diagnostico è sospetto
clinico per quadro sindromico (es. Williams) -> FISH per Williams -> riscontro di
microdelezione 7q11.23.

FISH in oncologia
Nella ricerca del cromosoma Philadelphia si usa una sonda fusion: mix di due sonde, una
per BRC ed una per ABL -> se c’è il cromosoma Philadelphia le vedrò colocalizzare sul
cromosoma di derivazione.

Nella ricerca di amplificazione di HER2 (nei tumori può capitare di avere polisomie per un
cromosoma) nel caso di immunoistochimica 2+ si usa una sonda che ibrida HER2 e nel
caso di iperespressione (genica, quindi anche proteica) si rileverà più materiale positivo
all’ibridazione rispetto al normale.

Sonda painting
Utile per la ricerca di microtraslocazioni. In realtà troppo costosa e non si usa in clinica.

LEZIONE 3

ArrayCGH
Si tratta di un saggio di ibridazione inversa. Non si fanno reagire sonde marcate con DNA
fissato al supporto, ma DNA marcato con sonde fissate al supporto.
Le sonde utilizzate sono più piccole di quelle della FISH, sulla chilobase o addirittura
oligotucleotidiche (si parla di qualche decina).

La sigla sta per Array Comparative Genomic Hybridization (o qualcosa del genere). Il
confronto in questione è tra il DNA in esame e un DNA “misto” di controllo. I procedimenti
sono fondamentalmente gli stessi della FISH — denaturo, mischio a sonde, raffreddo per far
ibridare, lavo, e guardo —, soltanto che ad essere marcati diversamente sono le due fonti
diverse di DNA. Ovviamente, per legge di azione di massa, il DNA che presenta
maggiormente una sequenza vi si legherà di più.

Strumentazione ArrayCGH
Le sonde sono disposte a griglia su supporti solidi, siano essi vetrini o chip, e ogni casella
prende il nome di feature. Questo è il vantaggio principale dell’array: invece che essere
limitati a cinque fluorocromi, in questo caso possiamo ottenere una risposta binaria da ogni
feature, arrivando anche a numeri come mezzo milione di ibridazioni contemporaneamente.

Interpretazione dei dati di ArrayCGH

I risultati vengono espressi come il logaritmo in base 2 del rapporto tra controllo e paziente
(log operator): 0 è uguale, -1 è una d’elezione, +1 è una duplicazione. I dati sono
quantitativi: -2 è una d’elezione in omozigosi e +2 è una quadruplicazione.

Il chiaro vantaggio sulla FISH, oltre alla solita storia sugli esperimenti simultanei, è la
risoluzione: usando sonde così piccole è impossibile che ci sia ibridazione anche se c’è una
microdelezione o una microduplicazione.

Risoluzione dell’ArrayCGH
Oggi si può impiegare l’array per effettuare un cariotipo molecolare. Esistono diverse
risoluzioni disponibili, dalle 60000 sonde al milione di sonde; la scelta è ovviamente dettata
da motivi economici. Con l’aumentare del dumero di sonde diminuisce la distranza tra
sonde.

Vantaggi e svantaggi
Vantaggi: possibilità di esaminare accuratamente dimensione e posizione di una delezione o
duplicazione, possibilità di studio molecolare dell’intero genoma, velocità e elevata
sernsibilità e accuratezza.

Svantaggi: Non rileva le poliploidie — per definizione gli esperimenti vengono fatti con
quantità uguali di DNA controllo e paziente —, non rileva le traslocazioni bilanciate, costa
una un rene, e ha limitata abilità di esame per i mosaicismi sotto al 30%.

Copy number variation

Qualsiasi variazione di numero di copie maggiore di una chilobase rispetto ad uno. o più
DNA di controllo.
Solitamente hanno carattere polimorfico.

Applicazioni e usi di ArrayCGH

Diagnosi pre/postnatale, sequenziamento tumori.

Indicazioni: quadri sindromici, ritardo mentale o psicomotorio, riscontro di malformazioni

prenatali, ritardo di accrescimento.

Geni OMIM
Geni coinvolti in numerose patologie ma incorrelabili a quadri sindromici definiti per
mancanza di dati. La definizione di informazione fine a se stessa.

SNP-array
Gli SNP sono variazioni di un nucleotide in una posizione precisa posseduti da più dell’1% di
una popolazione. Solitamente non hanno carattere patologico ma a volte sì. Possono essere
genici, sinonimi, o cadere in regioni non codificanti.

Il SNP-array è un array in cui le sonde sono specifiche per determinati polimorfismi che si
vogliono studiare. Si interpreta esattamente come un ArrayCGH.

Vantaggi di SNP-array
I vantaggi girano tutti intorno al fatto che conoscendo a priori la posizione di certi
polimorfismi posso identificare l’origine genitoriale e l’ “identità” di un cromosoma, quindi
posso indagare poliploidie, disomie uniparentali, e mosaicismi al di sotto del 30%;
ovviamente rimango legato all’esame di SNP noti.

LEZIONE 4

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Serve ad amplificare il genoma.
Occorrente: DNA stampo (duh), due primer oligonucleotidici (uno anterogrado ed uno
retrogrado) che devono avere una lunghezza tale da permettere una buona specificità per il
segmento da amplificare, i quattro nucleotidi trifosfato, ed un buffer adeguato.

Procedimento:

1) Denaturazione: si porta la miscela a 95°C per aprire la doppia elica

2) Annealing: si abbassa la temperatura per permettere l’appaiamento del primer al
filamento singolo. Ogni primer ha una propria specifica temperatura di annealing.
3) Replicazione: la temperatura viene alzata nuovamente, sui 75°C, in maniera tale che la
polimerasi termostabile possa formare i doppi filamenti dell’amplicone.

Il procedimento avviene a cicli in un ciclatore automatico: non si fa una sola volt ma va

ripetuta. Ovviamente la crescita è esponenziale con base 2.

Vantaggi: è una tecnica robusta, in quanto permette di amplificare anche piccole quantità di
partenza; rapidità; sensibilità.

Svantaggi: si possono amplificare solo sequenze note; il materiale si consuma e quindi dopo
un numero finito di cicli la crescita va incontro a plateau; la polimerasi non è in grado di fare
proofreading (la polimerasi manca di attività esonucleasica) e quindi tende ad accumulare
mutazioni artefattuali che possono essere confuse con mutazioni vere e proprie; la
lunghezza del amplicone è limitata, attorno alle 5÷10 chilobasi.

Elettroforesi
Si fa fondamentalmente per vedere cosa sia successo durante l’amplificazione.

Si prepara una piastra di gel di agarosio (diverso da quello che usano i microbiologi) con dei
pozzetti e si inserisconi i prototti della PCR da analizzare, assieme a delle catene di
lunghezza nota e due materiali di controllo (positivo e negativo). La tecnica si basa sul fatto
che gli acidi nucleici sono carichi negativamente e quindi migrano in un campo elettrico con
velocità inversamente proporzionale al loro peso molecolare. Le bande si colorano con etidio
bromuro.

Normalmente ci si aspetta che l’amplificazione di un gene restituisca una banda sola. Nel
caso di una delezione si potrebbe vedere o una banda con minor peso molecolare — se
omozigote —, oppure due bande — se la delezione è eterozigote —. In questo caso si può
ripetere l’esperimento con due coppie di primer, una a monte ed una a valle del gene di
interesse.

Finita la PCR si può tagliare la colonna e sciogliere il gel per riestrarre il DNA.

Digestione con enzimi di restrizione (RFLP)

Gli enzimi di restrizioni sono enzimi batterici che riconoscono brevi sequenze nucleotidiche
(4÷8 nucleotidi) e tagliano in corrispondenza di esse ad ogni loro riscontro, es. se l’enzima di
restrizione riconosge GATTA, la sequenza:

GATTACAGTGACAAATAGGTTACAACAGTGATTAGATTACAATTAGAATACACCAGATGATT
ACATTAGATAGATAATAT

attaccata dagli enzimi di restrizione restituirà tre frammenti distinti.

Sapendo che un determinato enzima di restrizione taglia il gene wild-tyoe in n frammenti,

possiamo sottoporre allo stesso esperimento una sequenza mutata e vedere se viene
tagliata in un numero diverso di frammenti; possiamo poi attribuire ad ogni mutazione un
preciso profilo elettroforetico (es. emoglobina con CvnI dà quattro frammenti se wild-type e
tre frammenti se HbS, anemia falciforme).

Amplificazione allele-specifica (ARMS)

Fondamentalmente si tratta di tre esperimenti di PCR. Si usano tre primer e due provette: un
primer è complementare allo stampo in entrambe le reazioni, uno è complementare all’allele
wild-type, e uno è comlementare all’allele mutato. Ovviamente verrà amplificato solo quanto
presente. Le sonde vengono progettate perché il loro primo nucleotide di attacco sia quello
responsabile della mutazione, in maniera tale che se la mutazione non ci fosse il frammento
non venga amplificato.

Segue separazione su agarosio. È fondamentalmente la tecnica che si usa per fare diagnosi
di FC.

Ibridazione allele-specifica (ASO)

Si prende un amplificato a singolo filamento e lo si ibrida con una sonda oligonucleotidica
con alta sensibilità al mismatch per singolo nucleotide: permette di individuare mutazioni
puntiformi, dal momento che si ha amplificazione solamente con un appaiamento del 100%.

Si esegue in dot blot o reverse dot blot (quindi non elettroforesi).

-Dot blot: su filtro faccio reagire l’amplificato con una sonda marcata; funziona esattamente
come una FISH.
-Reverse dot blot: sta al dot blot come l’ArrayCGH sta alla FISH (pozzetti e DNA del pz.
marcato)

Real-time PCR
Anche detta PCR quantitativa, si basa sulla cinetica dell’amplificazione, che vede una fase
esponenziale, una lineare, e una di plateau.
L’unica aggiunta alla PCR normale sono le sonde fluorescenti.

qPCR con sonda fluorescente SYBR green

La molecola di colorante va a intercalarsi al DNA con ogni replicazione -> con ogni ciclo
aumenta quantitativamente la fluorescenza proporzionalmente a quanto materiale è stato
amplificato -> permette di calcolare quanto materiale ci fosse in partenza.

qPCR con TaqMan

In questo caso la sonda non è intercalante ma oligonucleotidica e in grado di ibridare con la
sequenza bersaglio, con un reporter e un quencher alle estremità opposte (reporter è un
fluorocromo che emette, quencher assorbe -> se sono vicini al netto non c’è fluorescenza).
Ad ogni ciclo di amplificazione la sonda viene scalzata e rotta dall’azione esonucleasica
della polimerasi, quindi Q e R si allontanano -> aumenta la fluorescenza ad ogni ciclo di
replicazione.

Mutation detection assay

zero voglia, guarda poi

LEZIONE 5

Droplet digital PCR

Esiste. Permette di quantificare la quantità di molecole di campione senza usare gold
standard ed è molto più sensibile della qPCR.

Single-strand conformation polymorphism

Amplifichiamo dei geni: se li mettiamo colì su gel di agarosio gli alleli migrano assieme per
PM; se invece prima li denaturiamo e poi abbassiamo la temperatura di colpo i filamenti si
appaierano con se stessi (si fanno su) e migreranno , in gel denaturante come acrilamide, in
mande separate a causa della diversa conformazione (o meglio, probabilmente in base al
fatto che sono molecole diverse).

Permette di dire che c’è una mutazione ma non di dire che mutazione ci sia.

Sequenziamento Sanger
Si parte amplificando il gene che ci interessa. Si allestiscono poi quattro esperimenti PCR
con l’aggiunta di un ddNTP, nucleotide senza un gruppo idrossilico che funge da terminatore
di catena, es. ddA.

Si fa andare ogni PCR come una PCR normale, e poi le si mette in elettroforesi: ogni
esperimento restituirà catene di lunghezza casuale che termineranno con il ddNTP
dell’esperimento; tramite il bandeggio è poi possibile risalire alla sequenza.

In realtà quello della prof. è il Sanger automatizzato, in cui si usano ddNTP con un
fluorocromo e il computer legge l’elettroforegramma. Il Sanger puro ha una resa di ~200
basi, l’automatizzato arriva a 800÷1000. Nel caso di frame-shift si vedono tanti picchi
sovrapposti perché a un allele manca una base.

Difetto abba importante: non è una metodica quantitativa, quindi es. in caso di delezione va
a mimare una banale condizione di omozigosi.

Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

Si usa una coppia di sonde oligonucleotidiche che ibridano una sequenza a monte della
regione di interesse ed una che ibrida una sequenza a valle, poi interviene una ligasi a unirle
dandomi tutta la sequenza di interesse. Si fa poi la PCR sulle sonde ibridate. Si può lavorare
anche in multiplex, quindi posso usare più coppie di sonde.

Sull’elettroforegramma vedrò variazione di picchi in caso di duplicazione o delezione, es. di

un singolo esone. Conoscendo la sequenza stuffer attaccata al primer posso capire che
esone sto guardando.

In teoria questa cosa si può fare anche con l’array, ma devo aver disegnato una sonda
specifica per la sequenza; in questo caso tappo anche i buchi.

Sequenziamento di nuova generazione, ad alto parallelismo

Molte molecole sono sequenziate contemporaneamente, quindi volendo si può fare tutto il
genoma in una volta sola. Le più usate sono Torrent e Illumiuna. Come funzionano me ne
sbatto il topocazzo, al massimo sono nei quiz.

LEZIONE 6

Discriminante casi d’uso Sanger/NGS

Fondamentalmente il Sanger conviene in tutte quelle situazioni in cui le regioni da analizzare
sono piccole e poco numerose. Per tutto il resto è meglio l’NGS.

Targeted sequencing
Vado a sequenziare determinate regioni di interesse, es. in pz. con CM dilatativa a 30 aa,
che decido io (pannello). Si usano tecniche dci NGS.

Esistono due modalità per selezionare le sequenze: amplicon-based assay (faccio la PCR
sulle sequenze di interesse e poi sequenzio la roba amplificata), e selezione per cattura
(verso ilDNA su biglie son sonde oligonucleotidiche, sulle quali ibrida; sciacquo, tolgo le
biglie, il DNA è pronto per essere sequenziato).

Pannelli
Svantaggi dei pannelli: sensibilità relativamente bassa (geni A, B, e C causano la patologia
X, ma il pannello per X cerca soltanto A e B) e incapacità di fornire informazioni che vadano
oltre il quesito diagnostico. Ques’tulotimo svantaggio è in realtà una cosa che ci va più che
bene da un punto di vista etico.

Approccio genomico-esomico
Permette l’inquadramento diagnostico di patologie genetiche complesse e l’individuazione di
alleli patogenetici in malattie mendeliane classiche (faccio l’esoma al soggetto con fenotipo e
ai genitori, studio la trasmissione; ci sono un po’ di magagne con la questione della
penetranza ma vbb). L’esoma è il sequenziamento delle sole regioni codificanti.
Si può anche codificare l’RNA, ma è una roba che fanno solo i ricercatori.

NGS e tumori solidi

Devo tenere conto di sensibilità, eterogeneità genica, e carico genetico totale (numero di
mutazioni). Nel tumore il processo di evoluzione darwiniana è esasperato: possono essere
quindi presenti numerose mutazioni determinanti diverse risposte terapeutiche. A questo
proposito bisogna servirsi di tecniche di sequenziamento profondo, dal momento che
l’esigenza è unica: devo poter vedere quanta più informazione possibile con la maggiore
risoluzione possibile (concetti solitamente antitetici).

LEZIONE 6-bis

Classificazione dei test genetici

Test diagnostici, identificazione di portatori sani (più frequenti: FC, cariotipo, fattori della
coagulazione), presintomatici (es. corea di Huntington), farmacogenetica, e predittivi di
suscettibilità (patologie a penetranza incompleta).

Test per la fibrosi cistica

Distinguiamo tra il test diagnostico e quello per i portatori sani. Quest’ultimo viene richiesto
in sede di procreazione medicamente assistita, unioni tra consanguinei, e nel caso nella
coppia ci sia oligo-/aspermia con agenesia dei dotti deferenti (fattore predittivo per alcune
mutazioni di FC). Vengono cercate le mutazioni più comuni.

Test genetici come screening

No. Un test di screening deve essere poco costoso (che ridere), molto sensibile (che ridere),
e deve essere applicabile ad una porzione importante della popolazione (che ridere).

Malattie comuni multifattoriali

Le malattie mendeliane sono rare e la loro trasmissibilità è chiara, dal momento che sono
monogeniche.
Cose come DM1. DM2, Alzheimer, AR e palle varie sono invece patologie comuni, al quale
esordio concorrono un numero consistente di geni e di fattori ambientali.
[Fondamentalmente la penetranza è più bassa]

Modello di Falconer: il soggetto con predisposizione genetica ha un rischio maggiore del

soggetto senza predisposizione di sviluppare la malattia a parità di esposizione ambientale. I
parenti del soggetto hanno una probabiità gaussiana attorno al soggetto stesso.

Epidemiologia
Esiste una relazione intuitiva tra penetranza, gravità del fenotipo, e frequenza della
patologia. Solitamente le comuni sono poco penetranti e poco gravi, dal momento che non
vengono selezionate negativamente come le mendeliane.

Studi caso-controllo
Si prende un gruppo di malati e un gruppo di controllo, poi gli si sequenzia il genoma: lo
scopo è vedere se nei malati c’è una mutazione o uno SNP più prequente che nel controllo.

Si usa l’odds ratio, che restituisce la forza dell’associazione (sebbene non necessariamente
la causalità): se >3,5 posso iniziare a considerarlo, x’ la mutazione è 3,5 volte più comune
nei malati.

Esempio: predisposizione alla trombosi

Oltre alle solite minchiate, spiccano due mutazioni che aumentano notevolmente il rischio di
trombosi: fattore V della coagulazione — 5% della popolazione generale, rischio quintuplo
rispetto a PG; sovrebbe essere richiesto per trombosi giovanile ricorrente ma spesso viene
richiesto per poliabortività something something trombi placentari —, e fattore II — aumenta il
rischio di 2÷4 volte, posseduto dal 3% della popolazione —.

Esempio: Celiachia
DQ2 e DQ8 (eterodimeri di HLA2 credo). Viene fatto in quei casi in cui è impossibile fare la
biopsia. I realtà la diagnosi di celiachia è clinica perché il test ha un ottimo VPN ma un
pessimo VPP.

Test per lo studio della variabilità interindividuale

Confrontano una serie di regioni polimorfiche per stabilire una traccia biologica tra due
persone (?), che si tratti di paternità, discendenza ancestrale, o studio pre-trapianto del
donatore poco cambia.

Sviluppo del test genetico

1) Stabilisco l’associazione tra una mutazione e una patologia

2) Appuro che il test sia adeguato alla rilevazione della mutazione
3) Indago circa l’utilità clinica che il test può avere (associati più che altro a problemi di
sensibilità)

LEZIONE 7

Oncogeni
Le mutazioni a livello degli oncogeni sono da gain of function, sia quantitativo che
qualitativo; trasmissione dominante. Sono relativamente rare in quanto la maggior parte
delle mutazioni sugli oncogeni sono incompatibili con la vita. Non provocano la tumorigenesi
ma predispongono e basta.
Esempi: MET (carcinoma renale ereditario), CDK4 (melanoma familiare), RET (MEN).

Oncosoppressori
Sono la classe più coinvolta nella genesi di tumori, e la loro trasmissione è recessiva (loss of
function): devono essere mutati entrambi gli alleli. Oltre ai classici gatekeeper (Rb, p53,
APC), sono oncogeni anche i caretaker, responsabilili della riparazione del DNA.

La tumorigenesi può iniziare o perché in condizioni di eterozigosi di un gatekeeper muta

anche l’altro allele causando una perdita di funzione definitiva, o la mutazione omozigote di
un caretaker causa inbstabilità genica che a sua volta comporta la mutazione dei gatekeeper
(le due vie convergono).

In generale le mutazioni germinali (quelle della predisposizione) sono di oncosoppressori e

quelle sporadiche di oncogeni.
Mutazioni somatiche e germinali
Il 90% dei geni tumorali è mutato a livello somatico, mentre il 10% a livello germinale. Le due
condizioni non sono necessariamente mutualmente esclusive.

In generale le mutazioni che si trovano a livello germinale sono le stesse riscontrabili a livello
somatico, ma non è sempre così: esempio pratico è la mutazione di BRCA1 e 2,
frequentissima in k mammella nei soggetti con questo tipo di predisposizione ma
relativamente rara in tumori sporadici.

Predisposizione genetica
L’ipotesi di Knudson spiega il motivo per cui chi ha predisposizione genica sviluppa tumori
più precocemente e spesso li sviluppa multifocali usando il simpatico retinoblastoma: nella
forma sporadica Rb deve mutare su entrambi gli alleli, mentre nella forma familiare un allele
è già mutato costitutivamente.

Questo concetto stravolge un po’ quello di trasmissione recessiva: in realtà lo è a livello

molecolare, ma la predisposizione è a trasmissione dominante.

Penetranza delle alterazioni genetiche in base alla prevalenza

Tendenzialmente bisogna valutare i casi in famiglia e costruire un albero genealogico.
Esistono tumori sporadici talmente frequenti che possono presentarsi più volte all’interno di
una famiglia pur non sussistendo familiarità; è altresì vero che alcuni tumori ereditari hanno
una penetranza abbastanza bassa da non manifestarsi in tutti i soggetti portatori.

I tumori ereditari costituiscono il 5÷10% delle patologie oncologiche. I test genetici sono
concentrati su quelli ereditari, e non quelli familiari (non sempre genetici, potrebbe benissimo
trattarsi anche di aggregazione dovuta a fattori ambientali) o sporadici.

Quando sospettare una forma ereditaria

Assenza di altri fattori di rischio, tumori in parenti stretti correlati allo stesso gene di quello
del paziente, trasmissione che mima un’autosomica dominante, età d’insorgenza
epidemiologicamente atipica (es. pz. 25 aa k mammella con zia k mammella a 35 aa).

Tumori a bassa incidenza nella popolazione generale

Talmente rari che spesso anche se familiari si mascherano come sporadici. Possono essere
tumori frequenti ma con caratteristiche rare (es. k mammella in uomo) oppure veri e prorpi
tumori rari, es. ovaio, tiroide, o retinoblastoma.
Nel caso del retinoblastoma, un caso sporadico bilaterale è dovuto quasi al 100% a
mutazione di Rb.

BRCA e tumori
Sia k mammella, sia k ovaio sono ereditari nel 10% dei casi. La causa è costituita dalle
mutazioni sui geni BRCA1 e BRCA2, coinvolti nell’homologous gene repair (meccanismo di
correzione di errori di trascrizione su entrambi i filamenti che prevede la copia della
sequenza errata dall’altro allele); BRCA non è l’unica causa di k mammella/ovaio ereditaria:
il referto si dice non informativo e non negativo.

1 e 2 sono abbastanza simili, in quanto entrambi danno rischio del 70% di sviluppare k
mammella durante la vita (se donna: uomo sale a 10% da 1/1000) e aumentato rischio di
sviluppare un secondio k mammella controlaterale. Cambia il rischio di k ovaio, del 40% in
BRCA1 e del 20% in BRCA2.

Indicazioni e ricerca
Si ricerca BRCA nel caso di pz. giovani, con tumori bilaterali, tumori dell’ovaio, istotipi come
triplo negativo sotto ai 60 aa., uomini con k mammella; esistono programmi di screening per
gente con almeno due parenti di primo grado con k mammella sotto i 50    o un k mammella
sotto i 50 e k ovaio a qualsiasi età. Sulla linea paterna si indagano anche i parenti di
secondo grado perché gli uomini sono poco informativi.

PARP inibitori
Crafty little things. Le PARP sono proteine addette alla riparazione del danno su singolo
filamento: inibendole induco un danno su singolo filamento che, se BRCA è difettoso, si
traduce in un danno a doppio filamento. Con l’accumulo di questi danni la cellula con BRCA
mutato — e solo la cellula con BRCA mutato — va in apoptosi. Sono molto meglio tollerati
della chemioterapia e vengono offerti a prescindere dall’età in caso di BRCA mutato.

Gestione del pz. BRCA-mutato

I casi sono due: o follow-up ravvicinati, con RM mammella, CA125, e eco transvaginale
(anche se il k ovaio per localizzazione diffonde subito) al fine di fare diagnosi precoce di
un’eventuale recidiva, o chirurgia profilattica come mastectomia e ovaio-annessiectomia (le
linee guida consigliano quest’ultima a partire dai 25 aa.). La mastectomia abbassa il rischio
del 95% (la ghiandola mammaria è complessa e ramificata, spesso del tessuto ghiandolare
viene risparmiato); per l’ovariectomia si cerca di venderla un po’ meglio.

Altri geni coinvolti nella predisposizione ai tumori

p53, PTEN, CDH; ATM e CEP danno un aumento di rischio più contenuto.

LEZIONE 8

Emocromatosi
Malattia ereditaria dovuta all’accumulo di ferro. Essendo un metallo di transizione il bastardo
cambia statI di ossidazione come se fossero calzini e crea ROS danneggiando componenti
cellulari e DNA. L’accumulo patologico di ferro causa danni epatici (cirrosi, poi HCC),
pancreatico (tipicamente diabete), cardiocircolatorio (cardiopatia prima restrittiva poi
dilatativa), ipofisario, e articolare.

Compartimenti del ferro

Tre compartimenti: funzionale (principalmente midollo osseo), di trasporto (trasferrina, con
recettori ubiquitari ma spt. cellule eritroidi), e di deposito (spt. fegato e milza; la ferritina tiene
il ferro in deposito in forma non libera).

Epcidina
Ormone peptidico di sintesi epatica che inibisce l’esportazione di ferro dall’enterocita nel
torrente ematico: il suo recettore è la ferroportina, unico trasportatore del ferro noto. Quando
l’epcidina si lega alla ferroportina quest’ultima viene internalizzata e ubiquitinata.

Proteine coinvolte nella via epcidina-ferroportina

Esistono due sistemi di regolazione: ferro circolante (trasferrina satura -> TFR1 -> HFE ->
HJV -> roba), e ferro tissutale (cellule endoteliali del sinusoide producono BMP2 e BMP6 ->
BMPR -> HJV -> roba). Entra in gioco anche il sistema eritropoietico con HIF.

Tipi di emocromatosi

1) Difetto di HFE. Più comune, clinicamente variabile, tendenzialmente poco grave.

2) Difetto di HAMP (gene dell’epicidina, 2b) e gene codificante per HJV (2a). Morte per
insufficienza cardiaca, molto grave nella forma HJV. Forma giovanile.
3)Difetto di TFR2. Intermedia come gravità ad 1 e 2a.
4)Difetto del gene codificante per la ferroportina
Questo è fondamentalmente il concetto di eterogeneicita di locus.

Emocromatosi HFE (1)

Autosomica recessiva, relativamente comune con gradiente nord/sud (1%!). La mutazione è
fondamentalmente sempre la sostituzione di una cisteina specifica (C282Y), altriment H63D
che però è un polimorfismo (25% della gente in eterozigosi).

HFE e HLA
HFE e HLA sono simili, tanto che sono vicini nel genoma e si pensa HFE sia un’evoluzione
in altro senso di HLA. Anche epicidina originariamente era una difensina. Il motivo per cui
l’epicidina aumenta durante un’infezione è che la capacità di un microorganismo di acquisire
ferro è un carattere di virulenza.

Emocromatosi SCLC401 (4)

[PROCRASTINATA/SALTATA]

LEZIONE 10

Tumori del colon

Come per tutti i tumori sono più frequenti le forme sporadiche. I tumori ereditari del colon
sono distinti in poliposi (es. FAP per gli adenomatosi e poliposi familiare giovanile per gli
amortomatosi) e non poliposi (es. HNPCC o sindrome di Lynch chedirsivoglia).

Poliposi adenomatosa famigliare (FAP)

Presenza di >100 polipi adenomatosi alla colonscopia. Solitamente questi vengono
sviluppati prima dei 35 anni e l’età mediana di insorgenza del tumore è 39 anni; il rischio
relativo di sviluppare il tumore è del 100% in caso di FAP. Si tratta con colectomia radicale.
La mutazione più frequente è APC, classico oncosoppressore gatekeeper. Esistono anche
manifestazioni extracoliche maligne e benigne che però vengono raramente ricercate.

AFAP
Forma attenuata di FAP causata da una mutazione meno aggressiva di APC, con meno di
cento polipi (si inizia a sospettare col riscontro di 15÷20 polipi alla colonscopia). L’età
mediana di insorgenza del tumore è posticipata attorno ai 50 anni.

Sindrome di Lynch
Forma più comune di k colon ereditario non poliposo. Consiste nell’insorgenza di
adenocarcinomi con istologia suggestiva (mucinosi, infiltrato linfocitario) a livello del colon
distale. L’incidenza delle mutazioni è ~200/100000, e sono da sospettare in caso di npl
multiple o giovanili (età media di insorgenza 45 aa). Tumori lynch-correlati: endometrio,
ovaio, stomaco, pelvi renale, dotti biliari, dotti sebacei.

Il sospetto nasce se ci sono casi in famiglia di tumori in sindrome di Lynch o Lynch-correlati.

In ogni caso in AP si fa lo screening per Lynch sia per immunoistochimica, sia per ricerca di
instabilità di microsatelliti (?).

Mutazioni coinvolte
MLH1 e 2 causano assieme il 90% delle Lynch, mentre MLH6 e PMS2 sono molto più rari.
Rara è anche la delezione germinale di EPCAM, regolatore di MLH2 (MLH2 risulta inattivato
dopo questa delezione).
Eccezion fatta per EPCAM, questi sono tutti oncosoppressori deputati alla riparazione dei
microsatelliti (sequenze di qualche nucleotide disperse nel genoma); non si sa se i
microsatelliti siano patogenetici o meno ma sono la cosa che si ricerca per fare diagnosi.

Ricerca dei microsatelliti

Se gli MMR funzionano i microsatelliti vengono copiati fedelmente, altrimenti può esserci
espansione o distruzione (rispettivamente a seconda che la forcina si fomi sul DNA
neoformato o su quello di stampo). Si fa quindi una PCR (o un sequenziamento) con
amplificazione delle regioni contenenti microsatelliti sul tessuto tumorale confrontandolo con
quello sano: se le lunghezze sono diverse (max. 2) si parla di instabilità dei microsatelliti.

Immunoistochimica
Si ricercano i prodotti proteici dei geni, e il vantaggio sulla PCR è che possiamo
immediatamente capire quali geni sono coinvolti. Non necessariamente una mancata
espressione in IIC degli MMR significa essere affetti da sindrome di Lynch, potrebbe anche
trattarsi di un tumore sporadico: bisogna indagare anche il DNA del tessuto sano. Due
riscontri permettono di escludere quasi con assoluta certezza l’ereditarietà del tumore:
metilazione di MLH1 e mutazione su BRAF.

Conclusione
Si fa screening per sindrome di Lynch su tutti i k colon, approccio che si va diffondendo
anche coi k endometrio.

Se lo screening è negativo si ricercano metilazione di MLH1 e BRAF, che se risultano

negative riportano il pz. dal genetista.

Se è positivo si manda il pz. dal genetista. Può capitare che non si riesca a confermare una
condizione ereditaria dal momento che non si riesce a trovare la mutazione perché la
genetica è una barzelletta. L’approccio non è radicale come con la FAP, il rischio è più
basso; semplicemente follow-up più stretti.

Consulenza genetica oncologica

Balzata. È una roba inutile che fanno fare ai pazienti.